促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶及其制备方法

1.本发明涉及水凝胶制备技术领域，具体涉及一种促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病目前在人群中具有极高的发病率。据估计，全球有超过4.63亿糖尿病患者。研究发现：糖尿病可引起皮肤、血管和神经发生各种病理改变，导致多种并发症的发生，目前尚无理想治疗策略，最终可导致患者残疾甚至死亡。糖尿病导致的伤口愈合不良是最常见的严重并发症之一。该类创面最显著的特点是愈合显著延缓，并伴有较为严重的感染从而影响整体的治疗，最终成为难愈性的溃疡，并由此带来截肢的风险。对于单纯皮肤创面的治疗目前已有多种成熟的方法和措施。但糖尿病代谢异常会导致毛细血管病变，组织局部缺氧及营养供应受阻等问题。同时，创面组织糖分过多蓄积，可使活性氧水平、炎症和外源性细菌滋生显著增加，继而导致组织修复功能受损和局部血管生成减少，进一步影响其各自功能的发挥，愈合诸因素调控失调，最终显著延缓创面修复的整个过程。
3.目前国内外众多研究者大多基于糖尿病皮肤创面特殊的病理特征，从糖尿病皮肤创面部位的局部微环境、抗炎抗菌、血管再生、皮肤再上皮化等方面着手探寻新的治疗策略。糖尿病皮肤创面的早期临床治疗主要是使用保护性敷料、抗生素或其他辅助药物。随着治疗技术的发展，促血管形成、促皮肤愈合的生长因子(如：血小板源性生长因子、神经生长因子、内皮转化生长因子等)甚至是一些多能干细胞逐渐用于糖尿病皮肤创面愈合的研究。近期，多种基于改善糖尿病皮肤创面愈合微环境(抗炎抗氧化、氧及一氧化氮供给、促血管再生等)的药物及策略得以开发和利用，如：局部使用纳米抗氧化酶、铜离子、葡萄糖氧化酶、单宁酸(ta)、二甲双胍(metformin)等金属离子、药物小分子或酶学大分子等。其中单宁酸是一种植物源性多酚化合物，含邻苯二酚结构，具有抗菌、抗氧化、抗糖尿病及促创面愈合等效应；而二甲双胍是目前治疗ii型糖尿病最常用的药物之一，其治疗效果除了可通过减少肝脏葡萄糖输出来降低血糖，还可增强组织对胰岛素的敏感性并促进创面的收缩和再上皮化而促进愈合。尽管如此，目前糖尿病皮肤创面实际治疗效果仍不尽人意，新的有效治疗策略仍有待进一步探索。
4.为了改善以上方法在治疗糖尿病皮肤创面中的治疗效果，一些用于组织再生的薄膜、微纳纤维、水凝胶等三维支架被运用于糖尿病皮肤创面愈合的研究中，并受到越来越多的关注。其中，水凝胶作为一种具有3d多孔网络结构的软材料，由物理或化学交联的聚合物链组成，具有优越的理化及生物学特性。水凝胶不仅可以轻松、快速地粘贴到伤口表面防止细菌等的渗透，还可以释放药物以促进糖尿病皮肤创面愈合。然而，传统水凝胶在促进糖尿病皮肤创面愈合的实际应用中仍有不足。近期虽有糖尿病皮肤创面原位形成或注射形成水凝胶材料的研究报道，对糖尿病皮肤创面愈合也具有一定的治疗成效。但针对糖尿病皮肤创面局部微环境的特殊病理，尤其是涉及到糖尿病皮肤创面愈合的长效机制，以及针对皮肤创面所需的优良力学性能及高效生物粘附性仍难以令人满意。因此，探索一种智能响应
apba加入到二甲双胍、丙烯酰亚胺和丙烯酰阳离子单体体系中；采用自由基引发聚合，利用苯硼酸-邻苯二酚相互作用得到多功能水凝胶载药系统(ta-apba gels-@-metformin，ata-met)。而苯硼酸-邻苯二酚的动态相互作用使得该水凝胶具有优良的自愈性；同时，葡萄糖可竞争性地破坏邻苯二酚与苯硼酸的动态相互作用，使该水凝胶系统糖响应降解而缓释单宁酸及二甲双胍。
22.3、将水凝胶施用于创面时能有效实现湿润组织环境下的高效生物粘附，在前期能起到保水和抗菌杀菌效应；随后响应创面微环境的葡萄糖降解并持续缓慢释放单宁酸及二甲双胍，从而实现全身血糖调控，协同抗菌、抗炎、抗氧化、促进血管新生、胶原沉积及毛囊毛发新生等过程，最终促进糖尿病皮肤创面的愈合。
附图说明
23.图1为本发明制备流程示意图；
24.图2为实施例2制备时水凝胶成胶过程的变化示意图；
25.图3为实施例2所得水凝胶拉伸性能示意图；
26.图4为实施例2所得水凝胶自愈性能示意图；
27.图5为实施例2所得水凝胶粘附性能示意图；
