水稻OsbZIP82基因在调控水稻耐铝中的应用、sgRNA、重组载体及其应用

水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝中的应用、sgrna、重组载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝性中的应用、sgrna、重组载体及其应用。


背景技术：

2.酸性土壤约占我国土地总面积的22.7％，主要分布于水热资源丰富的南方地区，该地区作物生产潜力巨大，而土壤酸性问题严重制约了生产力的发挥。铝毒是公认的酸性土壤上影响作物生长的主要限制因素。铝毒害严重影响作物的根系生长，从而严重阻碍根系对养分和水分的吸收，由此导致农作物的减产、减收，在强酸性土壤上甚至会导致绝收。因此，解析水稻的耐铝机制，寻找调控水稻耐铝性状的关键基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义，利用该关键基因选育耐铝的作物是提高酸性铝毒土壤水稻生产力、保障国家粮食安全、促进农业可持续发展的重要途径。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提供了水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝方面的应用、sgrna、重组载体及其应用。本发明确定了敲除水稻osbzip82基因可以显著降低水稻的耐铝性，为耐铝水稻品种的分析提供了契机，为通过杂交和分子标记辅助育种技术培育耐铝水稻新材料提供了基因资源和技术支持。
4.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.本发明提供了水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝性中的应用，所述水稻osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.优选的，所述调控水稻耐铝性包括：通过负调控osbzip82基因的表达来增加水稻的铝敏感性。
7.优选的，所述水稻的铝敏感性的性状包括：根长和野生型相比降低，根尖铝含量较野生型增加。
8.优选的，所述水稻osbzip82基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还提供了一种靶向水稻osbzip82基因的sgrna，所述sgrna的靶标的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.优选的，所述sgrna包括sgrna-s和sgrna-a；所述sgrna-s的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述sgrna-a的核苷酸序列如seq id no.5所示。
11.本发明还提供了一种敲除水稻osbzip82基因的重组载体，所述重组载体包括上述技术方案所述的sgrna。
12.本发明还提供了上述技术方案所述sgrna或上述技术方案所述的重组载体在增加水稻铝敏感性中的应用。
13.优选的，所述水稻铝敏感性的性状包括：根长和野生型相比降低，根尖铝含量较野
生型增加。
14.本发明还提供了水稻osbzip82基因或上述技术方案所述sgrna或上述技术方案所述的重组载体在在培育转基因水稻中的应用；所述水稻osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
15.有益效果：
16.本发明提供了水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝性中的应用，所述osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明通过对353个世界核心水稻品种对铝胁迫的响应通过全基因组关联分析(genome wide association study，gwas)鉴定得到了一个控制水稻耐铝性状的关键基因osbzip82(loc_os11g11100)，进一步通过crispr/cas9基因编辑技术创建该基因功能缺失的突变体osbzip82，并与野生型日本晴(nipponbare，nip)一起铝处理，发现该基因缺失的突变体对铝超级敏感，其中，突变体osbzip82根长和野生型相比降低，根尖铝含量较野生型增加。osbzip82基因不仅可用以完善水稻响应铝胁迫的上下游调控网络，同时也为通过杂交和分子标记辅助育种选育耐铝的水稻新材料，最终提高酸性土壤粮食产量，解决日益严重的粮食保障问题提供了一个新思路。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
18.图1铝处理前后水稻相对根伸长的gwas分析结果；
19.图2为野生型水稻nip和突变体材料osbzip82耐铝表型分析；
20.图3为野生型水稻nip和突变体材料osbzip82铝处理前后的根长对比图；
21.图4为野生型水稻nip和突变体材料osbzip82铝处理后根尖铝含量的对比图。
具体实施方式
22.本发明提供了水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝性中的应用，所述osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
