高表达IL-10中性粒细胞外囊泡在颞下颌骨关节炎治疗中的应用

高表达il-10中性粒细胞外囊泡在颞下颌骨关节炎治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及高表达il-10中性粒细胞外囊泡在颞下颌骨关节炎治疗中的应用。


背景技术：

2.颞下颌骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，tmj oa）是以进行性软骨退化、软骨下骨改建、滑膜炎和慢性疼痛为特征的退行性疾病，常有髁突骨质破坏，包括糜烂性吸收、硬化、磨损、骨赘形成等，引起关节的剧烈疼痛和功能障碍，严重影响患者的生活质量。机械负荷，局部炎症、软骨细胞凋亡都被认为是导致颞下颌骨关节炎的原因。关节腔灌洗、电物理治疗、关节腔注射药物、口服药物等保守治疗方式通过减轻关节疼痛、增强关节功能、延缓关节进行性破坏来达到治疗的目的。但是这些治疗策略难以修复和再生受损的颞下颌骨关节。
3.研究表明，中性粒细胞释放的微小囊泡（nev），可以累积在类风湿性关节炎患者的关节处，其可以穿透软骨，微囊泡上的抗炎膜联蛋白a1（anxn1）与其受体frp2发生相互作用，使tgf-β产生增加，引起软骨保护。然而，颞下颌骨关节炎患者瘤坏死因子-α（tnf-α）、白细胞介素-1β等促炎细胞因子异常增高，通过减轻炎症反应可以有效的干预颞下颌骨关节炎。其中，il-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，主要由抗原呈递细胞如活化的t细胞、巨噬细胞等细胞分泌，参与炎性反应和免疫反应，通过激活巨噬细胞抑制炎症细胞因子如tnf-α、il-6等促炎因子的表达，是巨噬细胞和其他抗原呈递细胞中免疫反应的主要抑制因子，具有较强的抗炎和组织再生能力。在多种炎症模型中，il-10均能显著抑制促炎因子产生，揭示其在颞下颌骨关节炎抗炎治疗中有重要的应用前景。但是，il-10在体内容易降解，影响其疗效，且药物的全身分布会产生毒副作用。因此，需要通过具有保护作用的载体将其递送至关节病灶部位。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中颞下颌骨关节炎治疗时缺乏在抑制炎症的同时又可以修复软骨的靶向药物的技术问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本技术提供了il-10 nev在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。
6.优选的，所述中性粒细胞外囊泡靶向至软骨细胞，用以促进软骨细胞的增值和迁移。
7.本技术还提供了一种il-10 nev靶向药物的制备方法，包含以下步骤：s1：获取il-10高表达的hl-60细胞；s2：将s1中获得的hl-60细胞转化为中性粒细胞；s3：收集中性粒细胞的细胞培养液，通过超速离心提取中性粒细胞外囊泡，获得
il-10 nev靶向药物。
8.优选的，所述s1中通过il-10过表达质粒转染中性粒细胞的前体细胞。
9.优选的，所述s1的具体步骤为：将hl-60细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，置于37 ℃、5％co2培养箱中培养；当细胞密度在2-4
ꢀ×ꢀ
106个/ml时，用不含fbs和抗生素的rpmi-1640培养基培养，然后用cmv-mcs sv40-neomycin il-10-gfp质粒和相关转染试剂lipofectamine3000转染hl-60细胞6-8小时。
10.优选的，所述s2具体步骤为：收集s1中的hl-60细胞，通过终浓度为1% dmso刺激诱导hl-60细胞48小时，使其转化为中性粒细胞，然后通过离心去除dmso，利用不含fbs的rpmi-1640培养基培养48小时。
