一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合及其应用

1.本发明属于甜叶菊组培技术领域，具体涉及一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合及其应用。


背景技术：

2.甜叶菊(steviare baudianabertoni)是菊科、多年生草本宿根植物，原产于南美洲巴拉圭高原。自20世纪70年代甜叶菊被引种以来，就在各地广泛栽培。甜叶菊的主要成分为甜菊糖苷，其不仅是一种天然的甜味剂，同时还具有控制肥胖症、缓解神经疲劳、降低血压、抗肿瘤等作用。因此，甜叶菊是食品及药品工业的重要原料之一。
3.目前，甜叶菊多采用组培技术进行育种工作。但在组培的过程中，由于外植体在切口释放出的酚类物质经多酚氧化酶氧化后产生醌类物质使培养基变褐，极易造成外植体褐变死亡，大大降低了甜叶菊的组培成活率。因此，如何有效防止甜叶菊组培褐化、提高甜叶菊组培成活率是亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合及其应用，在甜叶菊组培育种的过程中，能够有效防止组培褐化、提高组培成活率。
5.本发明提供了一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合，包括诱导培养基和生根培养基；所述诱导培养以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
·
l-1
的naa、0.5～1.5g
·
l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉；所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0～0.5mg
·
l-1
的iaa、0～0.5mg
·
l-1
的naa、1.0～1.5g
·
l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉。
6.优选的，所述培养基组合还包括增殖培养基。
7.优选的，所述增殖培养以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
·
l-1
的naa、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉。
8.本发明同时还提供了上述培养基组合在防止甜叶菊组培褐化中的应用。
9.此外，本发明还提供了一种防止甜叶菊组培褐化的方法，采用前述技术方案所述的培养基组合，包括以下步骤：将消毒后的外植体接种至诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；将所述不定芽接种至增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗；将所述组培苗接种至生根培养基中进行生根培养，得到再生苗；将所述再生苗进行移栽培育，得到再生甜叶菊。
10.优选的，对外植体依次进行第一消毒、第二消毒和第三消毒，得到所述消毒后的外植体；
11.所述第一消毒包括：将外植体与质量百分比为0.3％～0.5％的洗衣粉水溶液混合后第一浸泡10～15min，以流动水和ro水依次对第一浸泡的外植体进行清洗，得到第一消毒
后的外植体；
12.所述第二消毒包括：将所述第一消毒后的外植体与体积百分比为75％的酒精混合后第二浸泡30～40s，以无菌水对第二浸泡后的外植体进行清洗，得到第二消毒后的外植体；
13.所述第三消毒包括：将所述第二消毒后的外植体与质量百分比为0.1％的氯化汞溶液混合后第三浸泡4～6min，以无菌水对第三浸泡后的外植体进行再次清洗。
14.优选的，所述第一浸泡过程中包括对装有外植体和洗衣粉混合液的容器进行震荡。
15.优选的，所述诱导培养、增殖培养和生根培养的培养基的ph值分别为5.8～6.0。
16.优选的，所述诱导培养、增殖培养和生根培养的培养条件分别包括：培养温度为22～27℃，相对湿度为60％～70％，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～16h/d。
17.优选的，用于光照的光源包括led光源；所述led光源包括红光和蓝光。
18.有益效果：
19.本发明提供了一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合，包括诱导培养基和生根培养基；所述诱导培养以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
·
l-1
的naa、0.5～1.5g
·
l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉；所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0～0.5mg
·
l-1
的iaa、0～0.5mg
·
l-1
的naa、1.0～1.5g
·
