MKRN1、SNIP1在结直肠癌诊断及预后方面的应用

mkrn1、snip1在结直肠癌诊断及预后方面的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体是mkrn1、snip1在结直肠癌诊断及预后方面的应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer,crc)是全球第三大常见的恶性肿瘤。全球年发病人数超过100万，在发达国家的死亡率更是高达33％。且该病的患者人群逐渐趋向年轻化。crc的转移是影响生存率的最大因素。大约四分之一的患者在诊断时就已经伴随有转移的发生，这直接导致了crc患者整体的不良预后和较高死亡率。因此，了解crc转移进展的潜在分子机制，寻找crc患者预后情况判断的关键标志物以及预后情况判断的试剂至关重要。
3.目前国内外暂无e3泛素连接酶mkrn1和smad核内相互作用蛋白1(snip1)在crc发生发展中，尤其是mkrn1、snip1与crc迁移及侵袭之间关系的报道，因此，确定mkrn1、snip1在crc组织中的表达水平及mkrn1、snip1的潜在预后价值，特别是mkrn1、snip1与crc侵袭转移的关系及分子机制，以及着重研究mkrn1、snip1对crc细胞迁移及侵袭的影响，为crc的诊断和治疗寻找新的靶点，是目前研究的重点方向，具有十分重要的现实意义。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供mkrn1、snip1在结直肠癌诊断及预后方面的应用。具体是通过以下技术方案得以实现的：
5.mkrn1在结直肠癌预后方面的应用。
6.进一步的，所述结直肠癌预后方面，是以mkrn1作为结直肠癌预后标志物方面。
7.进一步的，所述结直肠癌预后方面，是以mkrn1作为结直肠癌预后情况判断的试剂或试剂盒方面。
8.进一步的，所述结直肠癌预后，是结直肠癌转移方面的预后。所述结直肠癌转移方面的预后，具体是当mkrn1表达量高于正常值时，结直肠癌转移的可能性升高，当mkrn1表达量正常或偏低时，结直肠癌转移的可能性降低。如果mkrn1表达量突然增高或检测水平升高时，提示患肿瘤的可能性增加或者肿瘤转移复发的可能性加大了。所述mkrn1表达量的正常值，是患者正常结直肠组织(癌旁组织)中mkrn1的表达量。
9.进一步的，所述结直肠癌预后，是结直肠癌发生方面的预后。发生emt会使肿瘤细胞获得间充质表型以及侵袭和转移的能力，从而逃脱原发部位并在全身传播。
10.一种结直肠癌预后评估试剂或试剂盒，含有检测mkrn1的dna/蛋白表达浓度/滴度的有无增高的试剂。mkrn1的检测可以用pcr试剂盒(看dna荧光强度)，也可根据抗原滴度的检测(对应抗原滴度试剂盒检测mknr1是否出现阳性来判断患crc的风险或转移复发的风险)，或免疫组化(肿瘤检测金标准，看蛋白表达含量)。
11.mkrn1在结直肠癌诊断方面的应用，其特征在于，具体是在结直肠癌诊断试剂或试剂盒方面的应用，所述试剂或试剂盒含有检测mkrn1的dna/蛋白表达浓度/滴度的有无增高
的试剂，当mkrn1表达量高于正常值时，存在结直肠癌的可能较高，当mkrn1表达量正常或偏低时，结直肠癌的可能较低。
12.snip1在结直肠癌预后方面的应用。
13.进一步的，所述结直肠癌预后方面，是以snip1作为结直肠癌预后标志物方面。
14.进一步的，所述结直肠癌预后方面，是以snip1作为结直肠癌预后情况判断的试剂或试剂盒方面。
15.进一步的，所述结直肠癌预后，是结直肠癌转移方面的预后。所述结直肠癌转移方面的预后，具体是当snip1表达量高于正常值时，结直肠癌转移的可能性降低，当snip1表达量正常或偏低时，结直肠癌转移的可能性升高。
16.进一步的，所述结直肠癌预后，是结直肠癌发生方面的预后。发生emt会使肿瘤细胞获得间充质表型以及侵袭和转移的能力，从而逃脱原发部位并在全身传播。
17.一种结直肠癌预后评估试剂或试剂盒，含有检测snip1表达量的试剂。
18.snip1在结直肠癌诊断方面的应用，其特征在于，具体是在结直肠癌诊断试剂或试剂盒方面的应用，所述试剂或试剂盒含有检测snip1的dna/蛋白表达浓度/滴度的有无增高的试剂，当snip1表达量低于正常值时，存在结直肠癌的可能较高，当snip1表达量正常或偏高时，结直肠癌的可能较低或预后较好。
19.与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
20.(1)本技术中证实了mkrn1在crc中高表达，且与临床tnm分期呈正相关，高表达mkrn1的crc患者预后更差。说明了mkrn1含量或浓度增加了就有可能患结直肠癌，可以应用于制备结直肠癌诊断试剂/试剂盒。证明了具有高水平mkrn1的crc细胞表现出间充质表型，且能够促进crc细胞的增殖、迁移、侵袭能力和emt进程。并且首次发现mkrn1可作为促癌因子促进crc的进展。
21.(2)本技术中说明了snip1能够抑制crc细胞的emt和迁移能力，证实了沉默snip1能够促进crc细胞的emt和迁移能力，过表达snip1能够抑制crc细胞的emt和迁移能力，高表达snip1的crc患者预后较好。还说明了snip1含量或浓度降低了就有可能患结直肠癌，可以应用于制备结直肠癌诊断试剂/试剂盒。
22.(3)本技术中证实了高表达的mkrn1还可促进crc细胞的侵袭、迁移及emt进程，mkrn1的泛素化底物为snip1，mkrn1可以通过泛素-蛋白酶体途径降解snip1蛋白，而且mkrn1的e3泛素连接酶活性对于mkrn1泛素化降解snip1至关重要。mkrn1通过泛素化降解snip1促进tgf-β信号转导从而诱导了crc的转移。mkrn1可在crc发展的分子机制中发挥独特作用。
23.综上mkrn1、snip1均可以作为预测crc转移的潜在生物标志物及预后指标，有助于crc的治疗。并且，mkrn1/snip1/tgf-β轴可能为crc抗转移药物开发提供新的靶点。确定了mkrn1、snip1可以作为一种癌症标志物或者治疗或者预后判断的指标进行结直肠癌诊断、治疗或预后。
附图说明
24.图1是mkrn1在正常结直肠组织和患癌的结直肠组织中的表达情况对比图，说明了mkrn1在crc中高表达，并与crc患者预后不良有关。其中a.是不同肿瘤细胞系中mkrn1基因
的表达分布，显示了mkrn1子不同肿瘤细胞系和正常结直肠上皮细胞的含量，结果说明在肿瘤中都出现了mkrn1的含量增加，表达增高。b.肿瘤组织和正常组织中mkrn1基因的表达分布，比较肿瘤组织和正常组织中mkrn1基因的表达分布，提示mkrn1含量多的患者预后不良，可能生存时间就更短。c.wb检测mkrn1蛋白在crc组织和配对的癌旁组织中的表达水平，进一步证明了在结直肠癌组织中mkrn1含量很高，而正常的组织中则含量很低。d.采用ihc染色检测结肠炎及不同分期crc患者组织切片中mkrn1的表达，并提供典型照片(scale bar：100μm；scale bar：50μm)。e.从r2基因组分析平台获得mkrn1参与crc患者的预后。f.wb检测mkrn1蛋白在crc细胞系(ht29、hct116、hct15、rko)和正常人结肠成纤维细胞(ccd-18co)中的mkrn1表达水平。n＝3，与对照组比较，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。提升mkrn1可能参与crc患者的预后，高mkrn1的患者预后不良，存活时间短。f.wb检测mkrn1蛋白在crc细胞系(ht29、hct116、hct15、rko)和正常人结肠成纤维细胞(ccd-18co)中的mkrn1表达水平。结果也发现mkrn1在正常结直肠细胞含量很低，基本检测不到，而在结直肠癌细胞中含量则很高，能检测出来，说明mkrn1含量或浓度增加了就有可能患癌，或者手术或化疗治疗后患者肿瘤又复发了，如果检测不到说明患癌的可能性较低或者手术或化疗效果较好，患者生存的时间就可能增加或延长。综合说明mkrn1可以作为一种癌症标志物或者治疗或者预后判断的指标进行结直肠癌诊断、治疗或预后，定期抽血进行检测可以进行预判。