11.优选的，所述s3具体步骤为：将收集到的细胞培养液在4 ℃下，分别在300 g离心10分钟，2000 g离心10分钟，10000 g离心30分钟，然后收集上清150000 g离心90分钟，获得负载il-10的中性粒细胞外囊泡，沉淀用无菌pbs（ph 7.4）重悬，-80 ℃保存。
12.与现有技术相比，本技术具有以下优点：（1）利用hl-60细胞高表达il-10，然后诱导hl-60产生中性粒细胞，得到高表达il-10的中性粒细胞外囊泡，不仅提高了il-10的稳定性，还可以使其高效的递送至颞下颌骨关节病灶，减少其在其他脏器的分布，降低毒副作用。此外，在颞下颌骨关节病灶处释放出il-10，可以抑制促炎因子产生，达到改善颞下颌骨关节炎的目的。
13.（2）中性粒细胞外囊泡不仅靶向至颞下颌骨关节部位，其本身可以作用于软骨细胞，促进软骨细胞的增殖和迁移，从而保护软骨。
14.（3）本发明提出的负载il-10中性粒细胞外囊泡的制备方法，也可以用于其他细胞因子的表达，用于治疗相关疾病。
15.（4）本发明所使用的hl-60细胞来源广泛，数量充足，增殖快速，可以规模化生产。
附图说明
16.图1为il-10 nev在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用的展示图；图2为中性粒细胞（neutrophile）的分化鉴定：分别为中性粒细胞标志物cd11b（a），cd16（b），cd66b（c）的mrna表达水平；图3为il-10 nev靶向药物的鉴定：（a）透射电镜观察nev的形貌；（b）nev的粒径分布；（c）western blot检测nev和il-10 nev中il-10的表达情况；（d）elisa试剂盒检测nev和il-10 nev中il-10蛋白水平；图4为il-10 nev靶向药物对软骨细胞炎症因子分泌的影响：elias试剂盒检测软骨细胞经il-1β，il-10，nev以及il-10 nev处理后炎症因子的表达情况，il-8 (a), il-6 (b), tnf-a (c)；图5为il-10 nev靶向药物对软骨细胞增殖和凋亡的影响：免疫荧光染色检测软骨细胞增殖相关蛋白cyclin d1（a）和cyclin e1（b）的表达水平，（c）免疫荧光染色检测软骨细胞凋亡相关蛋白（caspase3）的表达水平，（d）tunel染色检测软骨细胞凋亡情况，（e）划痕
实验检测软骨迁移增殖能力。比例尺，20 um。
17.图6为il-10 nev靶向药物体内靶向分布：saline（生理盐水），il-10，nev和il-10 nev分别在2 h，6 h，12 h和24 h时在颞颌骨关节的富集情况；图7为il-10 nev靶向药物抑制大鼠颞颌骨关节炎细胞因子的分泌的分析：免疫组化检测il-10 nev治疗后il-6和tnf-α的表达水平图8为il-10 nev靶向药物促进大鼠颞颌骨关节处软骨细胞的增殖和软骨基质的生成：（a）颞颌骨关节处软骨标记基因细胞分化和基质合成的标志物sox9，（b）软骨细胞基质合成的标志物col2a；图9为il-10 nev靶向药物治疗后效果评估：（a）micro-ct三维重建图像对颞下颌关节髁突分析，（b）il-10 nev治疗后头回缩阈值的检测；图10为il-10 nev靶向药物安全性评估：il-10 nev在各脏器中的安全性。
具体实施方式
18.以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
19.请参阅图1，高表达il-10的中性粒细胞外囊泡（il-10 nev）在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。
20.药物的作用原理：中性粒细胞外囊泡靶向至颞下颌骨关节部位，囊泡本身可以作用于软骨细胞，促进软骨细胞的增殖和迁移，引起软骨保护，在病灶释放出的il-10，可以抑制病灶的炎症反应，从而协同治疗颞颌骨关节炎。