l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉。通过在诱导培养基中添加活性炭能够有效防止外植体褐变，有效吸附甜叶菊组培过程中释放的酚类，诸如酚酸类物质，例如绿原酸、类黄酮和单宁，降低甜叶菊组培苗褐化苗的发生几率，得到健壮、叶绿宽大、无黄叶的不定芽，而后在生根培养基中添加活性炭能够在生根阶段促进组培苗生根，提高组培苗的生根数和根长。实验证明，与未添加活性炭的生根培养基相比，采用本发明提供的诱导培养基和生根培养基时，不定芽褐变率的几率仅为6.7％；且生根培养后的再生苗长势良好、较健壮，叶绿，其生根数目和根长可明显增加15.5％、10.0％，大大降低了组培褐化发生的几率。
20.基于上述优势，将本发明提供的包括上述诱导培养基和生根培养基的培养基组合，与本领域中任意常规的增殖培养基进行组合使用，也可以有效降低组培褐化苗发生的几率，促进组培苗的生长。
21.本发明还提供了一种防止甜叶菊组培褐化的方法，包括以下步骤：将消毒后的外植体接种至诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；将所述不定芽接种至增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗；将所述组培苗接种至生根培养基中进行生根培养，得到再生苗；将所述再生苗进行移栽培育，得到再生甜叶菊。通过对外植体进行消毒处理，有利于对外植体表面进行彻底的消毒，能够同时杀死外植体表面的微生物和内生菌，减少了组培过程中的污染率；通过将消毒后的外植体进行诱导培养，不仅提高了不定芽的诱导率，还降低了外植体在诱导阶段的褐变率，更有利于不定芽的增殖培养；经增殖培养将得到的组培苗进行生根培养进一步降低了再生苗褐化的几率，同时提高了再生苗的生根数目和根长；通过将再生苗移栽至室外培养，大幅提高了再生甜叶菊的成活率，为甜叶菊组培育苗提供良好的技术支撑。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
23.图1为实施例1中利用升汞消毒4min时，外植体的生长情况；
24.图2为实施例1中利用升汞消毒5min时，外植体的生长情况；
25.图3为实施例1中在诱导培养时利用a3培养基诱导培养14d后，不定芽的生长情况；
26.图4为实施例1中在增殖培养中利用j2培养基培养的组培苗的生长情况；
27.图5为实施例1中led光源为红光与蓝光按3:1进行照射培养的组培苗的生长情况；
28.图6为对比例2中led光源为红光进行照射培养的组培苗的生长情况；
29.图7为对比例3中led光源为蓝光进行照射培养的组培苗的生长情况；
30.图8为对比例6中led光源为白色荧光灯进行照射培养的组培苗的生长情况。
具体实施方式
31.本发明提供了一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合，包括诱导培养基和生根培养基；所述诱导培养以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0.5～1.5mg
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l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
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l-1
的naa、0.5～1.5g
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l-1
的活性炭、15～35g
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l-1
的蔗糖和4～8g
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l-1
的琼脂粉，进一步优选为仅包括0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
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l-1
的naa、0.5～1.5g
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l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
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l-1
的琼脂粉；所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0～0.5mg
·
l-1
的iaa、0～0.5mg
·
l-1
的naa、1.0～1.5g
·
l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
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l-1
