一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架及其制备方法与流程

1.本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架及其制备方法。


背景技术：

2.人体气管呈中空管道状，由软骨组织、纤维结缔组织和上皮组织组成。软骨组织提供机械强度防止塌陷，软骨环之间的纤维结缔组织给气管提供了较好的灵活度。此外，气管内层由假复层纤毛上皮覆盖，具有气道保护和清除气道分泌物的功能。炎症、外伤及肿瘤等原因引起的气管疾病已日益常见。当侵及下段气管或隆突时，采用端-端吻合的环形气道切除术是最常见的治疗方法。但行长段气管环形切除时，端-端吻合口因张力过高等因素致手术效果较差，并发症、死亡率较高，因而常需行气管替代治疗。
3.目前，临床上对于长段气管病损的治疗手段有限，常用的气管替代方式包括：人工假体气管替代、同种异体气管移植和自体组织重建气管。人工假体气管一般由金属或有机材料制备，但因其组织相容性差，缺少血液供应和上皮组织覆盖，极易引起周围肉芽组织增生，导致闭塞管腔，造成气道感染、狭窄甚至塌陷、破裂；同种异体气管移植时常面临供体缺乏、术后需长期接受免疫抑制治疗的问题，同时，气道手术血运重建困难，易导致移植物坏死、感染甚至危及生命，这也限制了其临床应用；自体组织(如颈部或前臂肌皮瓣)重建的类气管组织在结构和功能上无法完全模拟天然气管，同时，在组织的获取过程中会带来额外的手术创伤。因此，上述三种气管替代物均难以满足临床实际需求。
4.为了克服上述方法的缺陷，组织工程应运而生。组织工程旨在结合细胞生物学、工程材料学和医学，通过多学科技术整合，达到受损组织的修复和衰竭器官的再生。这不仅可以提高治愈率，而且简化了治疗过程，降低了医疗成本。合适的细胞来源(种子细胞)、有效的细胞修饰(生长因子)和恰当的支架支持是组织工程的三大根基。随着支架在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在细胞因子和微环境作用下，在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成机体所需的组织或器官，进而达到损伤组织修复和器官功能重建的目的。在过去几十年中组织工程发展迅速，与再生医学一道，为临床医学的发展注入了新动力，为气管替代治疗指明了新方向。
5.组织工程气管的出现为长段气管修复带来了新的希望。但由于气管不具有单独的供血动脉及引流静脉，血供主要来源于甲状腺和食管周围组织的毛细血管网。因此，如何在移植进入体内之后保持充足的血液供应成为限制其发展的主要因素。目前报道的组织工程气管多为单纯致密软骨管状结构，该软骨管状结构在体外成型后，置于生物体皮下或肌皮瓣部位借助该区域组织血运完成预血管化。但是，此种方法产生的血管绝大部分分布于软骨管外侧壁，基本无法穿透致密的软骨组织到达具有气管上皮组织覆盖的气管内壁。当移植物较短时，血管尚可通过移植气管两端延伸覆盖气管内壁，为管腔内壁结构提供营养代谢支持。但对于长段气管而言，血管无法到达的部分上皮的营养和代谢将无法保证，使得气
管丧失了清洁和防御功能，进而造成感染、炎症、塌陷，严重时甚至威胁生命。
6.传统意义上，免疫系统的主要作用被认为是人体抵御外部环境和病原体的防御系统的一个组成部分。然而，越来越明确的是，组织修复的一个重要部分是有效调节免疫系统。严重损伤后的组织再生需要免疫微环境的动态通量，从促炎微环境转变为抗炎微环境，减轻损伤，清除死亡或受伤的组织，发挥保护功能，增加新生血管生成和营养供应，以帮助组织再生。因此，促炎和抗炎微环境对组织修复和再生过程都至关重要。从引发炎症到消除病原体，巨噬细胞在介导组织修复和再生中发挥着关键作用众所周知，巨噬细胞谱系具有高度的可塑性。m1巨噬细胞是促炎亚型，过度表达炎症基因，而m2极化巨噬细胞是有益的。m1到m2表型的转化诱导了炎症期到组织修复期的进展。
7.槲皮素是广泛存在于天然植物中的一种多酚小分子类黄酮单体化合物。由于其具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、抗血小板聚集和清除自由基等生物学特性。目前，关于槲皮素在组织工程气管中应用的相关报道很少。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明提供了一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架及其制备方法。本发明提供的组织工程仿生气管支架在结构和功能上与天然气管类似，在预血管化过程中产生类似于生理气管的透壁血管结构，并且能实现免疫微环境的调节。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，包括交替设置的软骨环和槲皮丝素环；
