一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法与流程

1.本发明属于细胞悬液制备技术领域，具体为一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法。


背景技术：

2.肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,遗传物质受损，导致特定细胞失去对正常生长调控,引起其克隆性异常增生而形成的恶性赘生物。随着单细胞分离技术及单细胞测序技术日益成熟,单个肿瘤细胞全基因组测序已成为肿瘤研究的一个崭新的领域。肿瘤尤其是恶性肿瘤已成为威胁人类健康的最严重疾病之一，常表现为局部肿块。肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因之一,相同的治疗方案在同一肿瘤患者之间的疗效差异很大,造成这一现象的原因是恶性肿瘤之间的分子分型存在差异。随着精准医疗时代的到来,循环肿瘤细胞(ctc)检测技术应运而生,人类对恶性肿瘤的检测达到单细胞水平。通过单个肿瘤细胞的测序，我们可以更加直接的了解肿瘤的起源、肿瘤的生长规律，以及认识各种肿瘤细胞之间以及个体之间存在差异的起因和解释肿瘤产生的机制。我们研究各类肿瘤细胞的基因组图谱，希望找出恶性细胞在基因组水平是否存在统一结构，但是面对肿瘤异质性的这些问题仍然束手无策。同时肿瘤的异质性是导致肿瘤耐药性问题的原因。如果能从单个肿瘤细胞水平对肿瘤单细胞进行测序，并找出一个肿瘤在单个细胞上的共同结构，揭露出每个肿瘤细胞的突变规律，这将为药物研究、肿瘤的靶向治疗提供基础。当然，必须首先对大量的肿瘤细胞基因组完成测序工作，只有在发现了功能突变位点之后，单个肿瘤基因组测序才能为肿瘤治疗提供帮助。虽然目前出现了一系列的细胞分离技术，例如高级流式细胞术，利用肿瘤标志物分离肿瘤细胞，但是前提是需要把肿瘤组织解离成高质量的单细胞悬液，而面对不同部位的肿瘤组织得到高质量的单细胞悬液是目前分离肿瘤细胞的限制因素。
3.本发明基于肿瘤组织的特点，研发了肿瘤组织消化解离制备单细胞悬液的方案。采用本发明消化解离肿瘤组织，实验结果发现制备的单细胞样本质量符合单细胞测序的要求。因此，在本技术的基础上可以拓展对肿瘤单细胞研究的层面，广泛应用于单细胞测序领域以及生物医疗领域。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，
6.s1.在离心管中用配置dmem配制解离混合酶；
7.s2.将肿瘤组织转移至加入dmem培养基的培养皿中并将肿瘤外的非目标组织剔除干净，再肿瘤组织剪切成2mm直径大小的组织块，用pbs缓冲液清洗1-2次；
8.s3.吸取肿瘤组织颗粒至配制好解离混合酶的离心管中并封口，置于恒温水浴震荡仪中孵育15-30min，每5min用宽口枪头吹打组织一轮，每轮吹打6-10次，质满足收集需求时，酶液依次过70μm和30μm细胞筛，后将酶液离心富集细胞，用含1％ fbs的培养基重悬细胞；
9.s4.将酶液4℃500g离心5分钟富集细胞，弃上清获取细胞沉淀；
10.s5.用pbs缓冲液或培养基重悬细胞沉淀后计数，判断细胞质量，如果有小碎片可用5％ fbs清洗一次。
11.优选的，所述pbs缓冲液不含钙离子和镁离子。
12.优选的，s4中的培养基为rpmi-1640培养基或高糖型dmem培养基。
13.优选的，所述解离混合酶为由胶原酶和中性蛋白酶组成的混合酶。
14.优选的，所述解离混合酶由以下5种酶混合构成：
15.终浓度为0.5mg/ml的胶原蛋白酶ⅰ，
16.终浓度为0.4mg/ml的胶原蛋白酶ⅱ，
17.终浓度为0.5mg/ml的中性蛋白酶，
18.终浓度为0.8mg/ml的链霉蛋白酶，
19.终浓度为0.5mg/ml的dnaseⅰ。
20.优选的，s3中，孵育的过程中，取孵育10分钟的酶液上清计数，如细胞数目不满足收集需求，须继续消化15min。
21.优选的，s3中，针对质地坚硬的肿瘤组织没轮吹打8-10次。
22.优选的，其在肿瘤单细胞的富集、单细胞测序、构建动物模型、构建细胞系、原代细胞培养和cat治疗上的应用。
23.本发明的有益效果如下：
24.本发明通过高质量肿瘤单细胞悬液制备方法富集的肿瘤单细胞具有总量多、活率高、有核率高，结团率低的特点，其推动了肿瘤单细胞测序，细胞培养方面的研究；保留了肿瘤组织的细胞异质性，解决了由肿瘤组织获取高质量单细胞悬液，全面兼容肿瘤细胞类型的难题，为研究肿瘤单细胞基因表达提供了新的技术助力，降低了肿瘤样本研究成本，加快肿瘤科疾病相关的研究。
附图说明
25.图1为本发明单细胞悬液制备方法流程图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.如图1所示，本发明实施例提供了一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，按照以下步骤进行：
28.步骤一、酶液的配制，准备一个15ml离心管，在15ml离心管中用dm em配制解离混
合酶。混合酶中胶原蛋白酶ⅰ的终浓度为0.5mg/ml、胶原蛋白酶ⅱ的终浓度为0.4mg/ml、中性蛋白酶的终浓度为0.5mg/ml、链霉蛋白酶的终浓度为0.8mg/ml、dnase i的终浓度为0.5mg/ml；
29.步骤二、将肿瘤组织转移至加入dmem培养基的培养皿中，用显微剪将肿瘤外的非目标组织剔除干净；将清洗后的肿瘤组织剪切成约2mm直径大小的组织块，pbs清洗1-2次。