25.图2是构建稳定敲低mkrn1的crc细胞hct116及ht29。其中a.sh1、sh2、sh3经pcr扩增后，pcr产物琼脂糖凝胶电泳图；b-c.分别为sh1、sh2、sh3以及载体ptripz经双酶切后琼脂糖凝胶电泳图；d.转化后挑菌进行菌落pcr扩增，pcr产物琼脂糖凝胶电泳图；e.阳性克隆测序结果；f.分别用sh1、sh2、sh3转染hek-293t细胞进行慢病毒包装72h后的荧光表达(scale bar：100μm)；g.分别用sh1、sh2、sh3的浓缩病毒液感染hct116细胞48h后的荧光表达(scale bar：100μm)；h-i.wb方法检测mkrn1在hct116、ht29细胞系中的转染率。n＝3，与对照组比较，*p《0.05。
26.图3是mkrn1促进crc细胞的增殖。其中a.wb检测mkrn1在hct15细胞系中的转染率；b-c.cck-8测定crc细胞活力；d-e.集落形成实验检测crc细胞增殖能力。n＝3，与对照组比较，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
27.图4是mkrn1诱导crc细胞发生emt。其中a-b.划痕实验检测不同mkrn1表达的crc细胞的迁移能力(scale bar：100μm)；c-d.transwell检测mkrn1敲低及过表达细胞的迁移和侵袭能力(scale bar：50μm)；e-f.显微镜观察细胞系hct116(control、sh1-mkrn1)、hct15(vector、oe-mkrn1)的细胞形态(scale bar：100μm)；g-h.敲低mkrn1及过表达mkrn1后emt相关标志物的表达。n＝3，与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
28.图5是mkrn1与snip1相互作用。其中a.通过string数据库预测与mkrn1存在相互作用的蛋白；b.通过intact数据库预测与mkrn1存在相互作用的蛋白；c.该图显示了mkrn1定量蛋白质组学、泛素化修饰组学的实验过程；d.肿瘤组织和正常组织中snip1(上)、tra2a(下)基因的表达分布；e.单因素和多因素cox分析基因表达和临床特征的p-value、风险系数hr以及置信区间；f-g.wb检测mkrn1表达影响snip1蛋白水平；h.共聚焦观察mkrn1与snip1的定位(scale bar：20μm)；i-j.在hct116、hct15细胞中利用co-ip和wb正反向验证mkrn1与snip1互作；k.在hct15细胞中利用co-ip和wb验证外源性mkrn1与snip1互作。n＝3，与对照组比较，***p《0.001。
29.图6是snip1是mkrn1的泛素化底物。其中a.mkrn1对snip1的降解作用。将flag-mkrn1(0、1、2、4和6μg)的表达载体导入hct15细胞，wb检测snip1和mkrn1的表达水平。b.将表达flag-snip1(1μg)和flag-mkrn1(0、1、2、4和6μg)的表达载体导入hct15细胞，wb检测snip1和mkrn1的表达水平。c-d.mkrn1影响snip1的半衰期。用50μg/ml chx处理hct116细胞(control及sh1-mkrn1)，hct15细胞(vector及oe-mkrn1)，wb进行分析。e-f.rt-qpcr检测mkrn1对snip1 mrna的影响。g.mkrn1对snip1的蛋白酶体依赖性降解。在过表达mkrn1的hct15细胞中，经10μm mg132处理6h后细胞snip1表达。h-i.mkrn1介导snip1泛素化。在hct116及hct15细胞中，wb检测敲低和过表达mkrn1后，snip1的泛素化水平。j.在hct15细胞中，经10μm mg132处理6h后，wb检测snip1的泛素化水平。n＝3，与对照组比较，***p《0.001。
30.图7是e3连接酶缺陷突变型mkrn1不能介导snip1泛素化。其中a.mkrn1结构域模式图。b.构建mkrn1的的e3连接酶突变体h307e。c.co-ip和wb验证mkrn1(h307e)与snip1互作。d.wb检测mkrn1(h307e)突变体对snip1降解的影响。e.将mkrn1(h307e)(0、1、2、4和6μg)的表达载体导入hct15细胞，wb检测snip1和mkrn1的表达水平。f.mkrn1(h307e)对snip1的半衰期的影响。用50μg/ml chx处理hct15细胞(vector及mkrn1(h307e))，wb进行分析。g.在hct15细胞(vector、oe-mkrn1、mkrn1(h307e))中，经10μm mg132处理6h后，wb检测snip1的泛素化水平。
31.图8是snip1抑制crc细胞emt。其中a-b.wb检测snip1在hct116、hct15细胞中的转染率。c-d.wb检测敲低snip1及过表达snip1后emt相关标志物的表达。e-f.transwell检测snip1敲低及过表达细胞的迁移能力(scale bar：50μm)。n＝3，与对照组比较，**p《0.01,***p《0.001。
32.图9是mkrn1通过降解snip1促进crc细胞的emt。其中a.wb检测hct116共转染control、sh1-mkrn1、sh-snip1的emt相关标志物的表达。b.wb检测hct15共转染vector、oe-mkrn1、oe-snip1的emt相关标志物的表达。c.transwell检测hct116共转染control、sh1-mkrn1、sh-snip1后的细胞迁移能力(scale bar：50μm)。d.transwell检测hct15共转染vector、oe-mkrn1、oe-snip1后的细胞迁移能力(scale bar：50μm)。n＝3，与对照组比较，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
33.图10是snip1抑制tgf-β通路。其中a-b.wb检测snip1对tgf-β通路的影响。n＝3，与对照组比较，***p《0.001。
34.图11是mkrn1通过激活tgf-β信号通路促进crc细胞的emt。其中a.mkrn1与tgf-β通路间的spearman相关性分析。b-c.wb检测敲低及过表达mkrn1后，tgf-β通路相关标志物的表达。d.tgf-β1处理后可逆转由敲低mkrn1引起的emt及tgf-β通路相关标志物的抑制。e.ly2109761处理后可逆转由过表达mkrn1引起的emt及tgf-β通路相关标志物的激活。f.tgf-β1处理后可逆转由敲低mkrn1引起的hct116细胞的迁移能力减低(scale bar：50μm)。g.ly2109761处理后可逆转由过表达mkrn1引起的hct15细胞的迁移能力增加(scale bar：50μm)。n＝3，与对照组比较，**p《0.01；***p《0.001。
35.图12是高水平的mkrn1通过降解snip1促进tgf-β通路。其中a.hct116细胞共转染control、sh1-mkrn1、sh-snip1后tgf-β通路相关标志物的表达水平。b.hct15细胞共转染vector、oe-mkrn1、oe-snip1后tgf-β通路相关标志物的表达水平。c.ihc检测crc中mkrn1、snip1及tgf-β1表达的代表图(scale bar：100μm；scale bar：50μm)。n＝3，与对照组比
较，**p《0.01；***p《0.001。
36.图13是mkrn1通过泛素化降解snip1，促进tgfβ信号转导，从而诱导crc细胞的emt。具体是mkrn1通过泛素化降解snip1促进crc的转移的机制示意图。
具体实施方式
37.下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
38.1材料与方法
39.1.1材料
40.1.1.1临床病人标本
41.收集2019年9月至2020年1月于贵州医科大学附属医院肛肠外科确诊的4例结肠炎患者及16例初诊为crc并接受结肠根治术治疗的患者的病理切片。收集3例结直肠癌患者的肿瘤组织和匹配的癌旁新鲜组织。该研究由xxx大学伦理评审委员会批准，研究前征得患者的知情同意。
42.1.1.2细胞