28.图6为实施例2所得水凝胶流变测试时间扫描结果示意图；
29.图7为实施例2所得水凝胶流变测试粘度扫描结果示意图；
30.图8为实施例2所得水凝胶流变测试频率扫描结果示意图；
31.图9为实施例2所得水凝胶流变测试应力扫描结果示意图；
32.图10为实施例2所得水凝胶糖响应释药实验糖响应释放药物结果示意图；
33.图11为huvec细胞与不同浓度材料共培养活死染色结果示意图；
34.图12为huvec细胞与不同组分材料共培养活死染色结果示意图；
35.图13为3t3细胞与不同浓度材料共培养活死染色结果示意图；
36.图14为3t3细胞与不同组分材料共培养活死染色结果示意图；
37.图15为huvec细胞、3t3细胞与不同浓度材料共培养cck8结果示意图；
38.图16为水凝胶促进huvec细胞迁移以及成血管效果示意图；
39.图17为水凝胶抗炎以及促进huvec细胞成血管效果免疫荧光结果示意图；
40.图18为促进huvec细胞成血管时免疫荧光结果半定量分析结果示意图；
41.图19为促进huvec细胞成血管时western blot结果及半定量分析结果示意图；
42.图20为水凝胶抗炎以及调控巨噬细胞极化的效果免疫荧光结果示意图；
43.图21为调控巨噬细胞极化时免疫荧光结果半定量分析结果示意图；
44.图22为调控巨噬细胞极化时western blot结果及半定量分析结果示意图；
45.图23为水凝胶修复糖尿病皮肤缺损的效果示意图；
46.图24为水凝胶修复糖尿病皮肤缺损的效果定量分析示意图；
47.图25为体内创面修复抗菌实验结果示意图；
48.图26为细菌菌落计数结果示意图；
49.图27为细菌相对存活数量结果示意图。
具体实施方式
50.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
51.实施例1
52.一种促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶，其制备方法包括以下步骤：
53.(1)将丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液(270mg/ml)和单宁酸分子的二甲基亚砜溶液(150mg/ml)等体积混合，静置30min以上，得ta-apba复合物；
54.(2)将100μl步骤(1)所得ta-apba复合物加入到1ml丙烯酰胺(450mg/ml)和10μl丙烯基季铵单体的混合溶液中，然后加入10μl过硫酸铵(855mg/ml)和10μl四甲基乙二胺，自由基聚合得糖响应多功能水凝胶载药体系，再置于超纯水中透析纯化5d，真空干燥，最后加入100μm二甲双胍水溶液复性，得促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶。
55.实施例2
56.一种促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶，其制备方法包括以下步骤：
57.(1)将丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液(272mg/ml)和单宁酸分子的二甲基亚砜溶液(152mg/ml)等体积混合，静置30min以上，得ta-apba复合物；
58.(2)将100μl步骤(1)所得ta-apba复合物加入到1ml丙烯酰胺(452.64mg/ml)和10μl丙烯基季铵单体的混合溶液中，然后加入10μl过硫酸铵(857.6mg/ml)和10μl四甲基乙二胺，自由基聚合得糖响应多功能水凝胶载药体系，再置于超纯水中透析纯化5d，真空干燥，最后加入100μm二甲双胍水溶液复性，得促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶。
59.实施例3
60.一种促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶，其制备方法包括以下步骤：
