近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用

1.本技术涉及真菌耐药机制以及耐药快速检测的技术领域，更具体地说，涉及近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用。


背景技术：

2.近平滑念珠菌是一种全球范围内引起侵袭性念珠菌病的临床重要致病性真菌。唑类药物是预防或治疗侵袭性念珠菌病的常用药物。近平滑念珠菌对唑类药物的耐药情况严重且逐年增加，耐药率在全球部分地区甚至高达50％，给近平滑念珠菌感染的预防和治疗构成了严峻挑战。
3.念珠菌对唑类药物的耐药最常见途径是麦角甾醇生物合成机制的改变，主要为药物靶点14-α-去甲基化酶erg11或后期合成关键酶erg3突变或过度表达。药物外排泵包括atp转运蛋白家族(cdr1和cdr2)和蛋白外排超家族(mdr1)表达上调是念珠菌产生对唑类药物的耐药性的另一关键因素，多由其对应的转录因子tac1和mrr1发生功能获得性突变所介导。但是目前针对近平滑念珠菌的唑类耐药机制研究尚缺乏。虽然已有研究表明存在一些突变与耐药获得潜在相关，但其功能仍待验证。
4.临床上对微生物耐药的检测有以表型或基因型为鉴定对象的两类检测方法，目前临床常规检测方法主要为传统表型检测方法，包括纸片扩散法、浓度梯度稀释法和肉汤稀释法，但耗时均较长。快速表型药敏检测通过检测抗菌药物存在下病原菌的生长阻滞情况，来判断其耐药性或检测药物敏感性。但这类方法操作耗时、所需设备昂贵、存在放射性危害，且较难实现快速高效的筛查。基因型耐药性检测方法是直接从临床样本中检测与耐药性相关的基因的有无、表达量或者突变情况，从而判定是否耐药，对生长缓慢(如真菌)或难培养的病原体具有重要价值。相对于其他方法，该类方法检测时间短、能定量分析，并可明确对应耐药机制。基因型检测耐药型方法需要依托于对微生物耐药机制的挖掘与研究，需敏锐发现新耐药机制以降低假阴性。


技术实现要素：

5.为了进一步挖掘和明确导致近平滑念珠菌对唑类药物产生耐药性的基因突变位点，本技术对近平滑念珠菌耐药分离株做了进一步探究和分析，分别在近平滑念珠菌mrr1基因和近平滑念珠菌tac1基因上发现了新的突变位点，并明确了其耐药功能。本技术提供近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用。
6.第一方面，本技术提供一种近平滑念珠菌唑类耐药相关mrr1基因的新突变位点。
7.所述突变位于mrr1基因在如seq id no 1所示的碱基序列的第1873位，发生的点突变为碱基c替换为碱基a(c1873a)；对应地，编码的mrr1蛋白在如seq id no 15所示的氨基酸序列上的第625位氨基酸由谷氨酰胺变为赖氨酸(q625k)。
8.突变后的mrr1基因(c1873a)编码的mrr1蛋白的氨基酸序列如seq id no 16所示。
9.第二方面，本技术提供一种近平滑念珠菌唑类耐药相关tac1基因的新突变位点，
采用如下的技术方案：
10.所述突变位于tac1基因在seq id no 2所示的碱基序列第1318位，发生的点突变为碱基g突变为t(g1318t)，对应地，编码的tac1蛋白在seq id no 17所示的氨基酸序列的第440位氨基酸由天冬氨酸替换为酪氨酸(d440y)；和/或，所述突变位于tac1基因的第1475位，发生的点突变为碱基c突变为碱基t(c1475t)，对应地，编码的tac1蛋白在如seq id no 17所示的氨基酸序列上的第440位氨基酸由苏氨酸替换为蛋氨酸(t492m)。
11.突变后的tac1基因(g1318t)编码的tac1蛋白的氨基酸序列如seq id no 18所示。
12.突变后的tac1基因(t492m)编码的tac1蛋白的氨基酸序列如seq id no 19所示。
13.第三方面，本技术提供一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒，采用如下的技术方案：
14.一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测上述mrr1基因的第1873位点和/或上述tac1基因的第1318位点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针。
15.优选地，所述用于检测上述mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列。
16.优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列。
17.优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。
