一种HLB固相萃取-UV法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法与流程

一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法
技术领域
1.本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，具体涉及一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基总含量的方法。


背景技术：

2.蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的干燥分泌物。多于夏、秋二季捕捉蟾蜍，洗净，挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液，加工，干燥。蟾酥的化学成分十分复杂，包括蟾蜍内酯类、吲哚类生物碱、甾醇类等，其中蟾蜍内酯类是蟾酥药材非常重要的活性成分，迄今为止，已报道了蟾酥中近100种蟾蜍甾二烯类成分。其中，蟾酥中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量是评价蟾酥质量的重要指标。2020版《中国药典》中规定：按干燥品计算，含蟾毒灵(c
24h34
o4)、华蟾酥毒基(c
26h3406
)和脂蟾毒配基(c
24h32
o4)的总量不得少于7.0％。
3.近年来，随着蟾酥价格的不断上涨以及企业对蟾酥需求的持续增加，蟾酥的含量对麝香保心丸成品的质量及蟾酥的采购都至关重要。2020版《中国药典》中蟾酥的含量测定需要经过蟾酥鲜浆的加工、干燥、粉碎、提取及hplc检测分析才能得到蟾酥含量。检测方法所用时间较长，所用检测分析仪器较贵。目前没有一个可以快速检测蟾酥鲜浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基总含量的方法。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，能够快速、准确检测蟾酥鲜浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基总含量，并快速表征蟾酥药材的质量。
5.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，包括如下步骤：
6.1)将蟾酥鲜浆样品加第一溶剂溶散，再加入第二溶剂超声提取后取上清液混匀、放冷，获得提取液；
7.2)将步骤1)中获得的提取液上样至hlb固相萃取柱后采用第三溶剂清洗，再采用第四溶剂洗脱、定容，获得供试品溶液；
8.3)将华蟾酥毒基的对照品加入第二溶剂溶解并定容，获得对照品溶液；
9.4)将步骤2)中获得的供试品溶液和步骤3)中获得的对照品溶液分别采用紫外分光光度法(uv)进行测定，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。
10.本发明第二方面提供上述hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法在分析蟾酥鲜浆质量中的用途。
11.本发明第三方面提供一种蟾酥鲜浆质量的分析方法，包括如下步骤：
12.a)采用上述hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法获得供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量对应的吸光度值；
13.b)采用快速水分测定仪测定蟾酥鲜浆样品中的水分值；
14.c)将步骤a)中的吸光度值和步骤b)中的水分值代入公式(1)中计算蟾酥鲜浆样品中以干燥品计的蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量，
15.所述公式(1)为：
16.式中，a为供试品溶液的吸光度值；m为蟾酥鲜浆样品的称样量，mg；水分为采用快速水分仪测得的水分值；
17.d)将c)获得蟾酥鲜浆样品中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量与限定折干总含量值进行比较，确定蟾酥鲜浆样品的质量。
18.如上所述，本发明提供的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，具有如下有益效果：
19.(1)本发明提供的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，能够采用oasis prime hlb固相萃取小柱对蟾酥鲜浆进行纯化分离，得到蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基3个成分的混合物，样品处理方法简单、快速，有机溶剂使用少，分析速度快，样品经预处理后即可直接上样，无需活化和平衡。
20.(2)本发明提供的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，经紫外分光光度计直接检测其含量，检测结果快速、准确，检测仪器价格较低且便于携带，在蟾蜍养殖基地或蟾酥鲜浆供应商处即可实现检测含量的目的。