的琼脂粉，进一步优选为仅包括0～0.5mg
·
l-1
的iaa、0～0.5mg
·
l-1
的naa、1.0～1.5g
·
l-1
的活性炭、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉。
32.在本发明中，所述诱导培养以ms培养基为基础培养基；所述诱导培养基中的6-ba浓度优选为0.5～1.0mg
·
l-1
，进一步优选为0.5～0.8mg
·
l-1
，更优选为0.5mg
·
l-1
；naa的浓优选为0.1～0.5mg
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l-1
，进一步优选为0.3～0.5mg
·
l-1
，更优选为0.5mg
·
l-1
；所述活性炭的浓度优选为0.5～1.0g
·
l-1
，更优选为1.0g
·
l-1
；所述蔗糖的浓度优选为15～35g
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l-1
，进一步优选为30g
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l-1
；所述琼脂粉的浓度优选为4～8g
·
l-1
，进一步优选为6g
·
l-1
；所述诱导培养基的ph值优选为5.8～6.0，进一步优选为5.8。采用本发明提供的诱导培养基，在诱导阶段能够降低外植体的褐变的几率，改善不定芽的长势。
33.在本发明中，所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基；所述生根培养基中的iaa的浓度优选为0.1～0.5mg
·
l-1
，进一步优选为0.2～0.5mg
·
l-1
，更优选为0.1mg
·
l-1
；所述naa的浓度优选为0.1～0.5mg
·
l-1
，进一步优选为0.2～0.5mg
·
l-1
，更优选为0.1mg
·
l-1
；所述活性炭的浓度优选为0.5～1.0g
·
l-1
，更优选为1.0g
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l-1
；所述蔗糖的浓度优选为15～35g
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l-1
，进一步优选为30g
·
l-1
；所述琼脂粉的浓度优选为4～8g
·
l-1
，进一步优选为6g
·
l-1
；所述生根培养基的ph值优选为5.8～6.0，进一步优选为5.8。采用本发明提供的生根培养基能够降低甜叶菊组培苗褐化苗的发生几率；同时促进组培苗生根，提高组培苗的生根数和根长。
34.基于上述培养基组合的优势，本发明优选将所述培养基组合与本领域中任意常规的增殖培养基进行组合使用，均能够降低组培褐化苗发生的几率，促进组培苗的生长。
35.在本发明中，所述增殖培养基优选以ms培养基为基础培养基，还优选包括0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
·
l-1
的naa、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉，进一步优选为仅包括0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
·
l-1
的naa、15～35g
·
l-1
的蔗糖和4～8g
·
l-1
的琼脂粉。本发明所述增殖培养基中所述6-ba的浓度进一步优选为0.5～0.8mg
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l-1
，更优选为0.5mg
·
l-1
；所述naa的浓度进一步优选为0.1～0.3mg
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l-1
，更优选为0.2mg
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l-1
；所述蔗糖的浓度进一步优选30g
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l-1
；所述琼脂粉的浓度进一步优选为6g
·
l-1
；所述增殖培养基的ph值优选为5.8～6.0，进一步优选为5.8。采用本发明提供的所述增殖培养基培养后，增殖系数高达3.3，且不定芽健壮、长势好。
36.此外，本发明还提供了所述培养基组合在防止甜叶菊组培褐化中的应用。
37.本发明提供了一种防止甜叶菊组培褐化的方法，采用前述技术方案所述的培养基组合，包括以下步骤：将消毒后的外植体接种至诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；将所述不定芽接种至增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗；将所述组培苗接种至生根培养基中进行生根培养，得到再生苗；将所述再生苗进行移栽培育，得到再生甜叶菊。
