重组酿酒酵母利用阿魏酸生产高圣草酚的应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组酿酒酵母利用阿魏酸生产高圣草酚的应用。


背景技术：

2.黄酮是一种广泛存在于植物中的营养物质，具有许多健康保健作用。与非氧甲基化黄酮相比，氧甲基化黄酮具有更好的生物活性和药理特性。高圣草酚是一种存在于北美圣草中的高价值的氧甲基化黄酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌等作用。更重要的是，高圣草酚及其衍生物可以显著降低食物或药物的苦味，而不会表现出其自身的强烈味道，二者被作为苦味掩蔽剂广泛地应用于食品及药品工业。因此，实现高圣草酚的可持续供应至关重要。获得高圣草酚的传统方法包括植物提取和化学合成。然而，植物的季节性及区域性导致植物提取方法并不实用。受到有毒试剂及极端反应条件的限制，化学合成方法的安全性无法保证。近几年来，微生物生产高圣草酚的方法因其工艺周期短、效率高、环境友好等优点而受到广泛的关注。
3.先前的研究在大肠杆菌中构建了从阿魏酸出发生产高圣草酚生物合成途径(图1)。阿魏酸是一种甲基化苯丙酸。大多数4-对香豆酰辅酶a连接酶(4-coumarate-coa ligase：4cl)和查尔酮合酶(chalcone synthase：chs)并不能将甲基化的苯丙酸及其对应的辅酶a作为底物，但几种来源于植物且具有广泛特异性的4cl和chs可以发挥这一功能。现有技术公开了一株含有来自水稻的4cl及来自大麦的chs的工程大肠杆菌，用于利用阿魏酸合成高圣草酚，该工作的高圣草酚产量为52mg/l，转化率为17.2％。现有技术公开了含有来自葡萄的4cl、来自拟南芥的chs及来自拟南芥的查尔酮异构酶(chalcone isomerase：chi)的工程大肠杆菌，以甘油为碳源，以阿魏酸作为中间产物合成高圣草酚，该工作的高圣草酚产量为17mg/l。
4.目前已报道过的有关高圣草酚的微生物生产都局限以大肠杆菌作为底盘菌进行改造，尚未有有关在酿酒酵母中生产高圣草酚的报道。因此，提供能够利用阿魏酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供的菌株及其应用，能够利用阿魏酸生产高圣草酚，相比现有技术具有更高的产率及转化率。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了基因工程改造在提高微生物将底物转化为高圣草酚的转化率中的应用；
8.所述基因工程改造为：
9.(i)、添加来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因；
10.所述基因工程改造还包括：
11.(ii)、添加来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；和
12.(iii)、添加来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因；
13.所述微生物包括大肠杆菌和/或酵母；
14.所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d；
15.所述底物包括阿魏酸。
16.本发明还提供了基因元件，包括：
17.(i)、基因元件1；或
18.(ii)、基因元件1、基因元件2和基因元件3；
19.所述基因元件1具有来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因；
20.所述基因元件2具有来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；
21.所述基因元件3具有来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因。
22.在本发明的一些具体实施方案中，上述基因元件包括：
23.所述来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因序列包括：
24.(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或
25.(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
26.(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
27.所述来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因序列包括：
28.(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或
29.(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
30.(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
31.所述来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因序列包括：
32.(7)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或
33.(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
34.(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
35.所述多个为2个至160个。
36.本发明还提供了表达盒，包括：
37.(i)、表达盒1；或
38.(ii)、表达盒1、表达盒2和表达盒3；
39.所述表达盒1包括启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件1；
40.所述表达盒2包括启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件2；
41.所述表达盒3包括启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件3；
42.所述启动子包括ptpi1、ptef1或pgpm1；
43.所述终止子包括tcps1、ttef2或tadh1。