61.(1)将丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液(275mg/ml)和单宁酸分子的二甲基亚砜溶液(155mg/ml)等体积混合，静置30min以上，得ta-apba复合物；
62.(2)将100μl步骤(1)所得ta-apba复合物加入到1ml丙烯酰胺(455mg/ml)和10μl丙烯基季铵单体的混合溶液中，然后加入10μl过硫酸铵(860mg/ml)和10μl四甲基乙二胺，自由基聚合得糖响应多功能水凝胶载药体系，再置于超纯水中透析纯化5d，真空干燥，最后加入100μm二甲双胍水溶液复性，得促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶。
63.实验例
64.1、对实施例2所得促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶载药前后的水凝胶理化性质(如流变、拉伸性能、自愈性能和粘附性能等)进行表征分析，其结果分别如图2-图5所示；用流变仪测试水凝胶的各项力学性能(时间扫描、粘度扫描、频率扫描、应力扫描)，其结果分别如图6-图9所示；随后，将atan-met置于4mg/ml的葡萄糖磷酸缓冲液中(ph＝7.4)进行糖响应释药实验，采用hplc对药物释放行为进行研究，其结果如图10所示。
65.由图2-图3可知，本发明实施例2在制备时合成了ata水凝胶、装载季铵盐与二甲双胍药物的atan-met水凝胶；而所得促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶具有良好的拉伸及自愈合后再拉伸的性能。
66.由图4可知，该水凝胶具有良好自愈性能以及可穿戴自愈合的性能，有助于水凝胶用于活动度较大的关节创面。
67.由图5可知，该水凝胶具有良好粘附性能以及水下粘附的性能，有助于水凝胶在创面出血，渗出液较多的环境下牢固粘附皮肤组织。
68.由图6-图9可知，(图6)时间扫描结果显示：药物装载不会对水凝胶的性能产生显著影响，载药后，储能模量g’与损耗模量g”基本没有变化；(图7)粘度扫描结果显示：药物的装载后粘度略微有所下降，但并无明显差异；(图8)频率扫描结果显示：水凝胶成胶过程中，在频率逐渐增加情况下，储能模量g’与损耗模量g”发生翻转，提示有良好的成胶性；(图9)应力扫描结果显示：水凝胶保持较为良好的力学承压性能；
69.糖响应释放药物结果显示(图10)，在4mg/ml的葡萄糖溶液中可检测到药物释放，72小时药物释放率超过50％，而无糖的溶液中，72小时药物释放率不足10％，释放量非常少；说明该水凝胶具有良好的糖响应释药特性。
70.2、体外水平评价研究：
71.小鼠成纤维细胞(3t3)细胞、人脐静脉内皮细胞(huvec)、小鼠巨噬细胞(raw)作为研究对象；
72.(1)评价水凝胶材料在huvec及3t3细胞系上的生物学安全性效应；具体方法为：利用活死染色的方式，评价材料在huvec细胞以及3t3细胞中的安全性；分别评价不同浓度的材料和不同组分的材料对细胞的安全性。不同浓度的材料分别设置浓度为：atan-met浓度分组为0、7.5mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml；不同组分的材料分别设置为：
①
blank组(空白组)；
②
ata组(不载药组)；
③
atan组(载季铵盐组)；
④
met组(单纯二甲双胍，无水凝胶)；
⑤
ata-met组(载二甲双胍组)；
⑥
atan-met(载季铵盐以及二甲双胍组)。以上各组材料与细胞共同培养1天和7天后，吸弃培养基上清液并用pbs洗涤；将10μl钙黄绿素乙酰氧基甲酯(calcein acetoxymethyl ester，calcein am)和15μl碘化丙啶(propidium iodide，pi)加入10ml pbs溶液中配制成工作液；然后，每个孔中加入1ml染色，避光条件下培养30分钟，在荧光显微镜下观察细胞着色状态，并进行荧光半定量显色分析，其结果如图11-图15所示。其中，图15中，每组柱状图中左侧为huvec细胞，右侧为3t3细胞。