21.(3)本发明提供的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，通过与快速水分仪测定相结合，能够快速表征蟾酥药材的质量，全面完善蟾酥鲜浆的质量控制体系，为蟾酥鲜浆的质量控制提供了依据。
附图说明
22.图1显示为本发明的对照品及供试品的紫外吸收光谱图1a、1b，其中，图1a为对照品的紫外吸收光谱图，图1b为供试品的紫外吸收光谱图。
23.图2显示为本发明中华蟾酥毒基的线性曲线图。
具体实施方式
24.本发明第一方面提供一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，包括如下步骤：
25.1)将蟾酥鲜浆样品加第一溶剂溶散，再加入第二溶剂超声提取后取上清液混匀、放冷，获得提取液；
26.2)将步骤1)中获得的提取液上样至hlb固相萃取柱后采用第三溶剂清洗，再采用第四溶剂洗脱、定容，获得供试品溶液；
27.3)将华蟾酥毒基的对照品加入第二溶剂溶解并定容，获得对照品溶液；
28.4)将步骤2)中获得的供试品溶液和步骤3)中获得的对照品溶液分别采用紫外分
光光度法(uv)进行测定，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。
29.较佳地，步骤1)中，所述第一溶剂为无机溶剂，包括且不限于水，优选为水。
30.较佳地，步骤1)中，所述蟾酥鲜浆样品加入的质量g与第一溶剂加入的体积ml之比为0.2:5-50，具体如0.2:5-12.5、0.2:12.5-25、0.2:25-50，优选为0.2:12.5。
31.较佳地，步骤1)中，所述溶散采用涡旋进行溶解分散，所述涡旋至蟾酥鲜浆样品无结块。
32.较佳地，步骤1)中，所述第二溶剂为有机溶剂，包括且不限于甲醇、乙醇、丙酮等，优选为甲醇。
33.较佳地，步骤1)中，所述蟾酥鲜浆样品加入的质量g与第二溶剂加入的体积ml之比为0.2:5-50，具体如0.2:5-12.5、0.2:12.5-25、0.2:25-50，优选为0.2:12.5。
34.较佳地，步骤1)中，所述超声提取的时间为10-50min，具体如10-30min、30-50min，优选为30min。
35.较佳地，步骤1)中，所述超声提取后取上清液。
36.较佳地，步骤1)中，所述放冷至室温。所述室温为20-30℃。
37.较佳地，步骤2)中，所述hlb固相萃取柱为oasis prime hlb固相萃取小柱(3cc/150mg，waters公司)。
38.所述pri me hlb固相萃取小柱无需活化和平衡步骤，直接过滤后即可有效去除蛋白质、磷脂和色素等干扰物质，可对样品进行纯化。
39.较佳地，步骤2)中，所述提取液在hlb固相萃取柱的上样量为0.5-2ml，具体如0.5-1.0ml、1.0-2ml，优选为1.0ml。
40.较佳地，步骤2)中，所述第三溶剂为体积百分比浓度为28-30％的乙腈水溶液，具体如28-28.5％、28.5-29％、29-30％，优选为29％。所述第三溶剂作为清洗剂，使用后弃去。
41.较佳地，步骤2)中，所述提取液与第三溶剂加入的体积之比为0.5-2:4.5-5.5，具体如0.5-1:4.5-5.0、0.5-1:5.0-5.5、1.0-2:4.5-5.0、1.0-2:5.0-5.5，优选为1:5。
42.较佳地，步骤2)中，所述第四溶剂为体积百分比浓度为90-98％的乙腈水溶液，具体如90-95％、95-98％，优选为95％。
43.较佳地，步骤2)中，所述提取液与第四溶剂加入的体积之比为0.5-2:5.5-6.5，具体如0.5-1:5.5-6.0、0.5-1:6.0-6.5、1.0-2:5.5-6.0、1.0-2:6.0-6.5，优选为1:6。
44.较佳地，步骤2)中，所述洗脱的速度为5-30s/ml，具体如5-15s/ml、15-30s/ml。
45.较佳地，步骤2)中，所述定容至8-20ml，具体如8-10ml、10-20ml，优选为10ml。
46.较佳地，步骤3)中，所述对照品溶液是先将华蟾酥毒基的对照品加入第二溶剂溶解后配成对照品储备溶液，再将对照品储备溶液加入第四溶剂逐级稀释而成。
47.优选地，所述对照品储备溶液的浓度为99-101μg/ml，具体如99-100μg/ml、100-100.1μg/ml、100.1-101μg/ml。
48.较佳地，步骤3)中，所述对照品溶液的浓度范围为15-66μg/ml，优选为15.015-65.065μg/ml。
49.较佳地，步骤4)中，所述紫外分光光度法(uv)的检测波长为294-296nm，具体如294。5-295.5nm，优选为295nm。
50.较佳地，步骤4)中，所述标准曲线法包括以下步骤：
51.a)按步骤3)制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行uv检测，获得对照品溶液的吸光度值与对应浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程；