18.第四方面，本技术提供一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点的微流控芯片，采用如下的技术方案：
19.一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点的微流控芯片，所述试剂盒包括用于检测上述mrr1基因的第1873位点和/或上述所述的tac1基因的第1318位点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针。
20.优选地，所述用于检测上述mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列。
21.优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列。
22.优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。
23.第五方面，本技术提供一种上述近平滑念珠菌唑类耐药相关mrr1基因的新突变位点、权利要求2所述的近平滑念珠菌唑类耐药相关tac1基因的新突变位点、权利要求3所述的检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒或权利要求4所述的检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的微流控芯片在快速检测近平滑念珠菌耐药性中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗领域中的应用。
24.优选地，所述耐药性为针对唑类药物的耐药性：所述mrr1基因的c1873a突变(氨基酸突变为q265k)导致菌株对氟康唑耐药；所述tac1基因的g1318t突变(氨基酸突变为d440y)和c1475t突变(氨基酸突变为t492m)均可导致菌株对氟康唑、泊沙康唑和伊曲康唑耐药。
25.第六方面，本技术提供一种近平滑念珠菌唑类耐药性的快速筛查法，采用如下的技术方案：
26.一种近平滑念珠菌耐药性的快速筛查法，利用微流控芯片技术快速检测近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点和/或近平滑念珠菌tac1基因第1318位点和/或近平滑念珠菌tac1基因第1475位点的碱基类型；所述快速筛查法用于非疾病诊断领域。
27.优选地，所述利用微流控芯片技术进行快速检测的方法为arms-qpcr。
28.第七方面，本技术提供一种引物序列组合，采用如下的技术方案：
29.一种引物序列组合，所述引物序列组合包括用于检测上述近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点碱基为突变型或野生型的引物序列；和/或，用于检测上述近平滑念珠菌tac1基因第1318位点碱基为突变型或野生型的引物序列；和/或，用于检测上述近平滑念珠菌tac1基因第1475位点碱基为突变型或野生型的引物序列；
30.优选地，所述用于检测近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点的引物序列包括：
31.m-f-1——包括如seq id no 6所示的碱基序列；
32.m-f-2——包括如seq id no 7所示的碱基序列；
33.m-r-2——包括如seq id no 8所示的碱基序列。
34.其中，所述m-f-1与所述m-r-2合用，用于检测野生型位点；所述m-f-2与所述m-r-2合用，用于检测突变型位点。
35.优选地，所述用于检测近平滑念珠菌tac1基因第1318位点的引物序列包括：
36.t1-f-1——包括如seq id no 9所示的碱基序列；
37.t1-f-3——包括如seq id no 10所示的碱基序列；
38.t1-r-3——包括如seq id no 11所示的碱基序列。
39.其中，所述t1-f-1与所述t1-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t1-f-3与所述t1-r-3合用，用于检测突变型位点。
40.优选地，所述用于检测近平滑念珠菌tac1基因第1475位点的引物序列包括：
41.t2-f-1——包括如seq id no 12所示的碱基序列；
42.t2-f-4——包括如seq id no 13所示的碱基序列；
43.t2-r-3——包括如seq id no 14所示的碱基序列。
44.其中，所述t2-f-1与所述t2-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t2-f-4与所述t2-r-3合用，用于检测突变型位点。