38.本发明优选用流动的自来水冲洗甜叶菊外植体，得到冲洗后的外植体。本发明所述冲洗可以冲洗掉附着在外植体表面的泥沙等杂质。在本发明中，甜叶菊所述外植体优选包括处于旺盛生长状态且无病害带腋芽的茎段，所述茎段的长度优选为2～3cm。本发明对甜叶菊的来源没有特殊的要求。
39.得到所述冲洗后的外植体后，本发明优选对所述冲洗后的外植体进行消毒，得到消毒后的外植体。本发明所述消毒优选包括对外植体依次进行第一消毒、第二消毒和第三消毒。
40.本发明所述第一消毒优选包括将所述外植体与洗衣粉水溶液混合进行第一浸泡，进一步优选将所述外植体与洗衣粉水溶液混合后放在烧杯中进行第一浸泡；所述洗衣粉水溶液中洗衣粉的的质量百分比优选为0.3％～0.5％，进一步优选为0.5％；所述第一浸泡的时间优选为10～15min，进一步优选为10min；通过限定洗衣粉水溶液的浓度和浸泡时间，有利于防止甜叶菊外植体褐化，提高外植体的存活率。本发明对所述洗衣粉的品牌、来源没有特殊的限定，常规购买即可。在本技术的实施例中，采用奥妙洗衣粉进行第一消毒处理。在第一浸泡的过程中，本发明优选充分振荡装有外植体和洗衣粉混合液的容器。由于甜叶菊外植体表面不光滑长有绒毛，容易藏菌，震荡后有利于促进外植体和洗衣粉溶液充分接触进行彻底的消毒，降低接种后的培养基的污染率、并降低组培褐化的几率。
41.所述第一浸泡后，本发明优选利用流动水将第一浸泡的外植体上的泡沫清洗干净。本发明对泡沫清洗的过程没有特殊的限定，采用本领域熟知的技术即可。
42.所述泡沫清洗干净后，本发明优选以流动水和ro水依次对无泡沫的外植体进行清洗，得到第一消毒的外植体。本发明优选将所述无泡沫的外植体转移至组培玻璃瓶中并封口后，再在流动水下进行冲洗；所述封口的材料优选为纱布；所述冲洗的时间优选为1.5～2h，进一步优选为2h。本发明所述ro水清洗时，优选包括将ro水倒进组培玻璃瓶中进行震荡；所述震荡的时间优选为1min；所述清洗的次数优选为2次。
43.本发明所述第二消毒优选在无菌条件下进行，进一步优选为在超净工作台上进行。本发明所述第二消毒优选包括将所述第一消毒的外植体与酒精混合进行第二浸泡。本发明所述酒精的体积百分比优选为70％～75％，进一步优选为75％；所述第二浸泡的时间
优选为30～40s，进一步优选为30s。
44.所述第二浸泡后，本发明优选以无菌水对第二浸泡的外植体进行清洗，得到第二消毒后的外植体。本发明所述第二浸泡后无菌水冲洗的次数优选包括2～3次，进一步优选为3次。
45.本发明所述第三消毒优选在无菌条件下进行，进一步优选为在超净工作台上进行。本发明所述第三消毒优选包括将第二消毒后的外植体与氯化汞溶液混合后第三浸泡。本发明所述氯化汞溶液的质量百分优选为0.1％；所述第三浸泡的时间优选为3～6min，进一步优选为5min。
46.所述第三浸泡后，本发明优选以无菌水对第三浸泡的外植体进行清洗，得到消毒后的外植体。本发明所述第三浸泡后无菌水冲洗的次数优选包括3～5次，进一步优选为5次。经消毒后可以杀死外植体表面的微生物和部分内生菌，有利于降低接种后外植体的污染率，防止褐化。
47.得到所述消毒后的外植体后，本发明优选对所述消毒后的外植体进行诱导培养，得到不定芽。在本发明中，所述诱导培养优选在上述技术方案中的诱导培养基中进行，所述诱导培养基已在上述技术方案中进行限定和优选，不再赘述；所述诱导培养优选在不定芽长至3～4cm时结束，进一步优选为不定芽长至1～2cm。
48.在本发明中，所述诱导培养的条件优选包括：培养温度为22～27℃，进一步优选为22～25℃，更优选为25℃；相对湿度为60％～70％，进一步优选为65％～70％，更优选为70％；光照强度为1500～2000lx，进一步优选为1600～2000lx，更优选为2000lx；光照时间为12～16h/d，更优选为16h/d；用于光照的光源优选包括led光源，所述led光源优选包括红光和蓝光，所述红光和蓝光光质的比值优选为(2～3)：1，进一步优选为3:1。
49.得到所述不定芽后，本发明优选对所述不定芽进行增殖培养，得到组培苗。在本发明中，所述增殖培养优选将不定芽切下后接种于上述技术方案中的增殖培养基中进行，所述增殖培养基已在上述技术方案中进行限定和优选，不再赘述；所述增殖培养的时间优选包括14～28d，更优选为19～21d。
50.在本发明中，所述增殖培养的条件优选包括：培养温度为22～27℃，进一步优选为22～25℃，更优选为25℃；相对湿度为60％～70％，进一步优选为65％～70％，更优选为70％；所述光照强度为1500～2000lx，进一步优选为1600～2000lx，更优选为2000lx；光照时间为12～16h/d，更优选为16h/d；用于光照的光源优选包括led光源，所述led光源优选包括红光和蓝光，所述红光和蓝光光质的比值优选为(2～3)：1，进一步优选为3:1。
51.得到所述组培苗后，本发明优选对所述组培苗进行生根培养，得到再生苗。在本发明中，所述生根培养优选将所述组培苗切成单株接种于上述技术方案中的生根培养基中进行，所述生根培养基已在上述技术方案中进行限定和优选，不再赘述；所述生根培养的时间优选包括14～28d，更优选为19～21d。