52.b)将供试品溶液进行uv检测，将获得的供试品溶液的吸光度值，代入步骤a)中相应的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。
53.优选地，所述标准工作曲线中，以吸光度值为纵坐标(y轴)，其相应浓度(即含量)为横坐标(x轴)。
54.由于蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的性质相近，均可在紫外分光光度法的同一特定检测波长下可检出。而在现有检测方法如高效液相色谱法中常以华蟾酥毒基为对照，对蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量进行计算，具体参见中国药典2020版一部药材和饮片中第401页蟾酥部分的【含量测定】段。因此，本技术中同样以华蟾酥毒基为对照，绘制相应的标准工作曲线，将uv在同一特定检测波长下检测到的供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的吸光度值，代入标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。
55.本发明第二方面提供上述hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法在分析蟾酥鲜浆质量中的用途。
56.本发明第三方面提供一种蟾酥鲜浆质量的分析方法，包括如下步骤：
57.a)采用上述hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法获得供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量对应的吸光度值；
58.b)采用快速水分测定仪测定蟾酥鲜浆样品中的水分值；
59.c)将步骤a)中的吸光度值和步骤b)中的水分值代入公式(1)中计算蟾酥鲜浆样品中以干燥品计的蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量，
60.所述公式(1)为：
61.式中，a为供试品溶液的吸光度值；m为蟾酥鲜浆样品的称样量，mg；水分为采用快速水分仪测得的水分值；
62.d)将c)获得蟾酥鲜浆样品中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量与限定折干总含量值进行比较，确定蟾酥鲜浆样品的质量。
63.较佳地，步骤a)中，所述吸光度值采用紫外分光光度法(uv)测定获得。
64.较佳地，步骤b)中，所述快速水分测定仪的检测温度为110-130℃，优选为120℃。
65.较佳地，步骤b)中，所述快速水分测定仪的样品检测量为0.5-2.0g，优选为1.0g。
66.较佳地，步骤d)中，所述限定折干总含量值不小于7.0％，优选为7.0％。
67.所述限定折干总含量值是根据2020版《中国药典》中规定以干燥品计算，蟾酥鲜浆中含蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总量不得少于7.0％，故将限定折干总含量值取为该值。
68.较佳地，步骤d)中，当所述折干总含量不小于限定折干总含量值时，蟾酥鲜浆的质
量符合要求；当所述折干总含量小于限定折干总含量值时，蟾酥鲜浆的质量不符合要求。
69.下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
70.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
71.以下实施例使用的试剂和仪器如下：
72.1、试剂
73.蟾酥鲜浆样品由和黄药业生产，具体样品批号及产地信息见表1。
74.表1样品批号及产地信息
75.编号批号产地1202205-1重庆万州2202206-2江苏扬州3202206-3河南南阳4202206-4山东日照5202206-5江苏南通6202206-6安徽宣城7202206-7山东济宁8202206-8安徽安庆
76.华蟾酥毒基(批号110803-201807，纯度：99.60％)购至中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯，国药集团)；乙腈(色谱纯，thermo)；超纯水由milli-q纯水系统制备。
77.2、仪器
78.tu-1901plus紫外-可见分光光度计(上海优若普科学仪器有限公司)；204e分析天平(瑞士mettler toledo公司)；kq-800de超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；milli-q纯水系统(美国millipore公司)；1000μl移液器(德国普兰德公司)；oasis prime hlb cartridge固相萃取小柱(waters,3cc/150mg)；涡旋振荡器(美国thermo公司)；he83快速水分测定仪(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。
79.实施例1