11.所述软骨环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的软骨细胞；
12.所述槲皮丝素环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的槲皮素；
13.所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架包括三维丝素蛋白海绵和位于所述三维丝素蛋白海绵内部的丝素蛋白无纺布支架。
14.优选的，所述槲皮丝素环中槲皮素的质量分数为3～5％。
15.优选的，所述具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的外径为0.5～1cm，内径为0.3～0.6cm；所述软骨环和槲皮丝素环的高度独立地为0.1～0.2cm。
16.优选的，所述组织工程仿生气管支架中软骨环的数量大于等于1，槲皮丝素环的数量大于等于2。
17.本发明还提供了上述方案所述的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的制备方法，包括以下步骤：
18.将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架吸附软骨细胞悬浮液后，依次进行孵育和培养，得到软骨环；所述培养在促软骨分化培养液中进行；
19.将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架在槲皮素溶液中浸泡，得到槲皮丝素环；
20.将所述软骨环和所述槲皮丝素环进行交替叠加，得到具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架。
21.优选的，所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架的制备方法包括以下步骤：
22.将丝素蛋白纤维依次进行梳理、针孔固定和脱胶，得到丝素蛋白无纺布支架；
23.将丝素蛋白纤维脱胶后溶解于溴化锂溶液中，得到丝素蛋白纤维溶解液，将所述丝素蛋白纤维溶解液透析后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白多孔泡沫；
24.将所述丝素蛋白多孔泡沫溶解于水中，将所得丝素蛋白多孔泡沫溶液加入所述丝素蛋白无纺布支架中，脱泡后进行冷冻干燥，得到支架前体；
25.将所述支架前体浸泡在异氟醚中进行交联，得到所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架。
26.优选的，所述丝素蛋白多孔泡沫溶液的浓度为1～5wt％；所述交联的时间为8～12h，温度为室温。
27.优选的，所述孵育的条件包括：温度为37℃，co2浓度为5wt％，饱和湿度，孵育时间为4～5h；
28.所述培养的条件包括：温度为37℃，co2浓度为5wt％，饱和湿度，培养时间为14～28天。
29.优选的，所述槲皮素溶液的浓度为3.0～5.3mg/ml，所述在槲皮素溶液中浸泡的时间为18～24h。
30.优选的，所述交替叠加后，还包括将得到具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架进行透壁血管化。
31.本发明提供了一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，包括交替设置的软骨环和槲皮丝素环；所述软骨环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的软骨细胞；所述槲皮丝素环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的槲皮素；所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架包括三维丝素蛋白海绵和位于所述三维丝素蛋白海绵内部的丝素蛋白无纺布支架。丝素蛋白是从蚕丝中提取的独特的天然蛋白质，具有出色的生物相容性、生物降解性、生物可吸收性、低免疫原性和可调机械性能，本发明以无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架为基础，在其上负载软骨细胞或槲皮素，再将所得软骨环和槲皮丝素环进行交替叠加，形成本发明的组织工程仿生气管支架。本发明提供的组织工程仿生气管支架能够在生物体内稳定存在，且在结构和功能上均与天然组织类似，在预血管化过程中能够产生类似于生理气管的透壁血管结构，进而为移植物内层结构提供营养和代谢支持。
32.本发明提供的组织工程仿生气管支架负载有槲皮素，槲皮素可以通过促巨噬细胞向抗炎表型极化调节免疫微环境，拓宽了组织工程气管的应用范畴，促进其走向临床。
附图说明