52.在本发明中，所述生根培养的条件优选包括：培养温度为22～27℃，进一步优选为22～25℃，更优选为25℃；相对湿度为60％～70％，进一步优选为65％～70％，更优选为70％；光照强度为1500～2000lx，进一步优选为1600～2000lx，更优选为2000lx；光照时间为12～16h/d，更优选为16h/d；用于光照的光源优选包括led光源，所述led光源优选包括红光和蓝光，所述红光和蓝光光质的比值优选为(2～3)：1，进一步优选为3:1。采用本发明提
供的培养条件有利于降低酚类物质、防止组培褐化，再生苗更为健壮。
53.得到所述再生苗后，本发明优选对所述再生苗进行炼苗处理。在本发明中，所述炼苗的方式优选包括：当再生苗的根长优选为3～5cm时，进一步优化为5cm时，将培养组培苗的瓶口打开，在培养室散射光下进行炼苗；所述炼苗的时间优选为5～10d，更优选为5d。经炼苗处理后，有利于减低组培苗根部感染细菌的几率，提升根部的活力。在本发明中，炼苗结束后优选将残留在再生苗根部的培养基清洗干净。本发明对炼苗清洗的方式没有特殊的要求，采用本领域熟知的技术即可。
54.所述炼苗处理后，本发明优选对炼苗处理后的再生苗进行移栽培养，得到再生甜叶菊。在本发明中，所述移栽培养优选包括室内移栽和室外培养。本发明所述室内移栽的方式优选包括在大棚培养条件下，将根部清洗干净的再生苗移栽至基质中进行培养。本发明所述基质优选包括泥炭土、蛭石和珍珠岩；所述泥炭土、蛭石和珍珠岩的质量比优选包括2:1:1；所述大棚培养条件优选包括：温度优选为20～25℃，进一步优选为22～25℃；相对湿度优选为70％～80％，进一步优选为70％。本发明优选当室内移栽的再生苗完全成活后，再将其移栽于室外培养。本发明对室外培养的方式、培养条件没有特殊的要求，采用本领域熟知的技术可知。本发明对所述再生苗完全成活的判定标准也没有特殊限定，采用本领域中常规判定方式即可。
55.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
56.在下述实施例和对比例的步骤2)～步骤4)中，如无特殊说明，诱导培养、增殖培养和生根培养的条件为：培养温度为22～25℃，相对湿度为60％～70％，光照强度为2000lx，光照时间为16h/d，光照的光源为led光源，其中led光源中红光和蓝光的光质比为3:1，所用培养基的ph值为5.8。
57.实施例1
58.一种防止甜叶菊组培褐化的方法，具体步骤如下:
59.步骤1)外植体的选择和消毒
60.选取处于旺盛生长状态且无病害的甜叶菊带腋芽幼嫩茎段，并将茎段两侧叶片去除，保留茎段长度为2～3cm作为外植体，将外植体放于烧杯中，用流动的自来水冲洗掉附着在材料表面的泥沙等杂质。
61.消毒时，将外植体与用质量百分浓度为0.5％的奥妙洗衣粉水溶液混合后放在烧杯中第一浸泡10min，期间需要进行充分的振荡，对外植体表面进行杀菌处理，随后以流水将浸泡后的外植体进行清洗，将泡沫清洗干净后，将外植体置换到组培玻璃瓶中，用纱布将组培玻璃瓶封口，放在流水下冲洗2h，冲洗过程中水流不易过大，以免对外植体造成伤害。冲洗结束后，再用ro水清洗2次，在清洗的过程中要充分震荡组培玻璃瓶，每次1min。之后在超净工作台内，于无菌环境下，用体积百分浓度为75％的酒精对外植体表面消毒30s，期间充分振荡后用无菌水冲洗3次，然后用质量百分浓度为0.1％的hgc12消毒后，无菌水冲洗5次，得到消毒后的外植体。其间，分4个实验组，不同实验组间只是hgc12消毒时间有差别，详见表1。
62.表1hgc12不同消毒时间对外植体的影响
[0063][0064]
由表1可以得出，利用质量百分浓度为0.1％的hgc12消毒3～6min时，外植体的成活率高达90～100％且培养基的污染率较低，其中hgc12消毒4min的外植体长势见图1。结合外植体的污染率和诱导率可知，延长消毒时间，诱导甜叶菊茎段产生不定芽的效果受到抑制。当0.1％的hgc12浸泡甜叶菊茎段6min时，不定芽诱导率为90.6％。因此，对甜叶菊带腋芽茎段进行消毒处理最适宜的方法为先用浓度为75％的酒精对茎段表面消毒处理30s，再用浓度为0.1％的升汞溶液浸泡茎段处理5min(见图2)，此时可达到较好的消毒效果，茎段污染率仅为21.1％，且有利于不定芽的产生，诱导率可达100％。
[0065]
步骤2)外植体的诱导培养
[0066]
将步骤1)中，利用hgc12消毒5min后得到消毒后的外植体进行诱导培养。
[0067]
a.首先确定诱导培养基中激素的浓度：在无菌操作台上，将消毒后的外植体切成1cm左右，用镊子将外植体放到滤纸吸干水分后，将外植体接种于诱导培养基上进行诱导培养。在诱导培养的过程中，共设置9个处理，在ms培养基的基础上添加6g
·
l-1
的琼脂和30g
·
l-1
的蔗糖，此外添加不同浓度6-ba和naa，且做两因素完全随机试验。诱导培养3周后，统计诱导率，添加不同激素诱导培养对不定芽的影响见表2。
[0068]
表2不同激素配比对不定芽诱导的影响
[0069][0070]
由表2可以得出，当培养基中添加浓度为0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba和0.1～0.5mg