80.取蟾酥鲜浆样品200mg，精密称定，置50ml离心管中，精密加入12.5ml水，涡旋至鲜浆溶散、无结块，再加入12.5ml甲醇超声30min，混匀，放冷，获得提取液。然后，精密量取提取液1ml上样至oasis prime hlb(waters,3cc/150mg)固相萃取小柱，用5ml 29％乙腈水溶液清洗，弃去清洗液，再用6ml95％乙腈水溶液洗脱，洗脱液至10ml容量瓶中，用95％乙腈水溶液定容，即得供试品溶液1#。
81.实施例2
82.取蟾酥鲜浆样品200mg，精密称定，置50ml离心管中，精密加入15ml水，涡旋至鲜浆溶散、无结块，再加入15ml甲醇超声40min，混匀，放冷，获得提取液。然后，精密量取提取液1ml上样至oasis prime hlb(waters,3cc/150mg)固相萃取小柱，用5.5ml 28.5％乙腈水溶液清洗，弃去清洗液，再用5.5ml96％乙腈水溶液洗脱，洗脱液至10ml容量瓶中，用96％乙腈
水溶液定容，即得供试品溶液2#。
83.实施例3
84.取华蟾酥毒基对照品加入甲醇配成每1ml含100-100.1μg的溶液，作为对照品储备溶液。再将对照品储备溶液加入95％乙腈水溶液稀释，配成对照品溶液。对照品溶液的浓度范围为15-66μg/ml。
85.实施例4
86.将实施例1获得的供试品溶液1#和实施例3获得的对照品溶液分别采用紫外分光光度法(uv)进行测定，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。其中，紫外分光光度法(uv)的检测波长为295nm。
87.具体来说，按实施例3制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行uv检测，获得对照品溶液的吸光度值与对应浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程；再将供试品溶液进行uv检测，将获得的供试品溶液的吸光度值，代入相应的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。其中，对照品溶液和供试品溶液的紫外吸收光谱图见图1a、图1b。
88.实施例5
89.精密吸取100.1μg/ml华蟾酥毒基的对照品储备溶液，分别用95％乙腈水溶液稀释至15.015、20.02、30.03、35.035、40.04、45.045、50.05、55.055、60.06、65.065μg/ml，作为一系列对照品溶液。以95％乙腈水溶液为空白对照，用紫外分光光度计于波长295nm下测定吸光度，如图2所示，以对照品溶液的浓度(x)为横坐标，以吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线。得到线性回归方程y＝0.0125x+0.0117，r2＝0.9996，在线性范围15.015～65.065μg/ml内线性良好。
90.实施例6
91.精密吸取100.1μg/ml华蟾酥毒基的对照品储备溶液，用95％乙腈水溶液稀释至42.58μg/ml。用紫外分光光度计于波长295nm下连续检测6次，记录吸光度，计算其rsd％。结果rsd％为0.05，表明仪器的精密度良好。
92.实施例7
93.取蟾酥鲜浆样品(批号202206-4)100mg，精密称定6份，加入12.5ml超纯水，涡旋至均匀乳白色，分别加入35.02μg/ml华蟾酥毒基的对照品溶液12.5ml，超声30min，放冷，获得提取液。然后，按实施例1的前处理方法制备供试品溶液，并按实施例4在波长295nm处检测吸光度，具体检测结果见表2。由表2可知，6次回收率在96.34％～104.76％之间，rsd％为3.93，表明该方法较为准确。
94.表2
95.96.实施例8
97.取蟾酥鲜浆样品(批号202206-4)6份，按实施例1的前处理方法分别制备供试品溶液，于波长295nm下检测，含量分别为4.32％、4.41％、4.32％、4.23％、4.34％、4.31％，rsd％为1.39，说明该方法重复性高。
98.实施例9
99.取蟾酥鲜浆(批号202206-4)分别采用不同的提取方式，获得供试品溶液采用2020版《中国药典》中蟾酥含量测定项下方法(hplc法)进行检测。
100.(1)涡旋：取蟾酥鲜浆(批号202206-4)200mg，精密称定，置50ml离心管中，精密加入12.5ml超纯水，涡旋至鲜浆溶散，无结块，加入12.5ml甲醇，涡旋30min，混匀，放冷，过0.45μm微孔滤膜，即可。
101.(2)超声：取蟾酥鲜浆(批号202206-4)200mg，精密称定，置50ml离心管中，加入25ml50％甲醇，超声30分钟，混匀，放冷，过0.45μm微孔滤膜，即可。
102.(3)采用实施例1的方式制备获得。具体来说，即涡旋+超声：取蟾酥鲜浆(批号202206-4)200mg，精密称定，置50ml离心管中，精密加入12.5ml超纯水，涡旋至鲜浆溶散，无结块，加12.5ml甲醇，超声30分钟，混匀，放冷，过0.45μm微孔滤膜，即可。
103.3种提取方法的检测结果见表3。由表3可知，本技术中采用的涡旋+超声的提取方式对蟾酥鲜浆中3个成分的提取效率最佳。
104.表3提取方式考察结果
105.提取方式蟾毒灵+华蟾酥毒基+脂蟾毒配基％平行样之间的偏差％涡旋4.591.76超声3.561.34涡旋+超声4.801.70