43.人结肠上皮正常细胞ccd-18co及人胚肾上皮细胞hek-293t购自美国标准生物品收藏中心，人结直肠癌细胞hct116、ht29、hct15、rko均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
44.1.1.3主要试剂及来源
45.46.[0047][0048]
1.1.5主要试剂配制方法
[0049]
(1)10
×
电泳缓冲液：
[0050]
表1 10
×
电泳缓冲液配制方法
[0051]
名称用量甘氨酸72.0gtris15.1gsds5.0gddh2o500ml
[0052]
溶解后置于室温保存，电泳时用ddh2o将10
×
电泳缓冲液稀释成1
×
使用。(2)10
×
转膜缓冲液：
[0053]
表2 10
×
转膜缓冲液配制方法
[0054]
[0055][0056]
溶解后置于室温保存，使用时按照ddh2o:甲醇:10
×
转膜缓冲液＝7:2:1的比例配制，提前配制置于4℃预冷。
[0057]
(3)10
×
tbs：
[0058]
表3 10
×
tbs配制方法
[0059]
名称用量tris15.0gnacl40.0gkcl1.0gddh2o500ml
[0060]
溶解后置于室温保存，使用时用ddh2o将10
×
电泳缓冲液稀释成1
×
后，加入0.5ml吐温-20，混匀后置于常温保存。
[0061]
(4)5％封闭液：
[0062]
表4 5％封闭液配制方法
[0063]
名称用量脱脂奶粉或牛血清白蛋白(bsa)5.0g1
×
tbst100ml
[0064]
准确称量配制后，水平摇床上充分混匀后使用。
[0065]
(5)western blot分离胶、浓缩胶：
[0066]
表5sds-page凝胶配制方法
[0067][0068]
根据目的蛋白分子量大小按照上表制备分离胶，依次加入试剂，充分混匀后将分离胶混合液加至玻璃板合适位置，随后在分离胶上方加入无水乙醇压胶。待下层分离胶凝固后，倒掉无水乙醇，吸水纸吸去残余乙醇，待挥发10min后，将浓缩胶加入玻璃板中，迅速插入梳齿，室温放置至凝固。
[0069]
(6)放线菌酮(cycloheximide,chx)的储存液制备
[0070]
将50mg chx溶解于5ml pbs中，终浓度为10mg/ml，充分混匀后使用0.22μm滤膜过滤后，按500μl/管分装，放置于-80℃冰箱保存备用。
[0071]
(7)mg132的储存液制备
[0072]
将5mg mg132溶解于210.25μl dmso中，配制为50mm，充分混匀后，按20μl/管分装，放置-80℃冰箱保存备用。
[0073]
(8)tgf-β1细胞因子的储存液制备
[0074]
细胞因子蛋白开盖前以2000rpm离心30秒，加入适量指定buffer溶解，不可涡旋振荡。重溶后的细胞因子加入适量稀释液进行稀释，使终浓度不低于10μg/ml，轻轻吹吸混匀，分装冻存于-80℃备用。wb利用20ng/ml，4h处理hct116细胞后提蛋白进行检测；transwell实验利用10ng/ml处理hct116细胞后进行染色观察。
[0075]
(9)ly2109761的储存液制备
[0076]
将0.5mg ly2109761溶解于113.25μl dmso中，配制为10mm，充分混匀后，按10μl/管分装，放置-80℃冰箱保存备用。wb利用10μm，2h处理hct15细胞后提蛋白进行检测；transwell实验利用10μm处理hct15细胞后进行染色观察。
[0077]
1.2方法
[0078]
1.2.1细胞培养
[0079]
hek-293t、hct116、ht29、hct15、rko以及ccd-18co细胞株均用含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素混合液的dmem完全培养基于37℃，5％co2培养箱中培养，隔两天换一次完全培养基。待细胞密度至80％-90％可进行细胞传代。传代时，弃去原有培养基，pbs清洗1次，加入0.25％胰酶静置消化，显微镜下观察细胞形态变圆变亮，少许贴壁细胞漂浮即可加入完全培养基终止消化，1200rpm/min 5min离心后弃掉上清，用新鲜完全培养基重悬细胞，按1:3比例传代后继续将细胞置于培养箱中培养。用于实验的细胞均处于对数生长期。
[0080]
1.2.2shrna的设计
[0081]
引物设计为forword:5
′‑
cag aag gct cga gaa ggt ata ttg ctg ttg aca gtg agc g-3
′
；reverse:5
′‑
ctaaag tag ccc ctt gaa ttc cgaggc agtagg ca-3
′
。共选取3条shrna，序列见表6。
[0082]
表6针对mkrn1基因的3个shrna靶序列
[0083][0084]
1.2.3载体构建及鉴定
[0085]
(1)pcr扩增体系：见表7。pcr条件：94℃1min，25
×
(94℃30s，54℃30s，75℃30s),75℃10min，4℃hold。
[0086]
表7shrna的pcr扩增体系、酶切体系及菌落pcr体系
[0087][0088]
(2)酶切体系：见表7。
[0089]
(3)连接：取5μl solution i、3μlp-tripz、2μl shrna于pcr管中(16℃连接过夜)。
[0090]
(4)转化：取20μl感受态细胞dh-5α，加入连接产物10μl，冰上静置30min，42℃热激90s，迅速放回冰上，加入无amp培养基摇床200rpm/min 37℃摇菌1h；取摇好的菌4000rpm/min 1min浓缩菌液，弃上清400μl，重悬菌液涂板，放37℃培养箱培养过夜；第二天挑取单个菌落进行菌落pcr。
[0091]
(5)菌落pcr：见表7。pcr条件：95℃10min，36
×
(95℃30s，60℃30s，72℃30s)，72℃7min，4℃hold。根据菌落pcr结果挑取阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0092]
(6)测序正确的菌液过夜摇菌扩大培养(大概15-20ml)，次日使用天根生化科技有限公司无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取(无菌操作)，提好的质粒放-80℃保存。
[0093]
1.2.4慢病毒包装及稳定沉默mkrn1的crc细胞构建
[0094]
将对数生长期的hek-293t细胞，用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞，重悬于新鲜培养基中，以细胞数1
×
109个铺至100mm培养皿中，次日待细胞汇合度达60％-70％时，利用lip2000进行病毒包装。在500μl无血清无双抗dmem中加入30μl lip2000，取另外三个ep管，将shrna(sh1、sh2、sh3)、pspax2、pmd2.g分别以2∶1∶1的比例加入500μl无血清无双抗dmem中，静置5min后将质粒加入lip2000中静置15min，静置后立即加入hek-293t细胞的培养基中，37℃培养6-8h后换含有1mg/l强力霉素的完全培养基15ml，于第二天收取病毒上清(即包装病毒后48h)，同时再加入15ml含有1mg/l强力霉素的完全培养基，次日收取病毒上清(即包装病毒后72h)，最终分别得到shrna1、shrna2、shrna3的病毒液各30ml；后续用1500rpm/min 3min离心病毒上清液，取离心后上清于0.45μm滤膜过滤，将滤液吸入超滤管中3000rpm/min 20min离心，至终体积为500μl，将其分为5份冻存于-80℃冰箱。将对数生长期的crc细胞，用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞，重悬于新鲜培养基中，以细胞数6
×
108个铺至60mm培养皿中，次日待细胞汇合度达60％-70％时，分别向对应的培养皿中加入sh1、
sh2、sh3病毒液、终浓度5mg/l的polybrene以及3ml完全培养基，感染6-8h后换含有1mg/l强力霉素的完全培养基，感染48h后观察细胞荧光表达，根据荧光表达以及细胞汇合度进行嘌呤霉素筛选，从而得到稳定沉默mkrn1基因的crc细胞。