33.图1为本发明提供的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的构建方式示意图；
34.图2为无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和槲皮丝素支架的实物图(未打孔)；
35.图3为软骨环的实物照片；
36.图4为实施例3中的组织学染色结果；
37.图5为实施例4中体外探究槲皮素对巨噬细胞影响的流式定量结果；
38.图6为实施例5中的甲苯胺蓝染色定量结果；
39.图7为实施例5中pcr软骨相关指标(colii、acan)的检测结果；
40.图8为实施例5中pcr软骨相关指标(sox9、colx)的检测结果；
41.图9为实施例6中成管节点数量(左)和成管长度(右)的测试结果；
42.图10为实施例6中划痕迁移实验的测试结果；
43.图11为实施例7中“三明治”仿生气管模型在兔体内植入4周后的软骨生长情况；
44.图12为长段“环-环”结构组织工程气管移植流程。
具体实施方式
45.本发明提供了一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，包括交替设置的软骨环和槲皮丝素环；
46.所述软骨环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的软骨细胞；
47.所述槲皮丝素环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的槲皮素；
48.所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架包括三维丝素蛋白海绵和位于所述三维丝素蛋白海绵内部的丝素蛋白无纺布支架。
49.在本发明中，所述槲皮丝素环中槲皮素的质量分数优选为3～5％。
50.在本发明中，所述具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的外径优选为0.5～1cm，内径优选为0.3～0.6cm，壁厚优选为0.2～0.4cm；所述软骨环和槲皮丝素环的高度独立地的优选为0.1～0.2cm；本发明对所述组织工程仿生气管支架的长度没有特殊要求，可以根据实际需求进行设置。
51.在本发明中，所述组织工程仿生气管支架中软骨环的数量优选大于等于1，优选大于等于3，所述槲皮丝素环的数量优选大于等于2，优选大于等于4；在本发明的具体实施例中，可以根据对仿生气管长度的实际需求设置软骨环和槲皮丝素环的数量，如采用2个槲皮丝素环和1个软骨环，以槲皮丝素环-软骨环-槲皮丝素环的顺序排列成“三明治”结构；或者采用4个槲皮丝素环和3个软骨环，按照槲皮丝素环-软骨环-槲皮丝素环-软骨环
……
槲皮丝素环的顺序进行排列，形成长段组织工程仿生气管。图1为本发明提供的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的构建方式示意图。
52.本发明还提供了上述方案所述的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的制备方法，包括以下步骤：
53.将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架吸附软骨细胞悬浮液后，依次进行孵育和培养，得到软骨环；所述培养在促软骨分化培养液中进行；
54.将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架在槲皮素溶液中浸泡，得到槲皮丝素环；
55.将所述软骨环和所述槲皮丝素环进行交替叠加，得到具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架。
56.首先对所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架的制备方法进行说明。
57.在本发明中，所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架的制备方法优选包括以下步骤：
58.将丝素蛋白纤维依次进行梳理、针孔固定和脱胶，得到丝素蛋白无纺布支架；
59.将丝素蛋白纤维脱胶后溶解于溴化锂溶液中，得到丝素蛋白纤维溶解液，将所述丝素蛋白纤维溶解液透析后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白多孔泡沫；
60.将所述丝素蛋白多孔泡沫溶解于水中，将所得丝素蛋白多孔泡沫溶液加入所述丝素蛋白无纺布支架中，脱泡后进行冷冻干燥，得到支架前体；
61.将所述支架前体浸泡在异氟醚中进行交联，得到所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架。