23.mmmanaklpkqallpprspfptaaaaagpyagdhgpiarpqgaphhrhghghghhqrtssesfieeqpswlddllnepetpvrqhgraghrrsssdsfamfdggaaagayangfegmgggggggqaapwggvqeyyakpssfgrhqgrpweqgmnnlvnyrqsggppmpakekvgghhgspsvlrdhdhgmdrrssdesghdqkvgperkegvppkhaqseadtkrakqqyaqrsrvrklqyiaelerkvqalqsegidvsaemeflsqqnimldlenkalkqrleslaqeqlikrfqqemfereigrlrslyqqqqqqqkqpqptttlsrsnsrdldsqfanlslkhkdpnsgplrtqsssil。
24.在本发明中，所述水稻osbzip82基因的核苷酸序列优选如seq id no.2所示，具体为：5
’‑
atgatgatggcgaacgcgaagctgcccaagcaggcgct gctgccgccgcgcagcccgttcccgacggcggcggcggcggcggggccgtacgccggcgaccacggcccgatcgcgcggccgcagggtgcgccgcaccacaggcacgggcacggccacgggcaccaccagcgcacgtcgtcggagagcttcatcgaggagcagccgtcgtggctcgacgacctgctcaacgagcccgagacgccggtgcggcagcacggccgggccggccaccgccggtcgtcgagtgactcgtttgcgatgttcgacggaggcgccgccgccggcgcttacgccaatggctttgaagggatgggaggaggaggaggaggagggcaggccgcgccgtggggtggtgtgcaggagtactatgcgaagccaagctcgtttggtaggcaccagggccggccatgggagcagggcatgaacaatttggtgaattacaggcaaagcggcggtccaccgatgccggcgaaggagaaggttggt
的cacl2溶液(ph 4.5)处理24小时后，发现相对于野生型，osbzip82突变体对铝的耐性显著降低。
39.本发明还提供了水稻osbzip82基因或上述技术方案所述sgrna或上述技术方案所述的重组载体在在培育转基因水稻中的应用；所述水稻osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
40.在本发明中，所述转基因水稻的性状优选包括：根长和/或根尖铝含量。利用本发明提供的sgrna制备的转基因水稻可以，抑制根长生长和提高根尖铝含量，从而降低水稻耐铝性。
41.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝性中的应用、sgrna、重组载体及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.实施例1
43.将353个世界核心水稻品种在0.5mm的cacl2溶液(ph为4.5)中黑暗萌发3天后，测量根长，然后分别放置在含有和不含有alcl3的cacl2溶液中继续黑暗培养24小时，所述cacl2溶液中cacl2的浓度为0.5mm；所述cacl2溶液的ph为4.5；所述含有alcl3的cacl2溶液中alcl3的浓度为50μm；
44.测量处理后的根长，并计算相对根伸长后，以此为基础进行gwas分析。结果见图1。
45.经鉴定得到了一个控制水稻耐铝性状的关键基因osbzip82，所述水稻osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述水稻osbzip82基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
46.实施例2
47.一种敲除水稻osbzip82基因的重组载体，所述重组载体由以下方法构建得到：
48.合成由seq id no.3所示的靶标序列衍生出的互补dna序列，所述互补dna序列由sgrna-s1和sgrna-a1组成；
49.所述sgrna-s1的核苷酸序列如seq id no.4所示；
50.所述sgrna-a1的核苷酸序列如seq id no.5所示；
51.将合成的sgrna-s1和sgrna-a1分别稀释成10μm，按体积比为sgrna-s1：sgrna-a1：ddh2o＝5：5：15混匀后，100℃金属浴5min，室温自然冷却10min，得到oligo二聚体，备用；
52.将sk-grna载体在aar i限制性内切酶的作用下，50℃，水浴2h进行酶切；酶切结束后，使用胶回收试剂盒(购自艾科瑞生物的steadypure dna凝胶回收试剂盒，货号为ag21006)进行回收，具体回收操作如下：加入3倍体积的buffer mb并全部转移至离心柱，12000rpm离心1min后弃滤液，加入700μlbufferwb溶液，12000rpm离心1min，弃滤液，再次12000rpm离心2min，去除残留液；将离心柱放置一新的1.5ml离心管，加入30μl 65℃预热的elutionbuffer，室温静置1min后，12000rpm离心1min获得sk-grna酶切产物；
53.使用t4酶进行载体连接，按体积比为sk-grna酶切产物：oligo二聚体：t4酶：t4 buffer＝1：7：1：1混匀后，室温静置4h，得到所述重组载体；构建好的重组载体转化dh5α感受态细胞并使用氨苄抗性培养基进行阳性单克隆筛选，接着通过菌落pcr检测出阳性克隆，送公司测序，得到成功构建的中间重组载体；
54.用kpn i和bgl ii限制性内切酶对sk-grna中间重组载体进行酶切，用kpn i和
bamh i进限制性内切酶对pc1300-cas9载体进行酶切，酶切条件均为：50℃，水浴2h；使用t4酶进行载体连接，按体积比为sk-grna中间重组载体酶切产物：pc1300-cas9载体酶切产物：t4酶：t4 buffer＝4：4：1：1混匀后，室温静置4h，得到所述最终重组载体。