[0095]
1.2.5 western blot
[0096]
(1)总蛋白的提取
[0097]
细胞样本：弃去细胞培养基，使用预冷的pbs清洗2次，移液枪吸去残留的pbs；根据细胞密度每皿加入合适量的含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa，用于裂解细胞，用细胞刮将细胞刮下置于1.5ml ep管中，放在冰上裂解10min，使细胞充分裂解后，使用超声破碎仪以超声3秒暂停8秒，振幅25％的条件，每个样本超声3次。4℃，12000rpm/min 20min离心后，吸取蛋白上清至新的ep管中，-80℃冰箱保存，上样前使用bca法测定蛋白浓度。
[0098]
组织样本：称取10mg组织加入100μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa，冰上裂解15min，超声破碎仪中置于冰上以超声6秒暂停10秒，振幅25％的条件裂解。后续同细胞蛋白提取。
[0099]
(2)bca法测定蛋白浓度
[0100]
1)按照下表配制梯度浓度的bsa标准品
[0101]
表8 bca法蛋白定量反应体系
[0102]
编号标准品稀释液(μl)bsa原液(μl)终浓度(μg/ml)a0.030.0bsa原液2000b12.537.5bsa原液1500c32.532.5bsa原液1000d17.517.5的b瓶液750e32.532.5的c瓶液500f32.532.5的e瓶液250g32.532.5的f瓶液125h40.010.0的g瓶液25i40.000
[0103]
2)待测蛋白样品被稀释10倍后进行bca检测，即81μl ripa稀释液+9μl蛋白原液；
[0104]
3)每个待测蛋白样品设置3个复孔，200μl/孔，按所需孔数，配制bca工作液，工作液按bca试剂:cu试剂＝50:1的比例配制，现配现用。
[0105]
4)按照bca工作液200μl/孔加入96孔板中，再将梯度稀释的标准品以及待测样品按照25μl/孔加入，置于37℃温箱中孵育30min；
[0106]
5)孵育后，将96孔板置于酶标仪，检测570nm处各孔的光密度值(optical density，od)；
[0107]
6)以梯度稀释的标准品的od值为横坐标，蛋白浓度为纵坐标绘制标准曲线，通过excel计算得标准曲线公式及r2(标准曲线r2应》0.99)。根据所算的标准曲线公式，计算待测样品的蛋白浓度。
[0108]
(3)蛋白变性
[0109]5×
蛋白上样缓冲液与所提蛋白样品按照1:4的比例混匀后，置于100℃金属浴中使蛋白变性，分装存于-80℃冰箱。
[0110]
(4)sds-page凝胶电泳
[0111]
1)制胶：将干净的玻璃板安装至制胶架上，根据目的蛋白的分子量大小配制相应的分离胶；待分离胶凝固后，制备5％的浓缩胶，迅速插入梳齿以防止凝缩胶凝固，静置待胶完全凝固；
[0112]
2)胶凝固后，将制好的胶组装在电泳夹上，内槽中加入适量1
×
电泳液，静置5min，观察是否漏液，若不漏液即可加入适量电泳液至外槽，并小心拔出凝胶中的梳齿；
[0113]
3)电泳：缓慢加入蛋白样本，使用80v恒压压胶，至marker分离后(大约30min)，调整电压至120v继续电泳，待溴酚蓝至分离胶底部处，即可停止电泳；
[0114]
4)转膜：根据所需蛋白分子量，裁剪相应大小的pvdf膜，并用甲醇激活，随后将转膜夹正极朝上，从下至上按照“海绵—两层薄滤纸—分离胶—pvdf膜—两层薄滤纸—海绵”的顺序配置“转膜三明治”，放入电转槽内(注意正极对正极，负极对负极)，倒入提前预冷的转膜液(转膜槽周围放冰袋效果更好)根据所需分子量大小，恒流250ma，按1-1.5kd/min进行转膜；
[0115]
5)封闭：转膜结束后，取出pvdf膜，将带有蛋白marker的pvdf膜浸泡在5％封闭液(脱脂牛奶或bsa)中，室温水平摇床缓慢摇晃孵育2h；
[0116]
6)孵育一抗：封闭结束后，弃去封闭液，用tbst洗涤pvdf膜3次，以洗掉残留封闭液。根据相应的抗体说明书，用一抗稀释液按比例稀释抗体，将pvdf膜浸入相应的抗体置于4℃摇床缓慢摇晃孵育过夜；
[0117]
7)孵育二抗：次日，将一抗孵育盒放置室温恢复温度后，将pvdf膜从一抗溶液中取出，用tbst清洗pvdf膜4次，每次5min。然后加入用二抗稀释液按照1:10000比例稀释的hrp标记羊抗兔或羊抗鼠二抗，室温孵育1h；
[0118]
8)曝光：二抗孵育结束后，用tbst清洗pvdf膜4次，每次5min。将pvdf膜正面(转印蛋白面)朝上置于曝光仪里，向表面均匀滴加ecl发光液，分析结果。
[0119]
1.2.6 qrt-pcr
[0120]
(1)提取总rna
[0121]
1)氯仿、无水乙醇和异丙醇提前放4℃预冷；
[0122]
2)加入1mltrizol至细胞培养皿，并反复吹打细胞使其充分裂解，室温静置5min，吸入无酶ep管；
[0123]
3)向上述裂解液中加入200μl预冷的氯仿，颠倒混匀，至溶液呈乳白色，室温静置5min，4℃，12000rpm/min 5min离心后，此时溶液分为三层，分别为无色的上清液(含有rna)、中间的蛋白层以及带颜色的下层有机相；
[0124]
4)加样枪小心吸取上层无色上清液至无酶ep管内，加入500μl预冷的异丙醇，上下颠倒ep管充分混匀溶液后，室温下静置10min后，4℃，12000rpm/min 10min离心，弃上清，ep管底部出现rna沉淀；
[0125]
5)加入500μl无水乙醇清洗沉淀，4℃，12000rpm/min 5min离心，弃上清，收集沉淀；
[0126]
6)打开ep管管盖室温干燥沉淀，待沉淀干燥后(切勿太干，否则不易溶解)，加入适量的depc水溶解沉淀，即为rna溶液；
[0127]
7)检测rna浓度及纯度。
[0128]
(2)去除基因组dna反应
[0129]
按下表冰上配制反应体系：
[0130]
表9去除基因组dna反应体系
[0131]
试剂体积(μl)5
×
gdna eraser buffer2.0gdna eraser1.0total rna1.0rnase free h2oupto10.0
[0132]
混匀后瞬离，pcr条件：42℃，2min；
[0133]
(3)反转录反应
[0134]
按下表冰上配制反应体系：
[0135]
表10反转录体系
[0136][0137][0138]
混匀后瞬离；pcr条件：37℃，15min；85℃，5sec。反应结束后，将cdna分装储存于-80℃；
[0139]
(4)实时荧光定量pcr反应
[0140]
1)引物序列：
[0141]
表11引物序列
[0142][0143]
2)按下表配制反应体系(避光)：
[0144]
表12.实时荧光定量pcr体系
[0145]
试剂体积(μl)tb green premix ex taqii(2
×
)10.0rcr foward primer(浓度为10μm)1.0pcr reverse primer(浓度为10μm)1.0rt反应液(cdna溶液)2.0rnase-free h2o6.0total volume20.0
[0146]
混匀后瞬离；pcr条件：95℃30s，40
×
(95℃3s，60℃30s)，4℃hold。
[0147]
1.2.7 cck-8检测细胞活力
[0148]
使用0.25％胰酶消化细胞，1200rpm/min 5min离心，弃去培养上清，收集细胞沉淀。加入1ml完全培养基至细胞沉淀中重悬细胞，使用牛鲍计数板充池计数；按照细胞数1
×
103个/孔的比例稀释细胞悬液，每孔以200μl总体积的细胞悬液加入96孔板中，放入培养箱内培养；待细胞分别培养至0d、1d、3d、5d、7d时，弃去原来的培养基，并每孔加入100μl含有10％cck-8试剂的无血清培养基，37℃培养箱孵育2h后，使用酶标仪在450nm处检测各孔od值。
[0149]
1.2.8集落形成实验检测细胞增殖
[0150]