62.本发明将丝素蛋白纤维依次进行梳理、针孔固定和脱胶，得到丝素蛋白无纺布支架。在本发明中，所述丝素蛋白纤维的长度优选为55mm，所述梳理优选采用梳理机进行，通过梳理机将丝素蛋白纤维切开梳理，并分层拍打形成纤维网；本发明对所述针孔固定的操作方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可，通过真空固定在纤维网表面和内部产生纤维缠结，使蓬松的纤维网变成增强的非织造布；所述脱胶用脱胶液优选为碳酸钠溶液，所述碳酸钠溶液的浓度优选为0.01～0.03m，更优选为0.02m，所述脱胶优选在煮沸条件下进行，所述煮沸的时间优选为1～3h，更优选为2h；脱胶完成后优选采用蒸馏水清洗，然后干燥。在本发明的具体实施例中，优选将干燥后的丝素蛋白无纺布支架切割成直径为0.5～1cm的圆柱形备用。
63.本发明将丝素蛋白纤维脱胶后溶解于溴化锂溶液中，得到丝素蛋白纤维溶解液，将所述丝素蛋白纤维溶解液透析后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白多孔泡沫。在本发明中，所述脱胶的方法和条件和上述方案相同，在此不再赘述；所述溴化锂溶液的浓度优选为9～10m，更优选为9.3m；所述丝素蛋白纤维溶解液中丝素蛋白纤维的浓度优选为1～5w/v％，更优选为1w/v％、3w/v％和5w/v％；所述透析用溶剂优选为蒸馏水，所述透析用透析管优选为苯甲酰化透析管，所述透析的时间优选为48h，透析过程中优选每6h更换一次蒸馏水，所述透析用透析袋的截留分子量优选为14～42kda；所述冷冻干燥的温度优选为-60℃。
64.得到丝素蛋白多孔泡沫后，本发明将所述丝素蛋白多孔泡沫溶解于水中，将所得丝素蛋白多孔泡沫溶液加入所述丝素蛋白无纺布支架中，脱泡后进行冷冻干燥，得到支架前体。在本发明中，所述水优选为蒸馏水，所述所述丝素蛋白多孔泡沫溶液的浓度优选为1～5wt％，更优选为4wt％；本发明优选先将丝素蛋白无纺布支架置于24孔板中，然后再向24孔板中滴加丝素蛋白多孔泡沫溶液，所述丝素蛋白多孔泡沫溶液的用量以滴加到溶液高度为0.15～0.2cm为准；所述脱泡优选在静置条件下进行，所述脱泡的温度优选为4℃，所述脱泡的时间优选为6h；脱泡后，本发明优选将体系静置12～24h，然后再进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为-60℃，时间优选为48h。
65.得到支架前体后，本发明将所述支架前体浸泡在异氟醚中进行交联，得到所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架。在本发明中，所述交联的时间优选为8～12h，温度优选为室温；本发明对所述异氟醚的用量没有特殊要求，能够将支架前体浸没即可；交联完成后，优选将所得无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架进行清洗和干燥；本发明通过交联增强支架的强度。
66.得到无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架后，本发明优选采用打孔器对所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架进行打孔，以形成环状结构。
67.得到无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架后，本发明将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架吸附软骨细胞悬浮液，然后依次进行孵育和培养，得到软骨环。在本发明中，所述软
骨细胞悬浮液的浓度优选为1
×
108/ml；本发明对所述软骨细胞悬浮液的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可，在本发明的具体实施例中，是从家兔的耳软骨中进行提取和扩增得到；本发明优选将软骨细胞悬浮液挤压至无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中，使支架充分吸收。
68.在本发明的具体实施例中，吸附软骨细胞悬浮液前，优选先将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架依次进行酒精浸泡、紫外光照、pbs缓冲液清洗和含有血清dmem培养液冲洗，采用含有血清dmem培养液冲洗完毕后，优选使用吸引器将支架附着的培养液吸干；所述酒精的体积分数优选为75％，酒精浸泡的时间优选为30min，所述紫外管照射的时间优选为30min。
69.在本发明中，所述孵育的条件优选包括：温度为37℃，co2浓度为5wt％，饱和湿度，孵育时间为4～5h；本发明通过孵育使软骨细胞稳定贴附于支架；所述培养在促软骨分化培养液中进行。