45.综上所述，本技术具有以下有益效果：
46.本技术发现的近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点提高了近平滑念珠菌耐药性的分子检测水平，能够有效缩短阳性检出患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。
附图说明
47.图1为近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点碱基为c(野生型)扩增曲线图(野生型(碱基c)呈阳性，突变型(碱基a)呈阴性)。
48.图2为近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点碱基为a(突变型)扩增曲线图(突变型(碱基a)呈阳性，野生型(碱基c)呈阴性)。
49.图3为近平滑念珠菌tac1基因的第1318位点的碱基为g(野生型)的扩增曲线图(野生型(碱基g)呈阳性，突变型(碱基t)呈阴性)。
50.图4为近平滑念珠菌tac1基因的第1318位点的碱基为t(突变型)的扩增曲线图(突变型(碱基t)呈阳性，野生型(碱基g)呈阴性)。
51.图5为近平滑念珠菌tac1基因的第1475位点的碱基为c(野生型)的扩增曲线图(野生型(碱基c)呈阳性，突变型(碱基t)呈阴性)。
52.图6为近平滑念珠菌tac1基因的第1475位点的碱基为t(野生型)的扩增曲线图(突变型(碱基t)呈阳性，野生型(碱基c)呈阴性)。
53.附图中，横坐标单位是分钟(min)，纵坐标没有单位；出现“s”型扩增曲线表示相应指标检出，未出现“s”型扩增曲线表示相应指标未检出。
具体实施方式
54.以下结合具体实例对本技术的近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点的筛选及检测方法进一步的说明，但并不局限于此。具体包括以下步骤：
55.(1)预测与近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点
56.收集近平滑念珠菌临床菌株，并对收集的临床菌株进行全基因组测序。通过生物信息学方法，预测与近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点。
57.(2)验证预测的碱基突变与近平滑念珠菌唑类耐药的相关性
58.通过crispr/cas9定点突变技术，分别将突变型碱基引入唑类敏感的近平滑念珠菌标准菌株atcc 22019，并对基因编辑前后菌株进行药物敏感性检测，验证新发现突变碱基与唑类药物敏感性之间的相关性。
59.(3)通过以微流控芯片为基础的arms-qpcr实验检测近平滑念珠菌临床分离株的上述碱基位点突变情况，以判断近平滑念珠菌唑类耐药性
60.设计arms特异性引物，将发生突变的碱基落在引物的3’末端，为了增强检测的特异性和可重复性，还可以在突变位点前的第二或第三个碱基处人为引入错配碱基。使用微流控芯片与arms-qpcr相结合的方式，将待测样本加入含有特异性引物和taqman探针的微流控芯片中，将芯片插入onestart全自动核酸poct一体机(百康芯生物科技有限公司生产)中进行扩增和检测及结果分析判读等步骤。
61.最终确定新发现的具有导致唑类耐药功能的点突变为近平滑念珠菌mrr1基因的第1873位点的碱基c替换成a，该突变的发生直接导致近平滑念珠菌对氟康唑耐药；近平滑念珠菌tac1基因的第1318位点的碱基g替换成t，近平滑念珠菌tac1基因的第1475位点的碱基c替换成t，这两个突变的发生均分别导致近平滑念珠菌对氟康唑、泊沙康唑和伊曲康唑耐药。
62.由上所述，一方面，本技术提供了一种近平滑念珠菌mrr1基因，在如seq id no 1所示的第1873位碱基发生的突变，由碱基c突变为碱基a。另一方面，本技术提供了两种近平滑念珠菌tac1基因突变，所述突变分别在tac1基因如seq id no 2所示的碱基序列的第1318位和第1475位，分别由碱基g突变为碱基t、碱基c突变为碱基t。
63.此外，本技术还提供了一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测上述mrr1基因的第1873位点和/或上述tac1基因的第1318位
点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针。
64.优选地，所述用于检测上述mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列。
65.优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列。