用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按照每孔500个接种于6孔板中，待细胞生长12d后(中途每隔3-4天换液)，弃去原有培养基，pbs洗涤3次，甲醇固定30min，pbs洗涤2次，1％结晶紫染色15min，最后用pbs洗去多余的染液，晾干后拍照保存，以大于50个细胞的集团作为一个集落，image j统计形成的集落数量。
[0151]
1.2.9划痕实验检测细胞迁移能力
[0152]
(1)将crc细胞接种至6孔板中，以次日细胞密度至90％以上为宜；
[0153]
(2)用无菌的200μl枪头在每孔细胞上划出划痕，用pbs清洗漂浮的细胞后，加入无血清培养基进行培养，在划痕后的0h、48h，对细胞划痕处进行拍照，image j统计划痕变化面积。
[0154]
1.2.10transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力
[0155]
(1)提前用无血清培养基培养细胞过夜，饥饿细胞去除血清的影响；
[0156]
(2)次日，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，终止消化后离心1200rpm/min 5min，弃去上清，细胞沉淀用pbs洗涤3遍，并用1ml基础培养基重悬细胞，牛鲍计数板计数，调整hct116细胞浓度为5
×
104个/孔，hct15细胞浓度为4
×
104个/孔，在24孔板下室加入600μl含10％fbs的培养基，将transwell小室放入含培养基的24孔板中(切勿产生气泡)，将细胞悬液以200μl/孔体系加入小室中(切勿产生气泡)，常规培养48h。
[0157]
(3)在检测细胞侵袭时，使用基础培养基以1:8的比例稀释基质胶，在小室中加入60μl，均匀涂抹，避免产生气泡，放入37℃培养箱中静置2h。同时，消化饥饿后的细胞，1ml基础培养基重悬细胞沉淀，牛鲍计数板计数，调整hct116细胞浓度为6
×
104个/孔，hct15细胞浓度为5
×
104个/孔，在24孔板下室加入600μl含20％fbs的培养基，将transwell小室放入含培养基的24孔板中(切勿产生气泡)，将细胞悬液以200μl/孔体系加入小室中(切勿产生气泡)，常规培养48h。
[0158]
(4)固定染色，弃去transwell小室和培养板中的培养基，pbs洗2遍，4％多聚甲醛
固定30min，pbs洗3遍，结晶紫染色15min，用pbs清洗干净。将棉签沾湿轻轻擦掉小室上层细胞，用pbs洗涤干净后，进行拍照。
[0159]
1.2.11免疫组织化学(immunohistochemistry,ihc)染色观察组织mkrn1、snip1、tgf-β1、e-cadherin表达情况
[0160]
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ10min—二甲苯ⅱ10min—二甲苯ⅲ10min—无水乙醇ⅰ5min—无水乙醇ⅱ5min—无水乙醇ⅲ5min—蒸馏水洗。
[0161]
(2)抗原修复：将切片放入切片架，缓慢放到抗原修复液中，高火煮5min，低火20min。此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs中在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0162]
(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs中在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0163]
(4)血清封闭：在组化圈内滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用bsa封闭)
[0164]
(5)孵一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
[0165]
(6)孵二抗：玻片置于pbs中在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(hrp标记)覆盖组织，室温孵育50min。
[0166]
(7)dab显色：玻片置于pbs中在摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
[0167]
(8)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗。盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
[0168]
(9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min—85％酒精5min—无水乙醇ⅰ5min—无水乙醇ⅱ5min—正丁醇5min—二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片。
[0169]
(10)镜检：置于白光显微镜下进行结果判读。
[0170]
(11)使用image-j软件计算光密度值(iod)，结果以平均光密度值(aod)表示，计算方法为aod＝iod/面积。
[0171]
1.2.12免疫荧光检测mkrn1与snip1共定位
[0172]
(1)24孔板中放入细胞爬片，接种细胞至次日细胞密度达50-60％。
[0173]
(2)次日，弃培养基，用pbs清洗1次。
[0174]
(3)使用预冷的4％多聚甲醛，室温固定20min，pbs清洗3次，每次5min。
[0175]
(4)使用0.5％tritonx-100，室温通透10min，pbs清洗3次，每次5min。
[0176]
(5)加入5％bsa封闭液，室温封闭1h。
[0177]
(6)弃封闭液，加入mkrn1、snip1抗体覆盖爬片(大约200μl/孔，稀释比为1:200)，于4℃冰箱过夜。次日，恢复室温后，用pbs清洗3次，每次5min。
[0178]
(7)荧光二抗(稀释比为1:500)，室温避光孵育1h，然后用pbs清洗3次，每次5min。
[0179]
(8)加入dapi染液，室温避光5min，然后用pbs清洗3次，每次5min。
[0180]
(9)使用90％的甘油封片，指甲油封片子的四周，在共聚焦显微镜下观察并拍照。
[0181]
1.2.13mkrn1定量蛋白质组学及泛素化修饰组学研究分析
[0182]
收集ht29、hct116 control组及sh1-mkrn1组细胞，进行蛋白质组学研究以及泛素化修饰组学研究。该研究由杭州景杰生物科技股份有限公司完成。
[0183]
1.2.14免疫共沉淀检测mkrn1与snip1相互作用
[0184]
(1)将处于对数生长期的细胞用预冷的pbs洗2遍后，使用细胞刮刮下，收集细胞沉淀，在细胞沉淀中加入600μl含蛋白酶抑制剂的np40细胞裂解液，置于4℃摇床上缓慢摇晃裂解1h，12000rpm/min 15min离心，将上清吸至ep管内；
[0185]
(2)取100μl裂解液上清，加入5
×
loading buffer，置于金属浴100℃，10min后，作为input样本；
[0186]
(3)在剩余500μl上清中加入20μlproteina/g琼脂糖珠，于4℃缓慢摇晃孵育0.5h，然后3000rpm离心10min，将上清吸至新的ep管内；
[0187]
(4)通过bca法检测上清蛋白浓度，按照每mg蛋白加入1μg抗体的量，加入目的抗体以及与目的抗体相同属性的igg抗体(igg组和ip组)，抗体与蛋白孵育8h以上，加入35μlproteina/g琼脂糖珠，4℃摇床缓慢摇晃孵育过夜；
[0188]
(5)次日，4℃离心3000rpm/min 10min，将琼脂糖珠离心至管底，将上清小心吸去，用1ml预冷pbs清洗琼脂糖珠3次，最后加入70μl的1
×
loading buffer，金属浴100℃10min，作为igg标本以及ip样本；
[0189]
(6)通过western blot分析蛋白间的相互作用。
[0190]
1.2.15泛素化实验
[0191]