·
l-1
的naa时，均有利于诱导不定芽的产生。而当采用a3培养基时，不定芽的诱导率最高达到
100％，且不定芽长势较好(见图3)。
[0071]
b.诱导培养基中褐化剂种类的确定：在确定最佳激素浓度的前提下，再对褐化剂的种类、浓度进行筛选。在此过程中，选用a3培养基：ms+0.5mg
·
l-1
的6-ba+0.5mg
·
l-1
的naa作为基础培养基，同时添加添加不同浓度、不同种类的褐化剂，以此对实施例1中利用hgc12消毒5min后得到消毒后的外植进行抗褐化剂处理试验，以确定诱导培养基的具体组分，褐化剂的添加种类和浓度见表3。
[0072]
表3添加不同抗褐化物对甜叶菊不定芽褐化的影响
[0073][0074][0075]
由表3可以得出，在a3培养基中加入活性炭ac、聚乙烯吡咯烷酮pvp、抗坏血酸vc后，均能能在不同程度上降低茎段褐化的发生，改善不定芽生长状况。但当添加0.5～1.5g
·
l-1
的活性碳时，防止甜叶菊不定芽褐变的效果最好，尤其时在添加1.0g
·
l-1
的活性炭处理时，此时甜叶菊组培苗褐变率最低仅为6.7％，且不定芽长势良好，植株健壮，生长快，叶绿宽大，无黄叶。
[0076]
步骤3)增殖培养
[0077]
将步骤2)中培养基：ms+0.5mg
·
l-1
的6-ba+0.5mg
·
l-1
naa+1.0g
·
l-1
的活性炭+6g
·
l-1
的琼脂+30g
·
l-1
的蔗糖上的不定芽长至1～2cm时，切下侧芽，进行增殖培养。
[0078]
在增殖培养的过程中，增殖培养基共设置9种，在ms培养基的基础上添加6g
·
l-1
的琼脂和30g
·
l-1
的蔗糖，此外添加不同浓度6-ba和naa，且做两因素完全随机试验。增殖培养3周后，统计增殖系数，观察不定芽的长势，不同增殖培养基对增殖培养的影响见表4。
[0079]
表4不同增殖培养基对增殖培养的影响
[0080][0081]
由表4可以得出，在进行增殖培养时，当添加0.5～1.5mg
·
l-1
的6-ba+0.1～0.5mg
·
l-1
的naa时，均有利于增殖系数的提升。其中，以j2培养基：ms+0.5mg
·
l-1
的6-ba+0.2mg
·
l-1
的naa进行增殖培养的效果最好，其增殖系数为3.3，并且不定芽多、粗壮、长势较好(见图4)。
[0082]
步骤4)生根培养
[0083]
当步骤3)表4中编号为j2的培养基培养的丛生芽长至2～3cm时切下，进行生根培养，经生根培养后甜叶菊再生苗的长势见图5。
[0084]
在生根培养的过程中，依据实验室前期验证发现，在1/2ms培养基上添加0～0.5mg
·
l-1
的iaa和0～0.5mg
·
l-1
的naa均有利于丛生芽进行生根培养。为了确定活性炭的添加浓度，在1/2ms+0.1mg
·
l-1
的iaa+0.1mg
·
l-1
的naa+6g
·
l-1
的琼脂+30g
·
l-1
的蔗糖的基础上添加不同浓度的活性炭。生根培养4周后，统计再生苗的生根率、根长和根数，不同生根培养基对生根培养的影响见表5。
[0085]
表5不同生根培养基对生根培养的影响
[0086][0087]
由表5可以得出，当培养基中添加1.0～1.5g
·
l-1
的活性炭时，再生苗的平均根长达到5.04～5.26cm，平均根数达5.17～5.21根，且再生苗的生根率最高可达85％。
[0088]
步骤5)炼苗及洗苗
[0089]
观察步骤4)表5中编号为3的培养基(1/2ms+0.1mg
·
l-1
的iaa+0.1mg
·
l-1
的naa+6g
·
l-1
的琼脂+30g
·
l-1
的蔗糖+1.0g
·
l-1
的活性炭)上组培苗的生长状况，待组培苗的根长约为5cm时即可进行炼苗。炼苗在培养室散射光条件下进行，炼苗时将组培苗的瓶口打开即可。不同炼苗时间对组培苗的成活率的影响具体见表6。炼苗后进行洗苗，洗苗时用镊子将经过炼苗处理的组培苗从瓶中轻轻取出，轻轻将残留在根部的培养基清洗干净即可。
[0090]
表6不同炼苗时间对组培苗成活率的影响
[0091][0092]
由表6可以得出，经过不同时间的炼苗，移栽成活率显著提高，随着炼苗时间的延长，组培苗的成活率增加，甜叶菊组培苗炼苗5天移栽后，第5d、10d、20d成活率均最高分别为96.93％、92.31％和90.77％。但超过适宜的炼苗时间成活率降低，炼苗6d的组培苗在移栽第5d、10d、20d成活率均有所下降，分别为90％、81.66％和78.33％。炼苗时间过长，组培苗移栽成活率降低的原因可能是：炼苗时间过长导致组培苗根部感染大量细菌，降低了根的活力。
[0093]
步骤6)移栽培养
[0094]
提前将泥炭土、蛭石和珍珠岩按照质量比2:1:1混合后，得到适合大棚移栽的基质。将步骤5)炼苗5d且长势基本一致的组培苗进行移栽培养。移栽时，将组培苗根部的培养基洗净后，移栽到基质中，浇定根水。在大棚外加盖遮阳网，保持大棚内的温度为20～25℃，相对湿度70％～80％。待小苗完全成活后，再移于室外自然条件下培养。
[0095]
对比例1
[0096]
步骤1)外植体的选择和消毒
[0097]