66.优选地，所述用于检测上述tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。
67.优选地，用于检测近平滑念珠菌mrr1基因突变位点第1873位点的引物序列包括：
68.m-f-1——包括如seq id no 6所示的碱基序列；
69.m-f-2——包括如seq id no 7所示的碱基序列；
70.m-r-2——包括如seq id no 8所示的碱基序列。
71.其中，所述m-f-1与所述m-r-2合用，用于检测野生型位点；所述m-f-2与所述m-r-2合用，用于检测突变位点。
72.优选地，用于检测近平滑念珠菌tac1基因突变位点第1318位点的引物序列包括：
73.t1-f-1——包括如seq id no 9所示的碱基序列；
74.t1-f-3——包括如seq id no 10所示的碱基序列；
75.t1-r-3——包括如seq id no 11所示的碱基序列。
76.其中，所述t1-f-1与所述t1-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t1-f-3与所述t1-r-3合用，用于检测突变位点。
77.优选地，用于检测近平滑念珠菌tac1基因突变位点第1475位点的引物序列包括：
78.t2-f-1——包括如seq id no 12所示的碱基序列；
79.t2-f-4——包括如seq id no 13所示的碱基序列；
80.t2-r-3——包括如seq id no 14所示的碱基序列。
81.其中，所述t2-f-1与所述t2-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t2-f-4与所述t2-r-3合用，用于检测突变位点。
82.依托中国医院侵袭性真菌病监测网(chif-net)，本技术通过对十年收集的唑类耐药株全基因组测序和单核苷酸多态性分析(snp)，挖掘潜在耐药直接相关碱基突变，并通过crispr/cas9技术验证了其功能。
83.本技术分别在近平滑念珠菌mrr1基因和近平滑念珠菌tac1基因上发现了新的基因突变位点，促进了对近平滑念珠菌耐药性的进一步深入研究。本技术发现的近平滑念珠菌唑类耐药相关碱基突变提高了近平滑念珠菌耐药性的分子检测水平，能够有效缩短阳性检出患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。
84.为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本技术的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
85.实施例：
86.(1)预测与近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点
87.依托中国医院侵袭性真菌病监测网(chif-net)，回顾性收集到2012年至2017年间共56株唑类耐药的近平滑念珠菌临床菌株，同时纳入21株中介株、21株敏感株，并以唑类敏
感的近平滑念珠菌参考菌株cdc317的基因组序列为对照，进行单核苷酸多态性分析，挖掘到一批潜在的与唑类耐药相关的碱基突变位点，其中三个新发现的突变位点与唑类耐药性具有较高相关性，分别是mrr1基因第1873位碱基c突变为a(对应的氨基酸突变为q625k)；tac1基因的第1318位碱基g突变为t(对应的氨基酸突变为d440y)，和第1475位碱基c突变为t(对应的氨基酸突变为t492m)。
88.表1新发现的碱基突变位点与唑类耐药性升高的相关性
[0089][0090][0091]
(2)验证预测的三个碱基突变与近平滑念珠菌唑类耐药的相关性
[0092]
对新发现的三个碱基突变做进一步验证，利用crispr/cas9基因编辑技术对唑类敏感的近平滑念珠菌标准菌株atcc 22019进行定点突变术。将突变型碱基a替mrr1基因的第1873位碱基c，将碱基t分别引入tac1基因的第1318位和第1475位，替换原始野生型碱基。并对上述基因编辑前后菌株进行药物敏感性检测，如表2所示，验证结果mrr1基因的c1873a突变(氨基酸突变为q265k)导致菌株对氟康唑的mic值升高了32倍，由敏感变为耐药；tac1基因的g1318t(d440y)和c1475t(t492m)突变均导致菌株对氟康唑、泊沙康唑和伊曲康唑耐药。
[0093]
表2三个新发现的碱基突变的功能性验证
[0094][0095]
(3)通过以微流控芯片为基础的arms-qpcr实验检测近平滑念珠菌临床分离株的上述碱基位点突变情况，以判断近平滑念珠菌唑类耐药性
[0096]