55.应用例1
56.将实施例1构建好的最终重组载体转化dh5α感受态细胞并使用卡那霉素抗性培养基进行阳性单克隆筛选，得到阳性克隆菌液；所述卡那霉素抗性培养基由以下浓度的组分组成：蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l、卡那霉素0.5g/l和琼脂粉20g/l；
57.将获得的阳性克隆菌液通过质粒提取试剂盒(购自torovid的plasmid extraction mini kit，货号为pde-100)进行重组质粒提取；
58.将提取的重组质粒转入农杆菌gv3101后侵染水稻日本晴(oryza sativa，记为nip)愈伤组织，筛选获得阳性转基因突变体osbzip82，具体方法如下：
59.将转入所述重组质粒的农杆菌gv3101接种到yeb固体培养基(购自solarbio，货号为la7580)上，28℃培养得到单克隆菌落；从yeb固体培养基上挑取所述单克隆菌落接种到20ml含50mg/l卡那抗生素和50mg/l利福平的yeb液体培养基中，28℃摇菌培养至对数生长晚期，得到菌液；再从所述菌液中取0.5ml转接至50ml含50mg/l卡那抗生素和50mg/l利福平的yeb培养基中，28℃摇菌培养至od
600
为0.5；将培养好的农杆菌4000g离心10min后，沉淀用等体积的aam-as培养基重悬，得到aam-as重悬液；所述aam-as培养基以aam培养基(购自solarbio，货号为la8580)为基础培养基，仅含有100μmol/l乙酰丁香酮；所述aam-as培养基的ph为5.2；
60.取成熟的nip种子，去除颖壳后用70％乙醇消毒1min，无菌水冲洗3遍；再用2％有效氯的次氯酸钠溶液振荡消毒60min，无菌水冲洗5遍，然后在无菌条件下分离出幼胚，接种在n6d2s2培养基上，于28℃暗培养4天，诱导得到愈伤组织；所述n6d2s2培养基以n6培养基为基础培养基(购自海博生物，货号为hbz0601-2)，还仅含有水解酪蛋白500g/l、蔗糖30g/l，2,4-d 2mg/l、植物凝胶2.5g/l、潮霉素50mg/l和头孢霉素300mg/l，所述n6d2s2培养基的ph值为5.8；
61.将所述愈伤组织侵入所述aam-as重悬液中侵染20min，用无菌滤纸吸干后转移到n6d2c培养基上，25℃暗培养3天，得到侵染后的愈伤组织；所述n6d2c培养基以n6培养基为基础培养基，还仅含有水解酪蛋白500g/l、蔗糖30g/l，2,4-d 2mg/l、植物凝胶2.5g/l、葡萄糖10g/l和乙酰丁香酮100μmol/l，所述n6d2c培养基的ph值为5.2；
62.将所述侵染后的愈伤组织用含300mg/l头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至n6d2s1培养基上，筛选一代；所述n6d2s1培养基以n6培养基为基础培养基，还仅含有水解酪蛋白500g/l、蔗糖30g/l，2,4-d 2mg/l、植物凝胶2.5g/l、潮霉素25mg/l和头孢霉素600mg/l，所述n6d2s1培养基的ph值为5.8；
63.两周后，转移至n6d2s2培养基上筛选二代，每两周一代，取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至预分化培养基上，在分化培养箱中，以12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃的条件培养7天；然后转移至分化培养基上，在分化培养箱中，以12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃的条件培养至产生再生苗；所述预分化或分化培养基的配方均为：以ms培养基为基础培养基，还仅含有水解酪蛋白300g/l、潮霉素50mg/l、6-ba 3mg/l、6-kt 3mg/l、6-zt 0.2mg/l和植物凝胶2.5g/l；所述预分化培养基或分化培养基的ph均为5.8；
64.将所述再生苗转移至生根壮苗培养基上，在12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃的条件下进行生根壮苗；所述生根壮苗培养基的组成为：1/2ms培养基为基础培养基，加入蔗糖10g/l；
65.待小苗长至10厘米时，打开容器封口膜3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，得到植株备用；
66.取所述植株叶片用液氮研磨成粉末，加入600μltps dna提取液，充分混匀，65℃水浴15min，期间颠倒混匀3次，12000rpm室温离心10min；所述tps dna提取液由以下组分组成：1m tris-hcl、0.5m edta和5m kcl；
67.接着吸取300μl上清液加入等体积异丙醇，混合摇匀，静置10min后，12000rpm室温离心10min，弃上清；加入500μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm室温离心5min弃上清，超净台吹干沉淀；加入50μl ddh2o溶解dna，从而获得植株gdna；
68.利用潮霉素序列引物hyg-f和hyg-r，通过2
×
rapid taqmastermix(购自vazyme，货号为p222-01)进行基因组pcr扩增，得到pcr产物；所述hyg-f的核苷酸序列如seq id no.6所示：5
’‑
tttctttgccctcggacgagt-3’；所述hyg-r的核苷酸序列如seq id no.7所示：5
’‑
atgaaaaagcctgaactcacc-3’；
69.所述pcr扩增的体系为：10μl 2
×