选取处于旺盛生长状态且无病害的甜叶菊带腋芽幼嫩茎段，并将茎段两侧叶片去除，保留茎段长度为2～3cm作为外植体，将外植体放于烧杯中，用流动的自来水冲洗掉附着在材料表面的泥沙等杂质。
[0098]
消毒时，将外植体与用质量百分浓度为0.5％的奥妙洗衣粉水溶液混合后放在烧杯中第一浸泡10min，期间需要进行充分的振荡，对外植体表面进行杀菌处理，随后以流水将浸泡后的外植体进行清洗，将泡沫清洗干净后，将外植体置换到组培玻璃瓶中，用纱布将组培玻璃瓶封口，放在流水下冲洗2h，冲洗过程中水流不易过大，以免对外植体造成伤害。冲洗结束后，再用ro水清洗2次，在清洗的过程中要充分震荡组培玻璃瓶，每次1min。之后在超净工作台内，于无菌环境下，用体积百分浓度为75％的酒精对外植体表面消毒30s，期间充分振荡后用无菌水冲洗3次，然后用质量百分浓度为0.1％的hgc12消毒5min，无菌水冲洗5次后，得到消毒后的外植体。
[0099]
步骤2)外植体的诱导培养
[0100]
将步骤1)中消毒后的外植体进行诱导培养，直至长出不定芽。
[0101]
诱导培养基为：ms+0.5mg
·
l-1
的6-ba+0.5mg
·
l-1
naa+1.0g
·
l-1
的活性炭+6g
·
l-1
的琼脂+30g
·
l-1
的蔗糖。
[0102]
步骤3)增殖培养
[0103]
当诱导培养的不定芽长至1～2cm时，切下侧芽，进行增殖培养。
[0104]
增殖培养为：ms+0.5mg
·
l-1
的6-ba+0.2mg
·
l-1
的naa+6g
·
l-1
的琼脂+30g
·
l-1
的蔗糖。
[0105]
步骤4)生根培养
[0106]
当增殖培养后，丛生芽长至2～3cm时切下，进行生根培养。
[0107]
生根培养为：1/2ms+0.1mg
·
l-1
的iaa+0.1mg
·
l-1
的naa+6g
·
l-1
的琼脂+30g
·
l-1
的蔗糖+1.0g
·
l-1
的活性炭。
[0108]
步骤5)炼苗及洗苗
[0109]
将炼苗5d且长势基本一致的组培苗进行移栽培养。
[0110]
步骤6)移栽培养
[0111]
移栽时，将组培苗根部的培养基洗净后，移栽到基质中，浇定根水。在大棚外加盖遮阳网，保持大棚内的温度为20～25℃，相对湿度70％～80％。待小苗完全成活后，再移于室外自然条件下培养。
[0112]
其中，步骤2)～步骤4)的培养条件：诱导培养、增殖培养和生根培养的条件为：培养温度为22～25℃，相对湿度为60％～70％，光照强度为2000lx，光照时间为16h/d，光照的光源为led光源，其中led光源中红光和蓝光的光质比为2:1，所用培养基的ph值为5.8。
[0113]
对比例2
[0114]
与对比例1不同之处在于：步骤2)～步骤4)的培养条件中，led光源中仅有红光，其中甜叶菊再生苗的长势见图6。
[0115]
对比例3
[0116]
与对比例1不同之处在于：步骤2)～步骤4)的培养条件中，led光源中仅有蓝光，其中甜叶菊再生苗的长势见图7。
[0117]
对比例4
[0118]
与对比例1不同之处在于：步骤2)～步骤4)的培养条件中，led光源中红光和蓝光的光质比为1:2。
[0119]
对比例5
[0120]
与对比例1不同之处在于：步骤2)～步骤4)的培养条件中，led光源中红光和蓝光的光质比为1:3。
[0121]
对比例6
[0122]
与对比例1不同之处在于：步骤2)的组培条件中，光源为白色荧光灯，其中甜叶菊再生苗的长势见图8，不同光源对组培甜叶菊的影响见表7。
[0123]
表7不同光源对组培甜叶菊的影响
[0124][0125][0126]
由表7可以得出，单一的红光处理有利于不定芽的增殖，增殖倍数达到最大值14.6，但不定芽长势细弱；而单一的蓝光处理较荧光灯处理也有明显增加，但增殖倍数小于红光。在光质组合处理中，红蓝光占据相同比例时，红光处理不定芽增殖倍数大于蓝光处理，因此，红光与蓝光相比更有利于甜叶菊不定芽的增殖。适宜不定芽增殖与生长的最佳led光源为红光与蓝光的光质比为(2～3):1时，不定芽的增殖倍数为12.8～13.9，不定芽较为粗壮，有利于降低组培苗褐化的几率。
[0127]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合，其特征在于，包括诱导培养基和生根培养基；所述诱导培养以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0.5～1.5mg
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l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
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l-1
的naa、0.5～1.5g
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l-1
的活性炭、15～35g
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l-1