选取来自chif-net监测网的50株临床样本，向含有特异性引物和taqman探针的微流控芯片中加入待测的临床样本后，将芯片插入onestart全自动核酸poct一体机(百康芯生物科技有限公司生产)中进行arms-qpcr扩增实验，按照仪器和对应软件的操作要求进行上机后的程序设置等操作。
[0097]
在程序运行结束之后，根据在不同的微腔中反应得到的ct值对实验结果进行分析判读。检测完成后，onestart全自动核酸poct一体机将自动进行数据分析，显示反应过程曲线及检测结果。当待检指标的ct值小于或等于40时，判读为阳性；当待检指标的ct值大于40时，判读为阴性。
[0098]
检测结果如图1-6所示。
[0099]
需要注意的是，每个突变位点的检测均需在两个反应微腔中同时进行，其中一个反应微腔内含有与突变位点配对的arms上游引物，另一个反应微腔内含有与未突变位点配对的arms上游引物，其余反应组分如dntp、taq酶、模板、mg
2+
和双蒸水等均相同。
[0100]
用于扩增含有突变位点的arms引物和taqman探针的碱基序列如表3所示。
[0101]
表3用于扩增含有突变位点的arms引物和taqman探针的碱基序列
[0102][0103]
由图1-6的检测结果可知，根据对临床样本的检测结果统计分析可得，近平滑念珠菌突变率最高的碱基突变位点为mrr1基因的第1873位点的碱基c替换成a，tac1基因的第1318位点的碱基g替换成t，tac1基因的第1475位点的碱基c替换成t。
[0104]
本技术分别在近平滑念珠菌mrr1基因和近平滑念珠菌tac1基因上发现了新的基因突变位点，促进了对近平滑念珠菌耐药性的进一步深入研究。
[0105]
近平滑念珠菌mrr1基因的第1873位碱基c突变为a，对应的氨基酸突变为q625k；近平滑念珠菌tac1基因的第1318位点的碱基g替换成t，对应氨基酸突变d440y；近平滑念珠菌tac1基因的第1475位点的碱基c替换成t，对应氨基酸突变t492m。本技术发现的近平滑念珠菌唑类耐药相关的碱基突变位点提高了近平滑念珠菌耐药性的分子检测水平，能够有效缩
短阳性检出患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。
[0106]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种近平滑念珠菌唑类耐药相关mrr1基因的新突变位点，其特征在于：所述突变位于mrr1基因在如seq id no 1所示的碱基序列的第1873位，发生的点突变为碱基c替换为碱基a（c1873a）；对应地，编码的mrr1蛋白在如seq id no 15所示的氨基酸序列上的第625位氨基酸由谷氨酰胺变为赖氨酸（q625k）。2.一种近平滑念珠菌唑类耐药相关tac1基因的新突变位点，其特征在于：所述突变位于tac1基因在seq id no 2所示的碱基序列第1318位，发生的点突变为碱基g突变为t（g1318t），对应地，编码的tac1蛋白在seq id no 17所示的氨基酸序列的第440位氨基酸由天冬氨酸替换为酪氨酸（d440y）；和/或，所述突变位于tac1基因的第1475位，发生的点突变为碱基c突变为碱基t（c1475t），对应地，编码的tac1蛋白在如seq id no 17所示的氨基酸序列上的第440位氨基酸由苏氨酸替换为蛋氨酸（t492m）。3.一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述的mrr1基因的第1873位点和/或权利要求2所述的tac1基因的第1318位点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针；优选地，所述用于检测权利要求1所述的mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列；和/或，所述用于检测权利要求2所述的tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列；和/或，所述用于检测权利要求2所述的tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。4.一种检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的微流控芯片，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述的mrr1基因的第1873位点和/或权利要求2所述的tac1基因的第1318位点和/或第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针；优选地，所述用于检测权利要求1所述的mrr1基因的第1873位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 3所示的碱基序列；和/或，所述用于检测权利要求2所述的tac1基因的第1318位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 4所示的碱基序列；和/或，所述用于检测权利要求2所述的tac1基因的第1475位点是否发生碱基突变的特异性寡核苷酸探针包含如seq id no 5所示的碱基序列。