73.由图11-图15可知：(图11)huvec细胞与浓度100mg/ml以内的水凝胶共培养1天没有明显细胞毒性；(图12)huvec细胞与材料(水凝胶浓度12.5mg/ml)不同组分共培养1天，各组分没有明显细胞毒性；(图13)3t3细胞与浓度100mg/ml以内的水凝胶共培养1天没有明显细胞毒性；(图14)huvec细胞与材料(水凝胶浓度12.5mg/ml)不同组分共培养1天，各组分没有明显细胞毒性。图11-图14中，以上不同组分的材料细胞活死染色提示没有差异；说明水凝胶对细胞无毒性。(图15)cck8结果显示：huvec细胞、3t3细胞与浓度100mg/ml以内的水凝胶共培养1天没有明显细胞毒性。最终选择水凝胶浓度为12.5mg/ml。
74.(2)细胞水平上评价该多功能水凝胶载药体系的抗炎抗氧化、促血管生成等效应；
75.诱导huvec成血管实验，水凝胶促进huvec细胞迁移以及成血管效果，其结果如图16；水凝胶抗炎以及促进huvec细胞成血管效果，如图17-图19所示。
76.由图16-图19可知，(图16)atan-met(水凝胶载季铵盐以及二甲双胍组)具有最佳的迁移以及促进血管生成的效果。用lps(10ng/ml)加入培养基，刺激huvec以诱导炎症。加入atan-met(水凝胶载季铵盐以及二甲双胍)后，(图17、图18)免疫荧光结果提示，huvec细胞血管生成相关的vegf蛋白与cd31蛋白荧光表达含量最高，说明atan-met具有最佳促血管生成效果；(图19)western blot结果提示，huvec细胞血管生成相关的vegf蛋白表达含量最
高，提示具有最佳的血管生成效果。
77.(3)细胞水平上评价该水凝胶促进巨噬细胞抗炎m2极化，抑制巨噬细胞促炎m1极化的效果。
78.水凝胶抗炎以及调控巨噬细胞极化的效果，其结果如图20-图22所示。
79.由图20-图21可知，用lps(10ng/ml)刺激raw(巨噬细胞)以诱导巨噬细胞炎症及m1极化。此时巨噬细胞m1极化表达蛋白荧光(inos)荧光强度最强；而加入ata水凝胶以后，有抗炎效果，m1极化标志物荧光强度降低，m2极化表达蛋白标志物(arg1)荧光强度增加；atan-met组(水凝胶载季铵盐以及二甲双胍)的m2极化最显著。
80.由图22可知，western blot结果显示，atan-met组的mmp9以及tnf-α表达含量均最低。以上结果提示atan-met有最显著的抗炎作用以及调控巨噬细胞m2极化的效果。
81.3、体内水平评价研究：
82.使用雄性balb/c小鼠建立糖尿病及其皮肤创面模型，具体方法为：连续两天腹腔注射100mg/kg的链脲佐菌素，继续饲养两周后，测量血糖，并以此建立糖尿病模型，在正常小鼠及糖尿病小鼠背部做0.8
×
0.8cm大小皮肤创面，建立糖尿病皮肤创面的动物模型。
83.(1)评价该糖响应多功能水凝胶载药体系对糖尿病皮肤创面的修复情况。
84.水凝胶修复糖尿病皮肤缺损的效果。造模方法为：首先诱导糖尿病小鼠模型：barb/c小鼠(8周)一次性大剂量腹腔注射stz(链脲佐菌素，60-80mg/kg)，72小时后会出现血糖稳定升高、“三多”症状(多饮、多食和多尿)明显，检测血糖在11.1mmol/l时即制成i型糖尿病模型。然后造创面缺损模型，在小鼠背部皮肤处，用打孔器打出直径1cm的孔，然后用橡胶圈粘贴并固定孔的周围，以防止孔收缩，让皮肤自然生长。动物分为六组：
①
blank组(空白组)；
②
met组(单纯二甲双胍，无水凝胶)；
③
ata组(不载药组)；
④
atan组(载季铵盐组)；
⑤
ata-met组(载二甲双胍组)；
⑥
atan-met(载季铵盐以及二甲双胍组)。术后7天、14天取材；其结果如图23-图24所示。
85.由图23-24可知，术后14天结果，空白组还有较多区域未愈合，周围没有毛发生长；ata组、atan、ata-met组有较好的修复效果，14天有较多区域愈合，ata-met组有一定数量毛发生长；atan-met组修复效果最佳，伤口基本愈合，相比其他组修复总面积最大。且皮肤缺损修复处有较多毛发生长，提示有促进毛囊生成的效果。
86.(2)研究多功能水凝胶的抗菌能力；
87.水凝胶抗菌的效果。动物分为六组：
①