70.在本发明中，所述培养的条件优选包括：温度为37℃，co2浓度为5wt％，饱和湿度，培养时间为14～28天；培养过程中优选隔日换液；本发明通过培养使软骨细胞分泌充足的基质。
71.本发明将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架在槲皮素溶液中浸泡，得到槲皮丝素环。在本发明中，所述槲皮素溶液的浓度优选为3～5.3mg/ml，所述浸泡的时间优选为18～24h；浸泡完成后进行清洗和干燥。
72.得到软骨环和槲皮丝素环后，本发明将所述软骨环和所述槲皮丝素环进行交替叠加，得到具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架。在本发明中，直接将软骨环和所述槲皮丝素环交替放置即可，无需进行其他处理。
73.在本发明中，所述交替叠加后，优选还包括将所得组织工程仿生气管支架进行透壁血管化；所述透壁血管化优选在生物体皮下进行。
74.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
75.实施例1
76.将丝素蛋白纤维切成55mm的长度，然后用梳理机切开梳理，分层拍打制作丝纤维网。然后，将收集到的纤维网通过针孔固定，在垫体表面和内部产生纤维缠结，使蓬松的垫变成增强的非织造布。丝素非织造布用0.02m碳酸钠溶液煮沸2h，彻底脱气，然后用蒸馏水冲洗三次，在60℃的烤箱中干燥，得到丝素蛋白无纺布支架。最后，将丝素蛋白无纺布支架切成直径为8mm的圆柱，以供进一步使用。
77.将丝素蛋白纤维用0.02m碳酸钠溶液煮沸2h，然后用蒸馏水冲洗三次，将脱胶的丝素蛋白纤维溶解在9.3m溴化锂溶液中形成透明溶液，然后在苯甲酰化透析管中用蒸馏水透析48h(每6h更换一次蒸馏水)。将丝素蛋白纤维溶解液进行冷冻干燥，得到丝素蛋白多孔泡沫。
78.将丝素蛋白多孔泡沫溶解在蒸馏水中，制备浓度为4wt％的丝素蛋白多孔泡沫水溶液。将丝素蛋白无纺布支架置于24孔板中，然后将丝素蛋白多孔泡沫水溶液滴入24孔板，
液面高度为0.15cm，随后在4℃下孵育6h释放气泡。将该混合体系过夜，在-60℃冷冻干燥2天，得到支架前体；将所述支架前体浸泡在异氟醚交中联12h，得到无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架。
79.将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架在浓度为5.3mg/ml的槲皮素溶液中浸泡24h，得到槲皮丝素支架。
80.图2为本发明制备的无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和槲皮素支架的实物图(未打孔)，其中左侧为无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架，呈白色，右侧为槲皮丝素支架，呈黄色。
81.实施例2
82.家兔麻醉或处死后减下兔耳，剥离兔耳皮肤，并剔除软骨组织周围纤维膜，随后切碎成1mm
×
1mm大小，加入15％ⅱ型胶原酶，37℃条件下消化24h，期间震荡吹打数次，0.22μm无菌滤网过滤，离心、洗涤、细胞重悬、计数，以1.0
×
104/cm2细胞密度接种到10cm2培养皿；在37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养，第3天首次换液，以后隔日换液。细胞基本铺满培养皿时，加入胰酶消化液约1.5ml，镜下见细胞胞质回缩、形态变圆后，加入dmem培养液(含血清)终止消化，收集细胞，离心后重悬细胞，随后以1.0
×
104/cm2细胞密度接种于新的10cm2培养皿，重复上述步骤细胞扩增到第2代时，培养3-5天待细胞铺满培养皿后收集细胞将细胞计数，调整软骨细胞悬液浓度至1
×
108/ml。
83.将实施例1制备的无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架打孔，将所得支架环直接置于75％酒精中浸泡30min，使用紫外光照射30min，pbs反复冲洗2～3次，使用含有血清dmem培养液(含血清)冲洗1次，之后用吸引器将支架附着的培养液吸干；
84.将软骨细胞悬液挤压至无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架环上，使支架充分吸收，在37℃，5％co2，饱和湿度条件孵育4～5h，待软骨细胞和支架稳定贴附后，缓慢加入促软骨分化培养液，在37℃，5％co2，饱和湿度条件下继续培养，隔日换液，在培养液中培养2周，得到软骨环。
85.图3为本实施例所得软骨环的实物图。
86.实施例3
87.其他条件和实施例1相同，仅将其中丝素蛋白多孔泡沫水溶液的浓度改为1％、3％和5％，制备得到三种无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架；