21.本技术提供的高表达il-10的中性粒细胞外囊泡可以靶向至软骨细胞，以促进软骨细胞的增值和迁移，从而引起软骨的保护；并且，通过中性粒细胞外囊泡的靶向，使得负载在中性粒细胞外囊泡中的il-10稳定性得到了显著的提高，且其随着中性粒细胞外囊泡递送至颞下颌骨关节部位，降低了其全身分布时所产生的毒副作用。
22.本技术还提供了il-10 nev靶向药物的制备方法，包含以下步骤：s1：获取il-10高表达的hl-60细胞；在一实施方式中，通过il-10过表达质粒转染中性粒细胞的前体细胞（人早幼粒白血病细胞hl-60）；具体的：将hl-60细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，置于37 ℃、5％co2培养箱中培养。
23.当细胞密度在2-4
ꢀ×ꢀ
106个/ml时，用不含fbs和抗生素的rpmi-1640培养基培养，然后用cmv-mcs sv40-neomycin il-10-gfp质粒和相关转染试剂lipofectamine3000转染hl-60细胞6-8小时；s2：将hl-60细胞转化为中性粒细胞；具体的，在一实施方式中，收集s1中的hl-60细胞，通过终浓度为1%二甲基亚砜（dmso）刺激诱导hl-60细胞48小时，使其转化为中性粒细胞，然后通过离心去除dmso，利用不含fbs的rpmi-1640培养基培养48小时；s3：收集s2中的中性粒细胞的细胞培养液，通过超速离心提取中性粒细胞外囊泡，从而获得il-10 nev靶向药物。
24.具体的，在一实施方式中，将收集到的细胞培养液在4 ℃下，分别在300 g离心10分钟，2000 g离心10分钟，10000 g离心30分钟，然后收集上清150000 g离心90分钟，获得负载il-10的中性粒细胞外囊泡，沉淀用无菌pbs（ph 7.4）重悬，-80 ℃保存。
25.以下结合具体实施例对上述内容进行阐述：实施例1：il-10 nev靶向药物的制备与鉴定1、il-10 nev靶向药物的制备：体外培养hl-60细胞（购自中国科学院细胞库），培养基为含10％胎牛血清（美国gibco）的rpmi-1640培养基（美国gibco）。
26.当细胞密度达到2-4
ꢀ×ꢀ
106个/ml时，用ph为7.4的pbs（美国gibco）洗涤两次，然后用lipofectamine 3000（美国invitrogen）将cmv-mcs sv40-neomycin il-10-gfp质粒（中国吉凯基因）转染到hl-60细胞中。转染2
ꢀ×ꢀ
106个hl-60细胞需加入200 pmol cmv-mcs sv40-neomycin il-10-gfp质粒和10 μl lipofectamine 3000。
27.转染8小时后用ph为7.4的pbs清洗细胞两次，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基培养48小时。
28.通过终浓度为1%dmso刺激48小时，使其转化为中性粒细胞（通过rt-pcr检测中性粒细胞标志物cd11b，cd16，cd66b的mrna表达水平，如图2a-c所示）。然后通过离心去除dmso，利用不含fbs的rpmi-1640培养基培养48小时。
29.收集细胞培养液，在4 ℃，300 g的转速下离心10分钟，去除残留细胞。
30.随后，收集上清液在4 ℃，2000 g离心10 min，10000 g离心30 min，去除细胞碎片。最后在4 ℃下以150000 g转速离心90 min，获得沉淀为il-10 nev，用无菌pbs（ph 7.4）重悬，-80℃保存。
31.2、nev靶向药物的鉴定：a：形貌检测：通过透射电子显微镜（飞利浦/fei公司）观察nev的形态。吸取10 μl均匀分布的nev，滴到铜网上（150目，ted pella, inc）,室温干燥后，用含0.7 m草酸盐的2%醋酸铀酰（赛默飞）（ph 7.0）对进行负染，干燥后进行透射电镜成像拍照。结果如图3a所示，为典型的双层膜结构，符合囊泡的特征。