106.实施例10
107.取不同产地蟾酥鲜浆样品，每批平行2份，按实施例1制备供试品溶液，按实施例4测定吸光度值，计算供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。同时采用hplc法进行检测，结果见表4。
108.表4不同蟾酥鲜浆含量
109.批号产地吸光度uv含量％hplc含量％偏差％202205-1重庆万州0.050.340.306.76202206-2江苏扬州0.373.523.263.81202206-3河南南阳0.110.950.808.77202206-4山东日照0.484.584.342.76202206-5江苏南通0.555.325.673.15202206-6安徽宣城0.605.705.303.67202206-7山东济宁0.555.405.033.53202206-8安徽安庆0.110.940.836.44
110.由表4可知，在线性范围内(吸光度大于0.2)的蟾酥鲜浆样品，采用uv法检测的含量与hplc法检测的含量偏差较小(偏差＜4％)，结果准确。而含量较低的蟾酥鲜浆样品(202205-1、202206-3、202206-8批次)吸光度较低，已经超出了本方法的准确定量范围，其
检测值高于hplc法检测的含量，偏差较大(偏差＞25％)。
111.实施例11
112.取蟾酥鲜浆样品(批号202206-5)，按实施例1制备供试品溶液，按实施例3制备对照品溶液，按实施例4采用uv检测，确定供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。
113.然后，取蟾酥鲜浆样品(批号202206-5)1g，通过he83型快速水分测定仪采用标准烘干模式b在120℃时测定水分值，待显示数值稳定后，测量停止，读出数值。按公式(1)中计算蟾酥鲜浆样品中以干燥品计的蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量。检测结果显示，蟾酥鲜浆以干燥品计，含蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量总和为15.89％。
114.同时，取该批次蟾酥鲜浆样品，按传统工艺加工干燥制成蟾酥，并按2020版《中国药典》含量测定项检测含量，扣除水分后，折干含量为：蟾酥药材以干燥品计，含蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量总和为15.36％。
115.两种方法测得的含量偏差较小，rd为1.70％，具体数据结果见表5。由表5可知，本蟾酥鲜浆样品的快速检测方法准确可信，可快速表征蟾酥鲜浆的质量。
116.表5uv检测与药典方法检测结果对比
[0117][0118]
实施例12
[0119]
将实施例11检测获得的供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量，与限定折干总含量值进行比较，限定折干总含量为7.0％。即2020版《中国药典》中规定以干燥品计算，含蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总量不得少于7.0％。
[0120]
以限定折干总含量值为7.0％为限度时，不同含水量蟾酥鲜浆所对应的吸光度值不同。由此可见，蟾酥鲜浆合格与否除了与吸光度有关外，还与水分相关。具体计算时可按7.0％含量限度的吸光度值：a＝0.0127+0.0035
×m×
(1-水分)进行。
[0121]
由此可见，蟾酥鲜浆样品合格与否除了与吸光度有关外，还与水分相关。合格线与水分及吸光度的关系见表6。例如当蟾酥鲜浆水分为70％，吸光度低于0.22时，则该蟾酥鲜浆样品质量不符合药典要求。而在本方法中，当吸光度为可定量范围下限0.2时，若其水分值高于73％，则该批蟾酥鲜浆不符合药典要求。采用本方法可快速判定蟾酥鲜浆是否合格，为药材的采购提供快速、简便的方法及依据。
[0122]
表6蟾酥鲜浆样品的不同含水量对应的吸光度限度(m＝200mg)
[0123]
水分％7.0％含量限度吸光度400.4327500.3627600.2927700.2227730.2000800.1527
[0124]
综上所述，本发明提供的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，能够采用hlb固相萃取小柱对蟾酥鲜浆进行纯化分离，得到蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基3个成分的混合物，经紫外分光光度计直接检测其含量，够快速表征蟾酥药材的质量，为蟾酥鲜的质量控制提供了依据。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0125]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，包括如下步骤：1)将蟾酥鲜浆样品加第一溶剂溶散，再加入第二溶剂超声提取后取上清液混匀、放冷，获得提取液；2)将步骤1)中获得的提取液上样至hlb固相萃取柱后采用第三溶剂清洗，再采用第四溶剂洗脱、定容，获得供试品溶液；3)将华蟾酥毒基的对照品加入第二溶剂溶解并定容，获得对照品溶液；4)将步骤2)中获得的供试品溶液和步骤3)中获得的对照品溶液分别采用紫外分光光度法进行测定，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量。