44.本发明还提供了表达载体，具有：
45.(10)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或
46.(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷
酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或
47.(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
48.所述多个为2个至1000个。
49.本发明还提供了表达载体，包括cas9编码基因、绿色荧光蛋白编码基因、his3编码基因、卡那霉素编码基因和grna，以及可接受的基因元件。
50.本发明还提供了表达系统，包括上述表达载体、linker和如下任一项：
51.(a)、上述基因元件；或
52.(b)、上述表达盒。
53.本发明还提供了宿主细胞，包括如下任一项：
54.(a)、上述基因元件；
55.(b)、上述表达盒；
56.(c)、上述表达系统；
57.所述宿主细胞包括酵母；
58.所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d。
59.本发明还提供了酿酒酵母cen.pk2-1d的重组菌株，包括添加来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因。
60.在本发明的一些具体实施方案中，上述重组菌株还包括：
61.添加来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；和
62.添加来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因。
63.本发明还提供了组合物，包括阿魏酸和如下任一项：
64.(e)、上述宿主细胞；或
65.(f)、上述重组菌株。
66.本发明还提供了高圣草酚的制备方法，包括：
67.(a)、将上述基因元件整合至酵母的基因组，然后与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
68.(b)、取上述表达盒整合至酵母的基因组，然后与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
69.(c)、取上述表达系统导入酵母，再与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
70.(d)、取上述宿主细胞或上述重组菌株与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
71.(e)、培养上述组合物，获得所述高圣草酚；
72.所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d。
73.在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因在酵母中的插入位点为delta15。
74.在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因在酵母中的插入位点为delta15。
75.在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因在酵母中的插入位点为delta15。
76.本发明的菌株及其应用有如下效果：
77.实验表明，用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基ypd进行摇瓶发酵，初始od
600
＝0.1，在0h
补加0.26mmol/l的阿魏酸，30℃，220rpm摇床中培养72h，高圣草酚的产量为0.04mmol/l，得率为28.6％。现有技术可以在大肠杆菌以阿魏酸为底物生产高圣草酚，得率为17.2％。该得率较低。本发明首次利用酿酒酵母从阿魏酸生产高圣草酚，相比之下，得率较现有技术高66.3％。
附图说明
78.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
79.图1示从阿魏酸出发生产高圣草酚生物合成途径；
80.图2示途径酶筛选结果。
具体实施方式
81.本发明公开了菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
82.本发明通过人工途径构建、途径酶筛选策略获得一株能够利用阿魏酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母。
83.为了打通由阿魏酸到高圣草酚的途径，本发明通过筛选能够在酿酒酵母中成功合成高圣草酚的4-对香豆酰辅酶a连接酶4cl、查尔酮合酶chs、查尔酮异构酶chi的组合。本发明首先尝试在酿酒酵母中表达来源于日本水稻的4-对香豆酰辅酶a连接酶4cl、来源于青稞的查尔酮合酶chs、来源于青稞的查尔酮异构酶chi，然而并未在菌株发酵后检测到高圣草酚，并且阿魏酸几乎未被消耗(yfa001菌株)。接下来，本发明对4cl基因进行替换，以来源于拟南芥的对香豆酰辅酶a连接酶4cl及来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl作为候选基因。同样地，来源于拟南芥的对香豆酰辅酶a连接酶4cl、来源于青稞的查尔酮合酶chs、来源于青稞的查尔酮异构酶chi的组合也无法实现高圣草酚的合成(yfa002菌株)。而含有来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl、来源于青稞的查尔酮合酶chs、来源于青稞的查尔酮异构酶chi组合的酿酒酵母能够成功地利用阿魏酸合成高圣草酚(yfa003菌株)。最后，本发明将该有效组合整合至酿酒酵母cen.pk2-1d(可在biobw：https://www.biobw.org/购买，编号为：bio-110854)的基因组上。
84.本发明涉及的序列信息如下：
85.4cl序列(seq id no:1)：