32.b：粒径分析用纳米颗粒跟踪分析仪（nta, particle metrix, gmbh, ammersee, germany）分析上述il-10 nev，吸取1 μl，用pbs稀释至1 ml，然后用1 ml注射器把样品打入样品池，上机分析，所获得的il-10 nev粒径在50
ꢀ‑ꢀ
200 nm之间，结果如图3b所示。
33.3、nev中il-10的测定：首先通过western blot检测nev中的il-10，如图3c所示，转染质粒后的nev可以检测到il-10的条带，接着通过elisa试剂盒（联科生物）检测nev中的il-10，取相同量的nev和il-10 nev，用ripa裂解液裂解后进行浓度测定，如图3d所示，转染质粒后nev中il-10的含量显著提高。
34.通过本实施例的验证说明，本技术所制备的il-10 nev具备细胞外囊泡的特征，并且提供了一种高效的il-10负载至nev中的制备方法。
35.实施例2：il-10 nev靶向药物对软骨细胞的影响
il-10 nev抑制软骨细胞炎症因子的分泌向1
×
106软骨细胞中加入1
×
105个il-10 nev，培养48小时后，收集细胞上清，通过elisa试剂盒（晶美生物）检测il-8，il-6以及tnf-a的表达水平。
36.结果如图4a-c所示，il-1β刺激软骨细胞后，il-8，il-6和tnf-a的表达水平显著提高，加入il-10 nev后，il-8，il-6和tnf-a的表达水平得到显著抑制，证明il-10 nev可以抑制炎症因子的分泌。
37.il-10 nev靶向药物促进软骨细胞的增殖及迁移a、il-10 nev靶向药物促进软骨细胞的增殖：将1
×
105个软骨细胞接种于24孔板，除了对照组外，其他组用il-1β刺激24小时后，分别加入il-10，nev和il-10 nev（1
×
104个）培养24小时，然后进行固定、通透，封片，过夜孵育一抗anti-cyclin d1（abcam）、anti-cyclin e1（abcam），anti-caspase3（abcam），接着孵育羊抗兔igg h&l（alexa fluor
®
647）二抗（abcam），在37℃孵育1小时，最后用荧光显微镜（奥林巴斯）进行观察。
38.如图5a-c所示，il-1β处理后，软骨细胞的增殖受到抑制，而il-10 nev组软骨细胞增殖相关蛋白cyclin d1和cyclin e1（b）的表达水平显著增加，软骨细胞凋亡相关蛋白（caspase3）的表达显著下降。此外，处理后的24孔板加入tunel反应混合物（诺唯赞）在37℃下孵育1小时，然后用荧光显微镜观察，如图5d所示，证明il-10 nev能够抑制软骨细胞的凋亡。
39.b、il-10 nev靶向药物促进软骨细胞的迁移：将1
×
106个软骨细胞接种于6孔板，细胞融合达到90%，用200 μl枪头作线性划痕。将刮伤的细胞洗去并添加无血清培养基，然后在37
ꢀ°
c和5%co2的培养箱中培养。随机选取3-5个点的宽度，记录12小时后划痕闭合距离，然后利用倒置显微镜进行观察。
40.如图5e所示，il-1β处理后，软骨细胞恢复相对较慢，说明炎症抑制了软骨细胞的迁移和修复，而il-10 nev组划痕愈合速度最快，表明il-10 nev靶向药物可以逆转炎症微环境下软骨细胞凋亡，促进软骨细胞增殖与迁移。
41.本实施例结果说明，本发明所制备的il-10 nev靶向药物可以逆转炎症微环境下软骨细胞凋亡，促进软骨细胞增殖与迁移。
42.实施例3：il-10 nev靶向药物在大鼠颞下颌骨关节中的靶向性il-10 nev靶向药物在大鼠颞下颌骨关节炎的分布：首先需构建tmj oa模型，选用10周龄雄性sprague dawley（sd）大鼠，吸入1%异氟醚，全身麻醉。剃除左颞下颌关节区域的毛发，将其仰卧放置在垫上。用33g 100 μl微注射器在大鼠颞下颌关节上间隙注射5 mg/ml的完全弗氏佐剂（cfa，chondrex）100 μl，每2周注射一次，注射4周后成功构建tmj oa模型。然后将sd大鼠分成四组，分别通过尾静脉注射saline（生理盐水），il-10，nev和il-10 nev（5 μg/ml, 200 μl），然后收集其2 h，6 h，12 h和24 h时在颞颌骨关节的富集情况。