blank组(空白组)；
②
met组(单纯二甲双胍，无水凝胶)；
③
ata组(不载药组)；
④
atan组(载季铵盐组)；
⑤
ata-met组(载二甲双胍组)；
⑥
atan-met(载季铵盐以及二甲双胍组)。各组在皮肤缺损处接种金黄色葡萄球菌。三天后棉签刮取创面表面并涂布于琼脂糖固体细菌培养基中；其结果如图25-图27所示。
88.由图25-图27可知，含有ata水凝胶的组细菌生长显著少于空白对照组，且atan-met组细菌涂布最少。说明atan-met具有抗菌作用。
89.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液和单宁酸分子的二甲基亚砜溶液等体积混合，静置30min以上，得ta-apba复合物；(2)将步骤(1)所得ta-apba复合物加入到丙烯酰胺和丙烯基季铵单体的混合溶液中，然后加入引发剂和催化剂，自由基聚合得糖响应多功能水凝胶载药体系，再置于超纯水中透析纯化5d，真空干燥，最后加入二甲双胍水溶液复性，得促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶。2.如权利要求1所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液浓度为270-275mg/ml，单宁酸分子的二甲基亚砜溶液浓度为150-155mg/ml。3.如权利要求1或2所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液浓度为272mg/ml，单宁酸分子的二甲基亚砜溶液浓度为152mg/ml。4.如权利要求1所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，ta-apba复合物、丙烯酰胺、丙烯基季铵单体、引发剂和催化剂体积比为100μl：1ml：10μl：10μl：10μl。5.如权利要求1所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引发剂为过硫酸铵，所述催化剂为四甲基乙二胺。6.如权利要求1或5所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引发剂浓度为855-860mg/ml。7.如权利要求1所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混合溶液中，所述丙烯酰胺浓度为450-455mg/ml。8.如权利要求1或7所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混合溶液中，丙烯酰胺浓度为452.64mg/ml。9.如权利要求1所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，二甲双胍水溶液浓度为100μm。10.权利要求1-9任一项所述的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶的制备方法制得的促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶。

技术总结
本发明公开了一种促进糖尿病皮肤创面愈合的糖响应水凝胶及其制备方法，涉及水凝胶制备领域。该制备方法包括以下步骤：(1)将丙烯酸苯硼酸单体的二甲基亚砜溶液和单宁酸分子的二甲基亚砜溶液等体积混合，静置30min以上，得TA-APBA复合物；(2)将TA-APBA复合物加入到丙烯酰胺和丙烯基季铵单体的混合溶液中，然后加入引发剂和催化剂，自由基聚合，透析，真空干燥，最后加入二甲双胍水溶液复性，得糖响应水凝胶。本发明的水凝胶具有液体环境下高粘附性，同时具有良好的可拉伸性及自愈性，力学性能优良，还具有糖响应特征，可响应糖尿病皮肤创面局部的高糖微环境，进而缓释具有促创面愈合效应的药物。合效应的药物。合效应的药物。


技术研发人员：罗振宇 付晓雪 周宗科
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/9/9