(1)提前用10μm/l mg132处理细胞8h，收获细胞，在沉淀中加入150μl含蛋白酶抑制剂以及1mm/ldtt的sds裂解液，sds裂解液:dtt＝100:1，100℃金属浴煮40min，直至溶液清亮无沉淀，期间每间隔1.5min混匀ep管；(2)加入500μl含蛋白酶抑制剂np40裂解液稀释裂解好的蛋白液，4℃12000rpm/min15min离心，将蛋白上清吸取置于新的ep管内；
[0192]
(3)加入20μlproteina/g琼脂糖珠于蛋白上清中，于4℃缓慢摇晃孵育0.5h，4℃3000rpm/min 10min离心，将上清吸至新的ep管内；
[0193]
(4)通过bca法检测上清蛋白浓度，以每mg蛋白加入1μg抗体的量，加入目的抗体，抗体与蛋白孵育6h以上，加入35μlproteina/g琼脂糖珠，4℃摇床缓慢摇晃孵育过夜；
[0194]
(5)次日，4℃3000rpm/min 10min离心，将琼脂糖珠离心至管底，将上清小心吸去，用1ml预冷pbs清洗琼脂糖珠3-4次，最后加入70μl的1
×
loading buffer，金属浴100℃10min，作为ip样本；
[0195]
(6)通过western blot分析目的蛋白的泛素化水平。
[0196]
1.2.16统计学分析
[0197]
采用image j、ihc profiler、spss 26.0以及graphpadprism 6软件进行数据分析以及统计图表的制作。所有计量资料用均数
±
标准差表示，两组间比较采用t检验，以p《0.05为差异有统计学意义。每组实验重复三次，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0198]
2结果
[0199]
2.1mkrn1在crc中表达上调且与预后不良相关
[0200]
为了研究mkrn1在肿瘤中的表达情况，我们从癌症细胞系百科全书数据集(https://portals.broadinstitute.org/ccle/about)获得了结直肠肿瘤的细胞系基因表
达矩阵，结果显示mkrn1在crc中呈现高表达(图1a)。此外，我们从癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,tcga)数据集(https://portal.gdc.com)获得了620个结直肠肿瘤的rnaseq数据和相应的临床信息，并通过tcga联合基因型-组织表达数据库分析在crc与正常组织中mkrn1的表达水平，结果显示，与正常组织比较，mkrn1在crc中呈现高表达(图1b)。我们检测了3对crc和癌旁非肿瘤组织中mkrn1蛋白水平，发现mkrn1蛋白在crc组织中的表达高于癌旁组织(图1c)。
[0201]
ihc染色结果显示，与结肠炎患者的组化结果相比较，mkrn1在crc组织中的表达明显增高，且mkrn1的表达与肿瘤的tnm分期相关，
ⅲ‑ⅳ
期患者的mkrn1表达明显高于
ⅰ‑ⅱ
期患者(图1d)。此外，通过r2基因组分析平台分析，结果显示高表达mkrn1的crc患者的总生存期(os)明显短于低表达mkrn1的crc患者(图1e)。
[0202]
为了研究mkrn1在crc发展中的作用，我们通过western blot(wb)检测了4株crc细胞与正常人结肠成纤维细胞ccd-18co中mkrn1的蛋白表达，结果显示，与ccd-18co细胞比较，crc细胞ht29、hct116、rko中mkrn1蛋白呈现高表达，hct15呈现低表达(图1f)。综上所述，这些发现表明mkrn1在crc中显著上调，且与crc患者预后不良有关。
[0203]
2.2构建稳定沉默mkrn1的crc细胞
[0204]
我们选用高表达mkrn1的crc细胞hct116和ht29进行敲低mkrn1处理。通过http://katahdin.csh1.org/sirna/rnai.cgi？type＝shrna平台针对mkrn1基因设计shrna，命名为sh1，sh2，sh3。shrnapcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，条带位置显示在100bp左右，成功扩增3条shrna序列(图2a)；胶回收后经ecorⅰ及xhoⅰ双酶切(图2b)；以及对载体ptripz进行双酶切(图2c)；胶回收酶切后的shrna及载体ptripz后，进行连接、转化后挑菌进行菌落pcr，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示sh1、sh2、sh3均与载体ptripz连接成功(图2d)；送菌液至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，sh1-1～sh1-4、sh2-1、sh2-2、sh2-4、sh3-1测序结果与设计的shrna序列一致(图2e)。以上结果说明sh1、sh2、sh3序列均成功连入ptripz载体。
[0205]
选取测序正确的sh1、sh2、sh3菌液摇菌提取质粒后进行慢病毒包装，72h后hek-293t细胞的荧光表达分别达到50.0％，40.0％，30.0％(图2f)，表明shrna载体成功转进hek-293t细胞。收集强力霉素诱导表达的48h，72h的病毒液上清，用浓缩后的病毒液感染hct116细胞，感染48h后hct116的荧光表达约为80.0％(图2g)。wb验证mkrn1的敲低效率，结果显示1号序列敲低mkrn1有效，2、3号序列敲低效果不明显(图2h)。后续，我们用1号序列成功敲低ht29细胞中的mkrn1表达(图2i)。
[0206]
2.3mkrn1促进crc细胞的增殖
[0207]
根据mkrn1在crc细胞中的表达情况，我们选用低表达mkrn1的hct15细胞进行过表达。在hct15细胞中检测mkrn1的过表达效果(图3a)。通过cck8实验检测细胞的活力，结果显示，敲低mkrn1后，hct116、ht29细胞活力降低(图3b)；过表达mkrn1后，hct15细胞活力增加(图3c)。同时，集落形成实验结果表明，敲低mkrn1后，hct116、ht29细胞形成的集落少且小(图3d)，过表达mkrn1后，hct15细胞形成的集落多且大(图3e)。结果提示mkrn1促进crc细胞的增殖。
[0208]
2.4mkrn1促进crc细胞的迁移、侵袭及emt
[0209]
为了探索mkrn1能否促进crc转移，我们选用高侵袭性crc细胞hct116进行实验，通
过划痕实验检测细胞的伤口愈合能力，结果表明在hct116细胞中，敲低mkrn1能够抑制crc细胞的划痕愈合能力(图4a)；在hct15细胞中，过表达mkrn1能够促进crc细胞的划痕愈合能力(图4b)。通过transwell检测hct116、hct15细胞的迁移、侵袭能力，结果显示，在hct116细胞中，敲低mkrn1能够抑制crc细胞的迁移及侵袭能力(图4c)，反之，在hct15细胞中，过表达mkrn1能够促进crc细胞的迁移及侵袭能力(图4d)。
[0210]
emt在肿瘤的侵袭和转移过程中扮演着关键且复杂的角色。我们通过显微镜观察发现，敲低mkrn1后，hct116细胞由原来的成纤维细胞形态(呈纺锤形)改变为上皮细胞形态(紧密结合)；而过表达mkrn1后，hct15由原来的上皮细胞形态改变为成纤维细胞形态(图4e-f)。与这些形态学变化相一致的是，敲低mkrn1，在蛋白水平上n-cadherin表达减低，e-cadherin表达增加，snail表达减低；过表达mkrn1，n-cadherin表达增加，e-cadherin表达减低，snail表达增加(图4g-h)。结果提示mkrn1诱导crc细胞的emt。
[0211]
2.5mkrn1与snip1相互作用
[0212]
为了阐明mkrn1发挥其功能的潜在机制，我们通过string及intact数据库寻找可能与mkrn1相互作用的蛋白(图5a-b)，两个数据库取交集得到snip1、tra2a、luc7l三个蛋白。后续我们通过蛋白质组学和泛素化修饰组学研究，结果显示，mkrn1与snip1、tra2a存在相互作用(图5c)。为了探索snip1及tra2a在crc中充当怎样的角色，我们通过tcga数据库分析，发现与正常对照比较，snip1在crc中呈现低表达(图5d上)，但tra2a在crc中呈现高表达(图5d下)，并且我们从tcga数据集获得了620个crc的rnaseq数据和相应的临床信息，通过单变量和多变量cox回归分析，发现snip1可作为crc的独立预后因子，但tra2a不能(图5e)。