43.如图6所示，在2 h时，可见大量的il-10 nev在颞下颌骨关节炎病灶部位富集。
44.本实施例结果说明，本发明所制备的il-10 nev靶向药物可以靶向至颞下颌骨关节炎部位。
45.实施例4：il-10 nev靶向药物在大鼠颞下颌骨关节炎的的治疗作用
（1）il-10 nev抑制大鼠颞下颌骨关节炎病灶处炎症因子的分泌：通过尾静脉向tmj oa大鼠注射il-10 nev靶向药物，一周后然后安乐死大鼠。将颞下颌关节用4%多聚甲醛固定24 h，脱钙4周后石蜡包埋。在矢状面上切开颞下颌关节髁突，厚度为4 μm，0.5% triton x-100通透组织切片，抗原修复后，用5%山羊血清封片，过夜孵育一抗anti-il-6（abcam）和anti-tnf-α（abcam），然后将组织切片与山羊f（ab'）2抗兔igg f（ab'）2（hrp）二抗（abcam）孵育，显色后，用正置显微镜（奥林巴斯，日本）观察免疫组化图像。
46.如图7所示，il-10 nev靶向药物可有效降低炎症因子il-6和tnf-α的表达水平。
47.（2）il-10 nev靶向药物促进大鼠颞下颌骨关节炎处软骨细胞的增殖和软骨基质的生成：将上述实例4，（1）中的切片，在通透、抗原修复和封闭后，用anti-sox9（abcam）和anti-col2a（abcam）一抗过夜孵育，然后在37℃孵育羊抗兔igg h&l（alexa fluor
®
647）二抗（abcam）1小时，最后用荧光显微镜（奥林巴斯）进行观察。
48.由图8可见，il-10 nev靶向药物能够有效的促进颞下颌骨关节处软骨标记基因细胞分化和基质合成的标志物sox9、col2a的表达。
49.（3）il-10 nev靶向药物促进大鼠颞下颌骨关节炎处软骨修复，缓解疼痛：用4%多聚甲醛固定鼠颞下颌关节髁突，采用microct（μct 40; scanco，苏黎世，瑞士）对关节头部分，包括软骨和软骨下骨进行扫描。使用mimics软件传输、分割和重建dicom三维图像（materialise nv，勒芬，比利时）。
50.由图9a所示，三维重建图像可以反映颞下颌关节髁突表面的粗糙度，发现tmj oa组比对照组损伤更明显，而用il-10 nev治疗后，颞下颌关节软骨表面粗糙度得到很大的改善，表明il-10 nev可以促进软骨基质的形成和软骨的修复。
51.接着采用冯
·
弗雷试验来测定大鼠的疼痛体验以评估il-10 nev治疗后颞颌骨关节炎疼痛的缓解程度。使用vonfrey针灸疼痛测试试剂盒（rwd，广东，中国）刺激小鼠眼耳连接的中点。
52.实验过程中，根据实际情况选择合适粗细的尼龙丝，调整合适的延伸长度，垂直刺激皮肤。当大鼠颞下颌关节受到机械刺激时，会发生收缩反射。通过调整长度和更换尼龙丝粗细来调节刺激力，直到尼龙丝弯曲成s形。该操作每30秒重复3次，每次持续7-8秒。记录头缩回阈值和刺激强度（g）。值得注意的是，0.5秒内大鼠避头的情况不包括在实验结果中。最后取平均值作为疼痛阈值，用graphpad prism绘制柱状图。
53.如图9b所示，大鼠头部回缩阈值与炎症严重程度呈正相关，与治疗效果呈负相关。
54.（4）il-10 nev靶向药物安全性示评估：通过he染色对心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏进行安全性评估，如图10可见，未见il-10 nev对其他器官的毒副作用。
55.本实施例结果说明，本发明所制备的il-10 nev靶向药物可以有效的抑制颞下颌骨关节炎病灶处促炎因子的分泌，促进软骨细胞的增殖和软骨基质的生成，缓解疼痛，且具有良好的生物安全性。