86.atgggtgactgcgttgccccgaaagaggatctgatcttccgcagcaaactgccggacatttacattccaaagcatctgccgctgcatacctattgttttgagaacatcagcaaggttggcgacaagagctgtctgatcaacggcgcaaccggcgaaacctttacctacagccaggttgagctgctgtcccgtaaagttgccagcggcctgaacaagctgggcattcaacaaggtgataccattatgctgctgctgccgaactccccggagtactttttcgctttcctgggtgcgagctatcgcggtgcaatcagcactatggcgaacccattctttaccagcgcagaagtgatcaagcaactgaaagcgagccaagcgaagctgattatcacccaggcatgctatgttgacaaggttaaggactacgcagcggagaaaaacatccaga
tcatttgtattgacgatgcaccgcaggattgcctgcactttagcaagctgatggaagcggatgagagcgaaatgccggaagtggttattaacagcgatgatgtggtggcactgccgtacagctctggcaccaccggcctgccgaaaggcgttatgctgacccacaagggtctggttaccagcgttgcacaacaggtggatggtgataacccgaacctgtatatgcactccgaggatgttatgatctgcatcctgccactgttccatatctatagcctgaacgctgttctgtgttgtggtctgcgtgcgggcgttaccattctgatcatgcaaaagttcgacattgtgccgtttctggagctgattcagaagtataaggttaccattggtccgtttgttccgccgatcgtgctggccatcgcgaaaagcccggttgttgacaagtacgacctgtctagcgtgcgcaccgttatgagcggtgcagcgccgctgggtaaagagctggaggacgctgttcgtgcgaaattcccgaacgcgaagctgggtcaaggctatggcatgaccgaagccggtccggttctggcgatgtgtctggcgttcgccaaagagccgtatgagattaagtctggcgcatgcggtaccgttgtgcgtaacgccgagatgaaaatcgttgacccagaaaccaacgcgtctctgccgcgtaaccagcgtggtgagatttgcatccgtggtgatcagattatgaaaggttacctgaacgacccggaaagcacccgcaccaccatcgacgaagagggttggctgcacaccggtgacattggtttcatcgacgatgacgatgaactgttcattgttgatcgtctgaaagaaatcattaagtacaaaggttttcaagttgctccggcggagctggaagcactgctgctgacccacccgaccatcagcgatgccgcggtggttccgatgattgacgagaaagcgggtgaagtgccagtggcgtttgttgtgcgtaccaacggttttaccaccaccgaagaagaaatcaaacaatttgtgagcaaacaggttgtgttctacaaacgtatcttccgcgttttcttcgttgacgctattccgaaatccccgagcggcaagattctgcgtaaggatctgcgcgctcgtattgcgagcggcgacctgccgaagtaa
87.chs序列(seq id no:2)：
88.atggctgctgttagattaaaagaagttagaatggctcaaagagctgaaggtttggctactgttttggctattggtactgctgttccagctaattgtgtttatcaagctacttatccagattattacttcagagttacaaagtctgaacatttagctgatttgaaagaaaagttccaaagaatgtgtgataagtctatgattagaaagagacatatgcatttgactgaagaaattttgatcaagaacccaaaaatctgtgctcatatggaaacttctttggatgctagacatgctattgctttagttgaagttccaaaattgggtcaaggtgctgctgaaaaagctattaaagaatggggtcaaccattatctaaaattacacatttggtcttctgcactacatctggtgttgatatgccaggtgctgattatcaattaactaaattgttgggtctgtctccaacagttaaaagattaatgatgtaccaacagggttgttttggtggtgctacagttttgagattagctaaagatattgctgaaaacaacagaggtgctagagttttggttgtttgttctgaaattacagctatggcttttagaggtccatgtaaatctcatttagattctttggttggtcatgctttgtttggtgatggtgctgctgctgctattattggtgctgatccagatcaattagatgaacaaccagtttttcaattggtttctgcttctcaaactattttgccagaatctgaaggtgctattgatggtcatttaacagaagctggtttaactattcatttgttaaaggatgtcccaggtttgatttctgaaaatattgaacaagctctggaagatgcttttgaaccattaggtattcataattggaactctattttctggatcgctcatccaggtggtccagctattttagatagagttgaagatagagttggtttagataaaaagagaatgagagcttctagagaagttttatctgaatatggtaacatgtcttctgcttctgttttatttgttttggatgttatgaggaagtcttctgctaaagatggtttagctacaactggtgaaggtaaagattggggtgttttatttggttttggtccaggtttaactgttgaaacattggttttacattccgttccagttccagttcctactgctgcttctgcttaa
89.chi序列(seq id no:3)：