2.根据权利要求1所述的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，其特征在于，步骤1)中包括以下条件中任一项或多项：a1)所述第一溶剂为无机溶剂；优选地，所述第一溶剂为水；a2)所述蟾酥鲜浆样品加入的质量与第一溶剂加入的体积之比为0.2:5-50，g/ml；a3)所述溶散采用涡旋进行溶解分散，所述涡旋至蟾酥鲜浆样品无结块；a4)所述第二溶剂为有机溶剂；优选地，所述第二溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮中一种；更优选地，所述第二溶剂为甲醇；a5)所述蟾酥鲜浆样品加入的质量与第二溶剂加入的体积之比为0.2:5-50，g/ml；a6)所述超声提取的时间为10-50min。3.根据权利要求1所述的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，其特征在于，步骤2)中包括以下条件中任一项或多项：b1)所述hlb固相萃取柱为oasis prime hlb固相萃取小柱；b2)所述提取液在hlb固相萃取柱的上样量为0.5-2ml；b3)所述第三溶剂为体积百分比浓度为28-30％的乙腈水溶液；b4)所述提取液与第三溶剂加入的体积之比为0.5-2:4.5-5.5；b5)所述第四溶剂为体积百分比浓度为90-98％的乙腈水溶液；b6)所述提取液与第四溶剂加入的体积之比为0.5-2:5.5-6.5；b7)所述洗脱的速度为5-30s/ml。4.根据权利要求1所述的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述对照品溶液的浓度范围为15-66μg/ml。5.根据权利要求1所述的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，其特征在于，步骤4)中，所述紫外分光光度法的检测波长为294-296nm。6.根据权利要求1-5任一所述的一种hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法在分析蟾酥鲜浆质量中的用途。7.一种蟾酥鲜浆质量的分析方法，包括如下步骤：a)采用上述hlb固相萃取-uv法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法获得供试品溶液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的总含量对应的吸光度值；b)采用快速水分测定仪测定蟾酥鲜浆样品中的水分值；c)将步骤a)中的吸光度值和步骤b)中的水分值代入公式(1)中计算蟾酥鲜浆样品中以干燥品计的蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量，
所述公式(1)为：式中，a为供试品溶液的吸光度值；m为蟾酥鲜浆样品的称样量，mg；水分为采用快速水分仪测得的水分值；d)将c)获得蟾酥鲜浆样品中蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的折干总含量与限定折干总含量值进行比较，确定蟾酥鲜浆样品的质量。8.根据权利要求7所述的一种蟾酥鲜浆质量的分析方法，其特征在于，步骤b)中，所述快速水分测定仪的检测温度为110-130℃。9.根据权利要求7所述的一种蟾酥鲜浆质量的分析方法，其特征在于，步骤d)中，所述限定折干总含量值不小于7.0％；优选地，所述限定折干总含量值为7.0％。10.根据权利要求7所述的一种蟾酥鲜浆质量的分析方法，其特征在于，步骤d)中，当所述折干总含量不小于限定折干总含量值时，蟾酥鲜浆的质量符合要求；当所述折干总含量小于限定折干总含量值时，蟾酥鲜浆的质量不符合要求。

技术总结
本发明提供一种HLB固相萃取-UV法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法。本发明进一步提供上述HLB固相萃取-UV法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法在分析蟾酥鲜浆质量中的用途。本发明还提供一种蟾酥鲜浆质量的分析方法。本发明提供的一种HLB固相萃取-UV法快速检测蟾酥鲜浆中有效成分含量的方法，能够采用HLB固相萃取小柱对蟾酥鲜浆进行纯化分离，得到蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基3个成分的混合物，经紫外分光光度计直接检测其含量，够快速表征蟾酥药材的质量，为蟾酥鲜的质量控制提供了依据。制提供了依据。


技术研发人员：孔瑶 詹常森 姜鹏 温方方 武志立 孙丽雪 戴悦
受保护的技术使用者：上海和黄药业有限公司
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/7