[0213]
有研究发现在炎症性肠病患者和小鼠结肠炎模型的肠道上皮细胞中，snip1显著降低。而tra2a作为癌基因在多种肿瘤中呈现高表达。因此，我们进一步检测了mkrn1改变对snip1的影响，结果显示敲低mkrn1，snip1表达上调，过表达mkrn1，snip1表达下调(图5f-g)，两者呈现负相关。由于在高表达mkrn1的细胞中snip1蛋白表达明显下调，我们试图阐明mkrn1与snip1蛋白在crc细胞中的关系。因此，我们通过共聚焦成像检测mkrn1与snip1的空间分布，结果显示mkrn1(红色)与snip1(绿色)的表达部分重叠，表明两者共同定位于胞浆及胞核(图5h)。co-ip联合免疫印迹正反向验证，在hct116及hct15细胞中内源性mkrn1与snip1形成复合物(图5i-j)，外源性mkrn1与内源性snip1仍能形成复合物(图5k)。这些结果说明mkrn1与snip1相互作用。
[0214]
2.6mkrn1诱导snip1蛋白酶体降解、促进snip1的泛素化
[0215]
由于mkrn1的过表达导致snip1蛋白表达下调，接下来我们在hct15细胞中检测了随着外源mkrn1水平的增加，snip1蛋白的稳定水平。结果显示，随着外源性mkrn1水平的增加，内源性及外源性snip1的稳定水平均逐渐下降(图6a-b)。接下来，我们用chx处理crc细胞，并测定了snip1的半衰期。在chx存在下，mkrn1降解snip1的动力学分析表明，敲低mkrn1可以增加snip1的稳定性(图6c)；过表mkrn1可以减低snip1的稳定性(图6d)。同时，chx治疗也破坏了mkrn1的稳定性，支持了早期的研究，即mkrn1是通过自身泛素化降解的。虽然mkrn1的过表达引起了snip1蛋白的降解，但mkrn1的表达无法影响snip1 mrna的表达(图6e-f)，这表明mkrn1能够影响snip1的转录后水平。由于mkrn1是e3泛素连接酶，为了深入研究mkrn1诱导snip1降解的机制，我们通过加入蛋白酶体抑制剂mg132检测snip1的降解是否依赖于26s蛋白酶体。结果表明，mg132可以逆转由mkrn1介导的snip1的降解过程，提示
mkrn1通过蛋白酶体途径降解snip1(图6g)。进一步通过泛素化分析表明，敲低mkrn1后，snip1的泛素化水平降低(图6h)，过表达mkrn1后，snip1的泛素化水平增加(图6i)。加入mg132处理后mkrn1能够进一步诱导snip1的泛素化(图6j)。综上所述，这些结果说明snip1蛋白是mkrn1的泛素化底物，并且mkrn1促进snip1降解。
[0216]
2.7mkrn1的e3连接酶突变体h307e不能泛素化修饰snip1
[0217]
ring结构域是ring结构域家族具有泛素连接酶作用的重要元素。mkrn1是ring结构域家族的成员之一，其结构域模式图如图7a所示，其n端第281-334位氨基酸构成ring结构域。有研究报道，mkrn1的ring结构域中的307位氨基酸由组氨酸突变为谷氨酸(h307e)，可使mkrn1丧失e3连接酶活性。因此，我们构建了mkrn1的e3连接酶突变体h307e(图7b)。虽然mkrn1(h307e)突变体能够与snip1结合(图7c)，但mkrn1(h307e)不诱导snip1降解(图7d)，并且随着外源mkrn1(h307e)逐渐增加，内源性snip1的水平无明显变化(图7e)；同时，chx实验显示mkrn1突变后其诱导snip1不稳定的能力被阻止(图7f)。我们通过泛素化分析进一步证实了mkrn1(h307e)不能诱导snip1泛素化(图7g)。综上所述，mkrn1(h307e)不能诱导snip1的泛素化降解，表明mkrn1的e3连接酶活性在介导snip1降解中的重要性。这些数据提示，mkrn1是snip1的一个新的e3连接酶。
[0218]
2.8snip1抑制crc细胞emt及迁移
[0219]
为了探索snip1是否在抑制crc的转移中发挥作用，我们在crc细胞中沉默及过表达了snip1(图8a-b)；wb结果显示，敲低snip1后，n-cadherin表达增加，e-cadherin表达减低，snail表达增加，促进了crc细胞的emt(图8c)；过表达snip1后，n-cadherin表达减低，e-cadherin表达增加，snail表达减低，抑制了crc细胞的emt(图8d)。transwell实验结果显示，敲低snip1，hct116细胞的迁移能力增强(图8e)；过表达snip1，hct15细胞的迁移能力减弱(图8f)。这些结果证明snip1能够抑制crc细胞的emt及迁移。
[0220]
2.9mkrn1通过抑制snip1从而促进crc细胞emt及迁移
[0221]
为了探索snip1是否参与mkrn1促进crc细胞的迁移，我们进行了回复实验，利用shsnip1可逆转由sh1-mkrn1引起的hct116细胞的emt抑制(图9a)；过表达snip1可逆转由oe-mkrn1引起的hct15细胞的emt激活(图9b)。同时，transwell试验结果显示，沉默snip1可逆转由sh1-mkrn1引起的hct116细胞的迁移能力抑制(图9c)；过表达snip1可逆转由oe-mkrn1引起的hct15细胞的迁移能力增加(图9d)。这些发现表明，在crc细胞中，mkrn1通过下调snip1从而促进emt。
[0222]
2.10在crc细胞中，snip1可抑制tgf-β信号转导
[0223]
snip1是基于其抑制tgf-β信号转导途径的能力而克隆和鉴定的核蛋白。为了探索snip1在crc中能否影响tgf-β信号转导，wb结果显示敲低snip1后，p-smad2/3及tgf-β1表达增加，促进tgf-β信号转导，过表达snip1后，p-smad2/3及tgf-β1表达减少，抑制tgf-β信号转导(图10a-b)。
[0224]
2.11mkrn1激活tgf-β信号通路从而促进crc细胞的emt
[0225]
为了检测mkrn1与tgf-β信号通路间的关系，我们从tcga数据库获得了crc的rnaseq数据和相应的临床信息，通过spearman相关性分析显示mkrn1与tgf-β通路呈正相关(图11a)。wb结果显示敲低mkrn1减少p-smad2/3及tgf-β1的表达，抑制tgf-β通路；过表达mkrn1增加p-smad2/3及tgf-β1的表达，激活tgf-β通路(图11b-c)。提示高水平的mkrn1可能
通过tgf-β信号途径促进crc的进展。由于tgf-β途径在诱导emt中起关键作用，是肿瘤侵袭转移的关键步骤，我们进一步确定了mkrn1是否通过tgf-β通路影响crc细胞的emt。用tgf-β通路诱导剂tgf-β1处理可逆转由敲低mkrn1所导致的emt及tgf-β通路相关标志物的抑制(图11d)；用tgf-β通路抑制剂ly2109761处理可逆转由过表达mkrn1所导致的的emt及tgf-β通路相关标志物的增加(图11e)。此外，我们通过transwell做了相应的表型试验，结果显示tgf-β1处理后，可显著增加hct116 sh1-mkrn1细胞的迁移能力(图11f)；ly2109761处理后，可显著降低hct15 oe-mkrn1细胞的迁移能力(图11g)。这些结果提示mkrn1通过tgf-β通路促进crc细胞的emt和迁移。
[0226]
2.12mkrn1通过降解snip1促进tgf-β通路
[0227]
为了评估高表达mkrn1促进tgf-β通路是否与mkrn1降解snip1有关，我们通过回复实验，在hct116 sh1-mkrn1中引入sh-snip1，结果显示snip1的干扰可逆转mkrn1缺失细胞中p-smad2/3及tgf-β1的水平；在hct15 oe-mkrn1中引入oe-snip1，结果显示snip1的过表达可逆转mkrn1过表达细胞中p-smad2/3及tgf-β1的水平(图12a-b)。为了进一步证实我们的研究，我们利用ihc验证临床crc标本中mkrn1、snip1和tgf-β1的表达。结果显示，在mkrn1高表达的患者中，snip1呈现低表达，tgf-β1表达较高(图12c)。这些结果表明，mkrn1能够通过降解snip1促进tgf-β信号转导。