90.atggctgtttctgaattagaagttgatggtgttgtttttccaccattagctagaccaccaggttctgctcatgctcattttttagctggtgctggtgttagaggtatggaaattggtggtcattttattaaattcaccgctattggtgtttacttacaagctgatgctgctgtttctgctttggctgctaaatgggctggtaaaccagctgctgatttagcttctgatgctgctttttttagagatgttgttacaggtgaatttgaaaaattcacaagagttacaatgatcttgccattaactggtgctcaatattctgataaagttacagaaaactgcgttgcttattggaaagctgctggtgtttatacagatgc
tgaagctgctgctgttgataaatttaaagaagcttttggtccacattcttttgctccaggtgcttctattttgtttactcattctccagctggtgttttgacagttgctttttctaaagattcttctgttccagaatctggtggtgttgctattgaaaatgctagattgtgtgaagctgttttagaatctattatcggtgaacatggtgtttctccagctgctaaattgtctttggctaatagagttgctgaattgttgaaaggtgctgctcatgctggtggtgaaccagctgctgaaccagttccagtttctgtttaa
91.crispr质粒序列，以靶向delta15位点的质粒为例，下划线加粗部分为grna(seq id no:4)：
92.93.[0094][0095]
本发明中所述linker即连接体，连接两个酶的编码基因。
[0096]
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
[0097]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0098]
实施例：将4cl基因整合至酵母基因组delta15位点的方法
[0099]
主要利用的是crispr以及同源重组的技术。首先构建4cl基因的表达盒：ptpi1-4cl-tcps1。
[0100]
启动子ptpi1以酵母基因组为模板，用以下引物进行扩增：
[0101]
tatatctaggaacccatcaggt(seq id no: 5)；
[0102]
ttttagtttatgtatgtgttttttgtagt(seq id no:6)。
[0103]
4cl基因(擎科生物公司合成)利用引物进行扩增：
[0104]
aaacacatacataaactaaaagcatgggtgactgcgttgc(seq id no:7)；
[0105]
gactattcaatcattgcgcgcttacttcggcaggtcgcc(seq id no:8)。
[0106]
此处4cl的上下引的5’端分别带有与启动子、终止子同源的20bp区域。
[0107]
终止子tcps1以酵母基因组为模板，用以下引物进行扩增：
[0108]
gcgcaatgattgaatagtcaaa(seq id no:9)；
[0109]
agaataggtttcgttttctggaa(seq id no:10)。
[0110]
将以上三个扩增片段进行overlap pcr，获得4cl的表达盒。接下来以酵母基因组作为模板，扩增同源重组所用的连接体片段。
[0111]
linker1-1用引物进行扩增，下引带有与启动子同源的20bp：
[0112]
cgattcaattttggggattct(seq id no:11)；
[0113]
atttgagaaagtggtgtattttaagattatatctaggaacccatcaggt(seq id no:12)。
[0114]
linker2-1用引物进行扩增，上引带有与终止子同源的20bp：
[0115]
agaataggtttcgttttctggaaatggcaaagactataatattatgcat(seq id no:13)；
[0116]
atattttggcattactcttcatcat(seq id no:14)。
[0117]
将linker1-1与启动子片段进行overlap pcr，linker2-1与终止子片段进行overlap pcr，分别获得linker1与linker2。接下来在delta15位点上寻找pam序列(ngg)前20bp作为grna，本例grna为：atatgtttggtttcgattgt(seq id no:15)。接下来将crispr-grna-cas9-his质粒与4cl表达盒、linker1、linker2转化至酿酒酵母cen.pk2-1d内，涂布在酵母基础培养基(sc-his)培养3-4天获得重组酵母菌株。在插入位点上游、基因寻找第一对验证引物，验证接口1长度为1000bp左右。在插入位点下游、基因寻找第二对验证引物，验证接口2长度为1000bp左右。此例第一对验证引物：aggaatgaaacatataaaacgaaagg(seq id no:16)、atgctttggaatgtaaatgtcc(seq id no:17)。第二对验证引物：agattctgcgtaaggatctg(seq id no:18)、ttgaaattgtaatcttaagatgctctt(seq id no:19)。
[0118]
来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因或来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因整合至酿酒酵母cen.pk2-1d基因组的方法同上述将4cl基因整合至酵母基因组delta15位点的方法。
[0119]
效果例
[0120]
按照上述实施例的方法，在完成途径酶筛选后，本发明成功获得了一株能够利用阿魏酸合成高圣草酚的酿酒酵母菌株。进行摇瓶发酵，培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基ypd。发酵条件：初始od
600
＝0.1，在0h补加0.26mmol/l的阿魏酸，30℃，220rpm摇床中培养72h。高圣草酚的产量为0.04mmol/l，得率为28.6％。如图2所示(对应数据如表1所示)。