30.步骤三、用宽口枪头或巴氏吸管吸取肿瘤组织颗粒至配制好的混合酶中，用封口膜封口，置于恒温水浴震荡仪中37℃100rpm孵育15分钟，观察酶液浑浊情况和组织情况。取孵育第15分钟的酶液上清计数，如细胞数目不满足收集需求，需继续消化15min，每5min用宽口枪头吹打组织一轮，每轮吹打6次，质地坚硬的肿瘤组织每轮吹打8～10。满足收集需求时，酶液依次过70μm和30μm细胞筛。后将酶液离心富集细胞，用含1％ fbs的培养基(rpm i-1640或dmem)重悬细胞。
31.步骤四、将酶液4℃500g离心5分钟富集细胞，弃上清获取细胞沉淀。
32.步骤五、用pbs缓冲液或培养基重悬细胞沉淀后计数，判断细胞质量，如果有小碎片可用5％fbs清洗一次；
33.上述技术方案为培养基或缓冲液对肿瘤组织的清洗、酶液对肿瘤组织的消化、培养基或缓冲液对肿瘤细胞悬液的清洗、培养基或缓冲液对肿瘤细胞的重悬以及细胞计数和细胞质量判断。清洗及去除掉肿瘤外的红细胞以及其他组织，避免其他组织细胞的干扰；用同种混合酶对不同部位的肿瘤组织进行消化解离成单细胞，减少因肿瘤发生部位不同而造成的解离方案的差异；解离制备的单细胞用培养基或缓冲液对其进行去碎片的清洗后，离心得到肿瘤细胞沉淀；培养基或缓冲液重悬肿瘤细胞，重悬后的细胞通过细胞计数仪对其进行计数及质量判断，质控是得到高质量肿瘤单细胞悬液样本的必要环节。最后得到的高质量肿瘤单细胞悬液可用于下游细胞培养、单细胞测序等实验。
34.其中的缓冲液为pbs缓冲液，该缓冲液应不含钙离子及镁离子等二价阳离子。
35.其中，培养基为roswell park memorial institute(rpmi)1640培养基或高糖型dmem培养基。
36.其中，解离混合酶液为由胶原酶和中性蛋白酶组成的混合酶。
37.其中，细胞计数仪为上海睿钰生物科技有限公司的countstar rigel s2全自动细胞荧光分析仪。
38.其中，高质量肿瘤单细胞悬液制备方法能实现肿瘤单细胞的富集，并适用于单细胞测序，原代细胞培养，构建动物模型、构建细胞系，cat治疗领域的应用。
39.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
40.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s1.在离心管中用配置dmem配制解离混合酶；s2.将肿瘤组织转移至加入dmem培养基的培养皿中并将肿瘤外的非目标组织剔除干净，再肿瘤组织剪切成2mm直径大小的组织块，用pbs缓冲液清洗1-2次；s3.吸取肿瘤组织颗粒至配制好解离混合酶的离心管中并封口，置于恒温水浴震荡仪中孵育15-30min，每5min用宽口枪头吹打组织一轮，每轮吹打6-10次，质满足收集需求时，酶液依次过70μm和30μm细胞筛，后将酶液离心富集细胞，用含1％fbs的培养基重悬细胞；s4.将酶液4℃500g离心5分钟富集细胞，弃上清获取细胞沉淀；s5.用pbs缓冲液或培养基重悬细胞沉淀后计数，判断细胞质量，如果有小碎片可用5％fbs清洗一次。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：所述pbs缓冲液不含钙离子和镁离子。3.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s4中的培养基为rpmi-1640培养基或高糖型dmem培养基。4.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：所述解离混合酶为由胶原酶和中性蛋白酶组成的混合酶。5.根据权利要求5所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：所述解离混合酶由以下5种酶混合构成：终浓度为0.5mg/ml的胶原蛋白酶ⅰ，终浓度为0.4mg/ml的胶原蛋白酶ⅱ，终浓度为0.5mg/ml的中性蛋白酶，终浓度为0.8mg/ml的链霉蛋白酶，终浓度为0.5mg/ml的dnaseⅰ。6.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s3中，孵育的过程中，取孵育10分钟的酶液上清计数，如细胞数目不满足收集需求，须继续消化15min。7.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，其特征在于：s3中，针对质地坚硬的肿瘤组织没轮吹打8-10次。

技术总结
本发明属于细胞悬液制备技术领域，且公开了一种肿瘤组织高质量单细胞悬液制备的方法，S1.在离心管中用配置DMEM配制解离混合酶；S2.将肿瘤组织转移至加入DMEM培养基的培养皿中并将肿瘤外的非目标组织剔除干净，再肿瘤组织剪切成2mm直径大小的组织块，用PBS缓冲液清洗1-2次；S3.吸取肿瘤组织颗粒至配制好解离混合酶的离心管中并封口，置于恒温水浴震荡仪中孵育15-30min，每5min用宽口枪头吹打组织一轮，每轮吹打6-10次，质满足收集需求时，酶液依次过70μm和30μm细胞筛，后将酶液离心富集细胞，用含1％FBS的培养基重悬细胞；S4.将酶液4℃500g离心5分钟富集细胞，弃上清获取细胞沉淀。本发明富集的肿瘤单细胞具有总量多、活率高、有核率高，结团率低的特点。结团率低的特点。结团率低的特点。


技术研发人员：王国荣 张朝政 潘越 杜尧 杨晶文
受保护的技术使用者：上海新开源精准医疗有限公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/9