[0228]
综上所述，我们的研究说明mkrn1通过泛素化降解snip1，消除对tgf-β信号的抑制，从而促进crc细胞的emt和转移(图13)。
[0229]
3讨论：
[0230]
本技术中，提供了足够的证据来证明mkrn1促进crc的进展。首先，mkrn1在crc中高表达，且与临床tnm分期呈正相关，高表达mkrn1的crc患者预后更差。其次，体外实验证明具有高水平mkrn1的crc细胞表现出间充质表型，且能够促进crc细胞的增殖、迁移、侵袭能力和emt进程。我们首次发现mkrn1可作为促癌因子促进crc的进展。
[0231]
我们的研究表明，mkrn1与snip1共定位。co-ip结果显示，内外源性的mkrn1与snip1均具有相互作用。mkrn1可以导致snip1的失稳，减少snip1的半衰期，且其可通过泛素-蛋白酶体途径介导snip1降解，这说明snip1是mkrn1的泛素化底物。可是，虽然e3连接酶活性缺陷的突变体mkrn1(h307e)可以与snip1结合，但其不会诱导snip1泛素化降解。表明这个位点可能不是mkrn1与snip1结合的关键位点，但对于mkrn1泛素化snip1是必不可少的。因此，针对mkrn1的h307e突变位点合成靶向化合物对抑制crc的进展也值得进一步探索。
[0232]
snip1可在k5、k30、k108位点发生sumo化修饰，snip1 sumo化后，干扰smad复合物形成的作用减弱，导致tgf-β靶基因表达增加，可促进tgf-β信号介导的细胞迁移和浸润。因此，我们验证了snip1在crc细胞中的作用，通过wb及transwell实验证实沉默snip1能够促进crc细胞的emt和迁移能力，过表达snip1能够抑制crc细胞的emt和迁移能力。我们通过回复实验证明了snip1的过表达逆转了过表达mkrn1对emt标志物的激活，沉默snip1逆转了sh1-mkrn1对emt标志物的抑制。本研究首次报道了crc中mkrn1和snip1的表达水平呈负相关，证实snip1可作为一种肿瘤抑制因子，在蛋白水平上被mkrn1泛素化降解。在本研究中，我们证实mkrn1通过泛素化降解snip1来促进crc细胞的的转移和emt进程。
[0233]
我们通过生信分析以及wb证实mkrn1与tgf-β通路呈正相关。此外，我们利用回复
实验，通过加入tgf-β信号通路诱导剂及抑制剂，证实高表达mkrn1可促进tgf-β信号转导从而诱导crc细胞发生emt。
[0234]
我们在crc细胞中验证了snip1与tgf-β信号通路的关系，结果显示过表达snip1可抑制p-smad2/3的表达，说明snip1可抑制tgf-β信号转导，但其同样抑制了tgf-β1的表达，这意味着snip1与tgf-β1之间可能存在着另外的调控机制，仍待后续研究。此外，我们通过回复实验证明了沉默snip1可以逆转sh1-mkrn1对tgf-β信号通路相关标志物的抑制，过表达snip1可以逆转oe-mkrn1对tgf-β信号通路相关标志物的激活。
[0235]
我们利用临床病人组织切片进行ihc染色，结果提示，mkrn1低表达组有较高水平的snip1，e-cadherin及tgf-β1表达的减低。本研究通过将临床标本与细胞水平的研究结果相结合，证明了过表达mkrn1通过泛素化降解snip1促进tgf-β信号转导，从而在crc的发展中发挥重要作用。
[0236]
在本研究中，我们发现mkrn1是诱导crc进展的一个新的驱动因素。首先，我们发现mkrn1在crc组织中的表达明显高于非肿瘤组织，且与crc的tnm分期呈正相关。其次，高表达的mkrn1还可促进crc细胞的侵袭、迁移及emt进程。接下来，我们确定了mkrn1的泛素化底物snip1，并揭示了mkrn1可以通过泛素-蛋白酶体途径降解snip1蛋白，而且mkrn1的e3泛素连接酶活性对于mkrn1泛素化降解snip1至关重要。此外，高水平的mkrn1能够激活tgf-β信号通路。最后，我们证明了mkrn1通过泛素化降解snip1促进tgf-β信号转导从而诱导了crc的转移。这些结果都提示mkrn1可能在crc发展的分子机制中发挥独特作用。在本课题研究中，我们提供了一种可靠的分子，可以作为预测crc转移的潜在生物标志物及预后指标，有助于crc的治疗。并且，mkrn1/snip1/tgf-β轴可能为crc抗转移药物开发提供新的靶点。
[0237]
4结论
[0238]
1.mkrn1在crc细胞及组织中高表达，且其可促进crc细胞的转移。
[0239]
2.snip1是mkrn1的新的泛素化底物，mkrn1通过泛素-蛋白酶体途径降解snip1，从而促进crc细胞的emt及转移。
[0240]
3.高表达mkrn1可促进tgf-β信号转导从而诱导crc细胞发生emt。
[0241]
4.mkrn1通过泛素化降解snip1，促进tgf-β信号转导从而促进crc细胞的emt及转移。
[0242]
5.mkrn1可能作为预测crc转移的潜在生物标志物及预后指标，靶向mkrn1开发治疗药物有助于crc的治疗。
[0243]
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.mkrn1在结直肠癌预后方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌预后方面，是以mkrn1作为结直肠癌预后标志物方面。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌预后方面，是以mkrn1作为结直肠癌预后情况判断的试剂或试剂盒方面。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌预后，是结直肠癌转移方面的预后。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌转移方面的预后，具体是当mkrn1表达量高于正常值时，结直肠癌转移的可能性升高，当mkrn1表达量正常或偏低时，结直肠癌转移的可能性降低。6.一种结直肠癌预后评估试剂或试剂盒，其特征在于，含有检测mkrn1的dna/蛋白表达浓度/滴度的有无增高的试剂。7.mkrn1在结直肠癌诊断方面的应用，其特征在于，具体是在结直肠癌诊断试剂或试剂盒方面的应用，所述试剂或试剂盒含有检测mkrn1的dna/蛋白表达浓度/滴度的有无增高的试剂，当mkrn1表达量高于正常值时，存在结直肠癌的可能较高，当mkrn1表达量正常或偏低时，结直肠癌的可能较低。8.snip1在结直肠癌预后方面的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌预后，是结直肠癌转移方面的预后。10.snip1在结直肠癌诊断方面的应用，其特征在于，具体是在结直肠癌诊断试剂或试剂盒方面的应用，所述试剂或试剂盒含有检测snip1的dna/蛋白表达浓度/滴度的有无增高的试剂，当snip1表达量低于正常值时，存在结直肠癌的可能较高，当snip1表达量正常或偏高时，结直肠癌的可能较低。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体是MKRN1、SNIP1在结直肠癌诊断及预后方面的应用。本申请中证实了MKRN1在CRC中高表达，且与临床TNM分期呈正相关，高表达MKRN1的CRC患者预后更差，具有高水平MKRN1的CRC细胞表现出间充质表型，且能够促进CRC细胞的增殖、迁移、侵袭能力和EMT进程，发现了MKRN1可作为促癌因子促进CRC的进展；说明了SNIP1能够抑制CRC细胞的EMT和迁移能力，证实了沉默SNIP1能够促进CRC细胞的EMT和迁移能力，过表达SNIP1能够抑制CRC细胞的EMT和迁移能力，高表达SNIP1的CRC患者预后较好。说明MKRN1、SNIP1均可以作为预测CRC转移的潜在生物标志物及预后指标，有助于CRC的治疗。治疗。治疗。


技术研发人员：李梦醒 李琴山
受保护的技术使用者：贵州医科大学附属医院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/9/9