[0121]
现有技术可以在大肠杆菌以阿魏酸为底物生产高圣草酚，得率为17.2％。该得率较低。相比之下，本发明的优点在于：首次利用酿酒酵母从阿魏酸生产高圣草酚，得率较现有技术高66.3％。
[0122]
表1
[0123]
菌株阿魏酸-1阿魏酸-2高圣草酚-1高圣草酚-2od
600-1od
600-2yfa0010.267630.23653009.8879.524yfa0020.257330.23122009.6688.973yfa0030.113060.132460.042530.04037.0527.103
[0124]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.基因工程改造在提高微生物将底物转化为高圣草酚的转化率中的应用；所述基因工程改造为：(i)、添加来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因；所述基因工程改造还包括：(ii)、添加来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；和(iii)、添加来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因；所述微生物包括大肠杆菌和/或酵母；所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d；所述底物包括阿魏酸。2.基因元件，其特征在于，包括：(i)、基因元件1；或(ii)、基因元件1、基因元件2和基因元件3；所述基因元件1具有来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因；所述基因元件2具有来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；所述基因元件3具有来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因。3.如权利要求2所述的基因元件，其特征在于，包括：所述来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因序列包括：(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因序列包括：(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因序列包括：(7)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至160个。4.表达盒，其特征在于，包括：(i)、表达盒1；或(ii)、表达盒1、表达盒2和表达盒3；所述表达盒1包括启动子、终止子和如权利要求2或3所述的基因元件中的所述基因元件1；所述表达盒2包括启动子、终止子和如权利要求2或3所述的基因元件中的所述基因元件2；
所述表达盒3包括启动子、终止子和如权利要求2或3所述的基因元件中的所述基因元件3；所述启动子包括ptpi1、pgpm1或ptef1；所述终止子包括tcps1、ttef2或tadh1。5.表达系统，其特征在于，包括表达载体、linker和如下任一项：(a)、如权利要求2或3所述的基因元件；或(b)、如权利要求4所述的表达盒；所述表达载体包括cas9编码基因、绿色荧光蛋白编码基因、his3编码基因、卡那霉素编码基因和grna；或所述表达载体具有：(10)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至1000个。6.宿主细胞，其特征在于，包括如下任一项：(a)、如权利要求2或3所述的基因元件；(b)、如权利要求4所述的表达盒；(c)、如权利要求5所述的表达系统；所述宿主细胞包括酵母；所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d。7.酿酒酵母cen.pk2-1d的重组菌株，其特征在于，包括添加来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因。8.如权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，还包括：添加来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；和添加来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因。9.组合物，其特征在于，包括阿魏酸和如下任一项：(e)、如权利要求6所述的宿主细胞；或(f)、如权利要求7或8所述的重组菌株。10.高圣草酚的制备方法，其特征在于，包括：(a)、将如权利要求2或3所述的基因元件整合至酵母的基因组，然后与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或(b)、取如权利要求4所述的表达盒整合至酵母的基因组，然后与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或(c)、取如权利要求5所述的表达系统导入酵母，再与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或(d)、取如权利要求6所述的宿主细胞或如权利要求7或8所述的重组菌株与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或(e)、培养如权利要求9所述的组合物，获得所述高圣草酚；
所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组酿酒酵母利用阿魏酸生产高圣草酚的应用。本发明通过人工途径构建、途径酶筛选策略获得一株能够利用阿魏酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母。实验表明，本发明菌株生产高圣草酚产量为0.04mmol/l，得率为28.6％。而现有技术大肠杆菌以阿魏酸为底物生产高圣草酚的得率为17.2％。17.2％。


技术研发人员：元英进 李炳志 朱思雨 刘志华
受保护的技术使用者：天津大学合成生物前沿研究院
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/9