的蔗糖和4～8g
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l-1
的琼脂粉；所述生根培养基以1/2ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0～0.5mg
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l-1
的iaa、0～0.5mg
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l-1
的naa、1.0～1.5g
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l-1
的活性炭、15～35g
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l-1
的蔗糖和4～8g
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l-1
的琼脂粉。2.根据权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，所述培养基组合还包括增殖培养基。3.根据权利要求2所述的培养基组合，其特征在于，所述增殖培养以ms培养基为基础培养基，还包括以下含量组分：0.5～1.5mg
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l-1
的6-ba、0.1～0.5mg
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l-1
的naa、15～35g
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l-1
的蔗糖和4～8g
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l-1
的琼脂粉。4.权利要求1～3任一项所述的培养基组合在防止甜叶菊组培褐化中的应用。5.一种防止甜叶菊组培褐化的方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的培养基组合，包括以下步骤：将消毒后的外植体接种至所述的诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；将所述不定芽接种至所述的增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗；将所述组培苗接种至所述的生根培养基中进行生根培养，得到再生苗；将所述再生苗进行移栽培育，得到再生甜叶菊。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对外植体依次进行第一消毒、第二消毒和第三消毒，得到所述消毒后的外植体；所述第一消毒包括：将外植体与质量百分比为0.3％～0.5％的洗衣粉水溶液混合后第一浸泡10～15min，以流动水和ro水依次对第一浸泡的外植体进行清洗，得到第一消毒后的外植体；所述第二消毒包括：将所述第一消毒后的外植体与体积百分比为75％的酒精混合后第二浸泡30～40s，以无菌水对第二浸泡后的外植体进行清洗，得到第二消毒后的外植体；所述第三消毒包括：将所述第二消毒后的外植体与质量百分比为0.1％的氯化汞溶液混合后第三浸泡4～6min，以无菌水对第三浸泡后的外植体进行再次清洗。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一浸泡过程中包括对装有外植体和洗衣粉混合液的容器进行震荡。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导培养、增殖培养和生根培养的培养基的ph值分别为5.8～6.0。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导培养、增殖培养和生根培养的培养条件分别包括：培养温度为22～27℃，相对湿度为60％～70％，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～16h/d。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用于光照的光源包括led光源；所述led光源包括红光和蓝光。

技术总结
本发明属于甜叶菊组培技术领域，具体涉及一种防止甜叶菊组培褐化的培养基组合及其应用。本发明通过在诱导培养基中添加活性炭能够吸收释放的酚酸类物质，降低甜叶菊组培苗褐化，有效防止外植体褐变，得到健壮、叶绿宽大、无黄叶的不定芽；通过在生根培养基中添加活性炭，能够促进组培苗生根，提高组培苗的生根数和根长，有利于得到长势良好、健壮且叶绿的甜叶菊再生苗。叶菊再生苗。叶菊再生苗。


技术研发人员：王冬良 何润琳 陈友根 邹良昊 陈珂畯 丁银媛 张玲
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/9