88.按照实施例2中的方法，分别在三种无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中接种软骨细胞，在体外37℃、5％co2条件下培养28天，染色观察丝素蛋白浓度对于软骨生长的影响。
89.研究结果表明，当丝素蛋白多孔泡沫水溶液的浓度为3％时，对软骨生长的促进效果最好，即3％的最佳浓度。图4为丝素蛋白多孔泡沫水溶液浓度为3％的实验组的组织学染色结果。从图4中he、so、ab、col2的染色结果可以看到成熟的软骨陷窝，糖胺聚糖(软骨基质)的分泌以及软骨特征性ⅱ型胶原。
90.实施例4
91.体外验证槲皮素对于免疫微环境的调节作用：实验共分为5组，第一组采用全培处理巨噬细胞，第二组采用添加有lps的全培(其中lps的浓度为1mg/ml)处理巨噬细胞，第三组采用添加有白介素4和白介素13的全培(其中白介素4的浓度为10μm，白介素13的浓度为
10μm)处理巨噬细胞，第四组采用添加有槲皮素的全培(其中槲皮素的浓度为10μm)处理巨噬细胞；第五组采用添加有lps和槲皮素的全培(其中lps的浓度为1μg/ml，槲皮素的浓度为20μm)处理巨噬细胞。
92.通过流式分析5组实验条件下对于巨噬细胞表型的影响，结果如图5所示，图5中左侧的图为不同实验条件处理后m1型巨噬细胞的比例；右侧图为不同实验条件处理后m2型巨噬细胞的比例。图5中的结果表明，在槲皮素存在条件下体外培养巨噬细胞，能够促进其向m2(抗炎)表型极化。
93.实施例5
94.探索培养条件形成的不同免疫微环境对于软骨细胞的作用与影响，具体如下：利用transwell模型，在上室接种巨噬细胞，并在下室接种软骨细胞，随后在transwell孔中加入不同培养液(采用的培养液和实施例4中的5种培养液相同)，以此方式形成巨噬-软骨细胞共培养体系，7天后行甲苯胺蓝染色定量及pcr软骨相关指标(colii,sox9,acan,colx)检测。
95.图6为甲苯胺蓝染色定量结果。图6中的结果表明，槲皮素诱导的局部免疫微环境能够促进软骨发育。
96.图7为pcr软骨相关指标(colii、acan)的检测结果，图8为pcr软骨相关指标(sox9、colx)的检测结果。图7～8中的结果表明，软骨相关基因表达上调，软骨纤维化及肥大相关基因表达下调，证明槲皮素培养条件下形成的免疫微环境促进软骨基质分泌，抑制软骨细胞肥大及纤维化。
97.实施例6
98.测试不同免疫微环境对于内皮细胞的作用与影响，具体如下：
99.内皮细胞成管实验：利用transwell模型，在上室以20万/孔接种巨噬细胞，同时将matrigel1ml铺于transwell模型下室，1h后将内皮细胞以6～8万/孔的密度接种于matrigel，随后在transwell孔中加入不同培养液(采用的培养液和实施例4中的5种培养液相同)，6小时后对内皮细胞成血管情况进行观察，对成管节点数量、成管长度进行定量；
100.图9为成管节点数量(左)和成管长度(右)的测试结果。图9中的结果表明，槲皮素培养条件下的免疫微环境对于内皮细胞成血管起到促进作用。
101.划痕迁移实验：transwell模型，在上室以20万/孔接种巨噬细胞，内皮细胞以30万/孔的密度接种于下室，200微升枪头划出均匀垂直细胞空留空间，随后在transwell孔中加入不同培养液(采用的培养液和实施例4中的5种培养液相同)，并在6h、12h、24h后进行观察内皮细胞迁移情况，定量划痕残余面积。
102.划痕迁移实验的测试结果如图10所示。图10中的结果表明，槲皮素诱导的局部免疫微环境能够促进内皮细胞成管、迁移，从而促进血管再生。
103.实施例7
104.在软骨环(按照实施例2的方法制备)上下分别放置一个槲皮素丝素环(按照实施例1的方法制备并打孔)，得到“三明治”仿生气管模型，将所得“三明治”仿生气管模型移植进入兔体内2周、4周，取样分析软骨生长情况，并观察透壁血管是否成功出现及周围组织炎症浸润程度。图11为“三明治”仿生气管模型在兔体内植入4周后的软骨生长情况，结果表明，在体内放置4周后，软骨结构保持较好，并且槲皮素环促进周围组织浸润进行血管化，能
看到环-环结构的保留。
105.实施例8
106.采用3个软骨环(按照实施例2的方法制备)以及4个槲皮丝素环(按照实施例1的方法制备并打孔)交替叠加，形成长段“环-环”结构组织工程气管，将长段“环-环”结构组织工程气管包埋至兔体内进行预血管化2周，预血管化完成后进行气管节段替代，从而完成体内组织工程气管可行性验证。图12为长段“环-环”结构组织工程气管移植流程，其中左侧的图为长段“环-环”结构组织工程气管移植前大体外观，中间的图为长段“环-环”结构组织工程气管手术过程中体内端端吻合图片；右侧的图为气管移植6周后，长段组织工程气管取样大体图片。图12中的结果表明，组织工程气管成功移植，实验动物存活超过一个月，并且气管生物相容性良好，保持较为出色的力学性能。