5.一种权利要求1所述的近平滑念珠菌唑类耐药相关mrr1基因的新突变位点、权利要求2所述的近平滑念珠菌唑类耐药相关tac1基因的新突变位点、权利要求3所述的检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的试剂盒或权利要求4所述的检测近平滑念珠菌唑类耐药相关突变碱基的微流控芯片在快速检测近平滑念珠菌耐药性中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗领域中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述耐药性为针对唑类药物的耐药性：所述mrr1基因的c1873a突变（氨基酸突变为q265k）导致菌株对氟康唑耐药；所述tac1基因的g1318t突变（氨基酸突变为d440y）和c1475t突变（氨基酸突变为t492m）均可导致菌株对氟康唑、泊沙康唑和伊曲康唑耐药。7.一种近平滑念珠菌唑类耐药性的快速筛查法，其特征在于，利用微流控芯片技术快速检测近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点和/或近平滑念珠菌tac1基因第1318位点和/或
近平滑念珠菌tac1基因第1475位点的碱基类型；所述快速筛查法用于非疾病诊断领域。8.根据权利要求7所述的近平滑念珠菌唑类耐药性的快速筛查法，其特征在于，所述利用微流控芯片技术进行快速检测的方法为arms-qpcr。9.一种引物序列组合，其特征在于，所述引物序列组合包括用于检测权利要求1所述的近平滑念珠菌mrr1基因第1873位碱基为突变型或野生型的引物序列；和/或，用于检测权利要求2所述的近平滑念珠菌tac1基因第1318位碱基为突变型或野生型的引物序列；和/或，用于检测权利要求2所述的近平滑念珠菌tac1基因第1475位碱基为突变型或野生型的引物序列；优选地，所述用于检测近平滑念珠菌mrr1基因第1873位点的引物序列包括：m-f-1——包括如seq id no 6所示的碱基序列；m-f-2——包括如seq id no 7所示的碱基序列；m-r-2——包括如seq id no 8所示的碱基序列；其中，所述m-f-1与所述m-r-2合用，用于检测野生型位点；所述m-f-2与所述m-r-2合用，用于检测突变型位点；优选地，所述用于检测近平滑念珠菌tac1基因第1318位点的引物序列包括：t1-f-1——包括如seq id no 9所示的碱基序列；t1-f-3——包括如seq id no 10所示的碱基序列；t1-r-3——包括如seq id no 11所示的碱基序列；其中，所述t1-f-1与所述t1-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t1-f-3与所述t1-r-3合用，用于检测突变型位点；优选地，所述用于检测近平滑念珠菌tac1基因第1475位点的引物序列包括：t2-f-1——包括如seq id no 12所示的碱基序列；t2-f-4——包括如seq id no 13所示的碱基序列；t2-r-3——包括如seq id no 14所示的碱基序列；其中，所述t2-f-1与所述t2-r-3合用，用于检测野生型位点；所述t2-f-4与所述t2-r-3合用，用于检测突变型位点。

技术总结
本申请涉及真菌耐药机制以及耐药快速检测的技术领域，具体公开了近平滑念珠菌唑类耐药相关的新突变位点及其应用。本申请公开了三个唑类耐药相关的新突变位点，分别为：MRR1基因的C1873A突变（氨基酸突变为Q265K）；TAC1基因的G1318T突变（氨基酸突变为D440Y）和C1475T突变（氨基酸突变为T492M）。本申请发现的新突变位点可作为检测靶点应用于近平滑念珠菌唑类耐药性的检测中，促进了近平滑念珠菌唑类耐药性的分子检测水平的发展，且检测时间短，能够有效缩短阳性检出患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。治疗时间和费用。


技术研发人员：宁雅婷 张丽 徐英春 孙天舒 罗征宇 肖盟 于淑颖 史小伟 张国豪
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：2023.07.25
技术公布日：2023/9/9