56.本技术中所提供的高表达il-10的中性粒细胞囊泡，利用hl-60细胞高表达il-10，然后诱导hl-60产生中性粒细胞，得到高表达il-10的中性粒细胞外囊泡，不仅提高了il-10
的稳定性，还可以使其高效的递送至颞下颌骨关节病灶，减少其在其他脏器的分布，降低毒副作用。此外，在颞下颌骨关节病灶处释放出il-10，可以抑制促炎因子产生，达到改善颞下颌骨关节炎的目的。且本技术中所使用的hl-60细胞来源广泛，数量充足，增殖快速，可以规模化生产。

技术特征：
1.il-10 nev在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述中性粒细胞外囊泡靶向至软骨细胞，用以促进软骨细胞的增值和迁移。3.一种il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：s1：获取il-10高表达的hl-60细胞；s2：将s1中获得的hl-60细胞转化为中性粒细胞；s3：收集中性粒细胞的细胞培养液，通过超速离心提取中性粒细胞外囊泡，获得il-10 nev靶向药物。4.根据权利要求3所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s1中通过il-10过表达质粒转染中性粒细胞的前体细胞。5.根据权利要求4所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s1的具体步骤为：将hl-60细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，置于37 ℃、5％co2培养箱中培养；当细胞密度在2-4
ꢀ×ꢀ
106个/ml时，用不含fbs和抗生素的rpmi-1640培养基培养，然后用cmv-mcs sv40-neomycin il-10-gfp质粒和相关转染试剂lipofectamine3000转染hl-60细胞6-8小时。6.根据权利要求3所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s2具体步骤为：收集s1中的hl-60细胞，通过终浓度为1% dmso刺激诱导hl-60细胞48小时，使其转化为中性粒细胞，然后通过离心去除dmso，利用不含fbs的rpmi-1640培养基培养48小时。7.根据权利要求3所述的il-10 nev靶向药物的制备方法，其特征在于：所述s3具体步骤为：将收集到的细胞培养液在4 ℃下，分别在300 g离心10分钟，2000 g离心10分钟，10000 g离心30分钟，然后收集上清150000 g离心90分钟，获得负载il-10的中性粒细胞外囊泡，沉淀用无菌pbs（ph 7.4）重悬，-80 ℃保存。

技术总结
本发明提供高表达IL-10中性粒细胞外囊泡（IL-10 nEV）在颞下颌骨关节炎(TMG OA)治疗中的应用，涉及生物医药技术领域，本申请提供了高表达IL-10的中性粒细胞外囊泡在制备治疗颞下颌骨关节炎及软骨修复药物中的应用。本申请中利用HL-60细胞高表达IL-10，然后诱导HL-60产生中性粒细胞，得到高表达IL-10的中性粒细胞外囊泡。首先，中性粒细胞外囊泡本身可以和颞下颌骨关节病灶处软骨细胞发生相互作用，促进软骨的修复。其次，其不仅提高了IL-10的稳定性，还可以使其高效的递送至颞下颌骨关节病灶，减少其在其他脏器的分布，降低毒副作用。此外，在颞下颌骨关节病灶处释放出IL-10，可以抑制促炎因子产生，最终达到协同改善颞下颌骨关节炎的目的。节炎的目的。节炎的目的。


技术研发人员：郭悦华 冯兴梅 申娴娟 谢慧敏 钱俐 邓爱东
受保护的技术使用者：南通大学附属医院
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/7