107.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，其特征在于，包括交替设置的软骨环和槲皮丝素环；所述软骨环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的软骨细胞；所述槲皮丝素环包括无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架和负载在所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架中的槲皮素；所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架包括三维丝素蛋白海绵和位于所述三维丝素蛋白海绵内部的丝素蛋白无纺布支架。2.根据权利要求1所述的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，其特征在于，所述槲皮丝素环中槲皮素的质量分数为3～5％。3.根据权利要求1所述的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，其特征在于，所述具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的外径为0.5～1cm，内径为0.3～0.6cm；所述软骨环和槲皮丝素环的高度独立地为0.1～0.2cm。4.根据权利要求1所述的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架，其特征在于，所述组织工程仿生气管支架中软骨环的数量大于等于1，槲皮丝素环的数量大于等于2。5.权利要求1～4任意一项所述的具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架吸附软骨细胞悬浮液后，依次进行孵育和培养，得到软骨环；所述培养在促软骨分化培养液中进行；将无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架在槲皮素溶液中浸泡，得到槲皮丝素环；将所述软骨环和所述槲皮丝素环进行交替叠加，得到具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架的制备方法包括以下步骤：将丝素蛋白纤维依次进行梳理、针孔固定和脱胶，得到丝素蛋白无纺布支架；将丝素蛋白纤维脱胶后溶解于溴化锂溶液中，得到丝素蛋白纤维溶解液，将所述丝素蛋白纤维溶解液透析后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白多孔泡沫；将所述丝素蛋白多孔泡沫溶解于水中，将所得丝素蛋白多孔泡沫溶液加入所述丝素蛋白无纺布支架中，脱泡后进行冷冻干燥，得到支架前体；将所述支架前体浸泡在异氟醚中进行交联，得到所述无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白多孔泡沫溶液的浓度为1～5wt％；所述交联的时间为8～12h，温度为室温。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的条件包括：温度为37℃，co2浓度为5wt％，饱和湿度，孵育时间为4～5h；所述培养的条件包括：温度为37℃，co2浓度为5wt％，饱和湿度，培养时间为14～28天。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述槲皮素溶液的浓度为3.0～5.3mg/ml，所述在槲皮素溶液中浸泡的时间为18～24h。10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述交替叠加后，还包括将得到具有
微环境调节功能的组织工程仿生气管支架进行透壁血管化。

技术总结
本发明涉及医用材料技术领域，提供了一种具有微环境调节功能的组织工程仿生气管支架及其制备方法。本发明以无纺布增强三维丝素蛋白海绵支架为基础，在其上负载软骨细胞或槲皮素，再将所得软骨环和槲皮丝素环进行交替叠加，形成本发明的组织工程仿生气管支架。本发明提供的组织工程仿生气管支架能够在生物体内稳定存在，且在结构和功能上均与天然组织类似，在预血管化过程中能够产生类似于生理气管的透壁血管结构，进而为移植物内层结构提供营养和代谢支持，并且，槲皮素可以通过促巨噬细胞向抗炎表型极化调节免疫微环境，拓宽了组织工程气管的应用范畴，促进其走向临床。促进其走向临床。促进其走向临床。


技术研发人员：潘子寅 陈昶 李大伟 孙维言 汤海 林蔚康 陈羿 白清峰 汪磊
受保护的技术使用者：上海市肺科医院（上海市职业病防治院）
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/9/9