rapid taq master mix、0.5μl hyg-f(10μm)、0.5μl hyg-r(10μm)、1μl样本dna和8μl ddh2o。
70.所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，重复32个循环；72℃彻底延伸3min。
71.通过琼脂糖凝胶电泳对所述pcr产物进行条带检测，若含有目的条带则初步认定为阳性转基因突变体，筛选得到突变体osbzip82；
72.进一步利用靶标位置序列引物osbzip82-f和osbzip82-r，通过2
×
rapid taq mastermix进行基因组pcr扩增；所述pcr扩增的体系和反应程序同上，区别在于，将hyg-f替换为osbzip82-f，将hyg-r替换为osbzip82-r；所述osbzip82-r的核苷酸序列如seq id no.8所示：5
’‑
tcggtgcttgaattcgct-3’；所述osbzip82-r的核苷酸序列如seq id no.9所示：5
’‑
aatgcccgtgcctgtggt-3’；对pcr产物进行测序，从而确定突变体osbzip82具体突变类型，其中osbzip82为部分片段缺失，在seq id no.2所示的序列中第13bp到第50bp存在38bp片段的缺失(见图2中的a)。
73.将osbzip82的突变体及其野生型日本晴(nip)在0.5mm的cacl2溶液(ph4.5)中黑暗萌发后，选取长势一致的苗子(芽的长度为0.5mm)，分别放置在含有和不含alcl3的cacl2溶液中继续生长3天后观察其根长，并拍照，所述cacl2溶液中cacl2的浓度为0.5mm；所述cacl2溶液的ph为4.5；所述含有alcl3的cacl2溶液中alcl3的浓度为50μm，结果见图2中的b。
74.测量osbzip82的突变体及其野生型日本晴的根长和根尖铝含量，结果见图3和图4，其中，在不含alcl3的cacl2溶液中生长3天后，nip和osbzip82的根长分别为8.4cm和8.6cm；在含有alcl3的cacl2溶液中生长3天后，nip和osbzip82的根长分别为6.5cm和3.0cm。在含有alcl3的cacl2溶液中生长3天后，nip和osbzip82的根尖铝含量分别为157.3269μg/g和212.4144μg/g。
75.由图2～4可知，与野生型水稻品种nip相比，突变体材料osbzip82对铝敏感性增强。
76.综上所述，本发明提供的osbzip82基因是一个能影响水稻耐铝性的关键基因；所述osbzip82基因可为耐铝水稻品种的选育提供基因资源和技术支持。
77.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.水稻osbzip82基因在调控水稻耐铝性中的应用，所述水稻osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控水稻耐铝性包括：通过负调控osbzip82基因的表达来增加水稻的铝敏感性。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻的铝敏感性的性状包括：根长和野生型相比降低，根尖铝含量较野生型增加。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述水稻osbzip82基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.一种靶向水稻osbzip82基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的靶标的核苷酸序列如seq id no.3所示。6.根据权利要求5所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括sgrna-s和sgrna-a；所述sgrna-s的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述sgrna-a的核苷酸序列如seq id no.5所示。7.一种敲除水稻osbzip82基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求5或6所述的sgrna。8.权利要求5或6所述sgrna或权利要求7所述的重组载体在增加水稻铝敏感性中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水稻铝敏感性的性状包括：根长和野生型相比降低，根尖铝含量较野生型增加。10.水稻osbzip82基因或权利要求5或6所述sgrna或权利要求7所述的重组载体在培育转基因水稻中的应用；所述水稻osbzip82基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及水稻OsbZIP82基因在调控水稻耐铝过程中的应用、sgRNA、重组载体及其应用。本发明通过对353个世界核心水稻品种对铝胁迫的响应通过全基因组关联分析鉴定得到了一个控制水稻耐铝性状的关键基因OsbZIP82，进一步通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创建该基因功能缺失的突变体osbzip82，并与野生型日本晴一起铝处理，发现该基因缺失的突变体对铝超级敏感。OsbZIP82基因不仅可用以完善水稻响应铝胁迫的上下游调控网络，同时也为通过杂交和分子标记辅助育种选育耐铝的水稻新材料，最终提高酸性土壤粮食产量，解决日益严重的粮食保障问题提供了一个新思路。个新思路。个新思路。


技术研发人员：沈仁芳 朱晓芳 陶烨
受保护的技术使用者：中国科学院南京土壤研究所
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/9/9