替尔泊肽的纯化方法与流程

1.本发明属于多肽合成纯化技术领域，具体涉及一种替尔泊肽的纯化方法。


背景技术：

2.替尔泊肽是一款葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)和胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体双重激动剂，可通过双重作用机制激活参与血糖控制的激素受体gip和glp-1两种肠促胰素受体。期临床研究显示，替尔泊肽在显著改善2型糖尿病患者的血糖水平时，还能够降低患者体重。6个月数据显示，替尔泊肽能将2型糖尿病hba1c水平平均降低2.4％，体重减重11.3kg(12.7％)。替尔泊肽在保持疗效的同时，降低了患者胃肠道不良事件发生率。替尔泊肽的总体安全性与胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂类别一致。胃肠道副作用是最常见的不良反应，通常发生在剂量递增期，然后随着时间的推移而减少。替尔泊肽除对2型糖尿病和肥胖症疗效显著外，对非酒精性脂肪性肝炎也显示出一定的治疗潜力。
3.现有固液混合法制备中的杂质难以去除分离，影响替尔泊肽的收率及纯度。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种分离效果好、纯度高的替尔泊肽的制备方法。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种替尔泊肽的纯化方法，包括：首先对氨基酸试剂进行活化处理制成氨基酸活化液；然后将含有fmoc-ser(tbu)-oh的氨基酸活化液与rink amide am树脂进行偶联，得到偶联fmoc-ser(tbu)-树脂；然后按替尔泊肽的肽序进行偶联、脱保护直至得到替尔泊肽-树脂，采用裂解液对替尔泊肽-树脂进行裂解，得到替尔泊肽粗产物，经分离柱纯化，得到替尔泊肽；分离柱中至少含有硅胶和功能化硅胶；功能化硅胶由活化硅胶与氯丙基硅烷试剂、改性剂经反应化合制成；氯丙基硅烷试剂包括3-氯丙基三乙氧基硅烷，改性剂包括二聚氨基氰和/或乙酰唑胺。本发明通过改性处理，在硅胶上引入二聚氨基氰或乙酰唑胺的基团得到功能化硅胶，在将功能化硅胶与硅胶混合，制成分离柱，然后用于肽的纯化，硅胶上的二聚氨基氰或乙酰唑胺的基团与肽粗产物相接触，使目标产物与杂质的保留时间不同，使目标产物与杂质分离，提高肽的纯度。而在将二聚氨基氰和乙酰唑胺共同引入硅胶上后，其对止标肽的分离效果更佳。
6.优选地，氨基酸试剂包括如下试剂：fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-pro-oh， fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh和 fmoc-glu(otbu)-oh。
7.优选地，活化硅胶由硅胶于酸性溶液中活化处理得到。
8.优选地，功能化硅胶制备中，首先由3-氯丙基三乙氧基硅烷与硅胶反应制成氯丙基硅胶，然后由改性剂与氯丙基硅胶反应制成；和/或，3-氯丙基三乙氧基硅烷的使用量为
活化硅胶的50-150wt%；和/或，改性剂的使用量为氯丙基硅胶的20-150wt%。
9.优选地，功能化硅胶制备中使用的溶剂为甲苯。
10.优选地，分离柱中还含有改性硅藻土。
11.更优选地，改性硅藻土由乙酰丙酸对硅藻土改性制成；和/或，改性硅藻土的使用量为功能化硅胶的50-200wt%。
12.更优选地，乙酰丙酸的使用量为硅藻土的1-5wt%。
13.本发明公开了一种功能化硅胶在分离纯化多肽中的用途，功能化硅胶由活化硅胶与氯丙基硅烷试剂、改性剂经反应化合制成；氯丙基硅烷试剂包括3-氯丙基三乙氧基硅烷，改性剂包括二聚氨基氰和/或乙酰唑胺。
14.本发明公开了一种功能化硅胶与改性硅藻土在分离纯化多肽中的用途，功能化硅胶由活化硅胶与氯丙基硅烷试剂、改性剂经反应化合制成；氯丙基硅烷试剂包括3-氯丙基三乙氧基硅烷，改性剂包括二聚氨基氰和/或乙酰唑胺；改性硅藻土由乙酰丙酸对硅藻土改性制成。
15.优选地，fmoc-aeea-oh的活化液的制备中，将fmoc-aeea-oh和hobt加入dmf中，然后在冰浴下加入dic，活化5min，得到fmoc-aeea-oh的活化液。
16.更优选地，fmoc-aeea-oh的使用量与dmf的使用量的关系为0.2mol/l。
17.更优选地，hobt的使用量与dmf的使用量的关系为20g/l。
18.更优选地，dic的使用量与dmf的使用量的关系为20 g/l。
19.优选地，按上述步骤，制备fmoc-γglu(α-otbu)-oh和二十烷二酸单叔丁基酯的活化液，即将fmoc-aeea-oh替换为fmoc-γglu(α-otbu)-oh或二十烷二酸单叔丁基酯。
20.优选地，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh的制备中，将rink amide am树脂加入固相反应器中，dmf溶胀并洗涤，加入fmoc-aeea-oh、diea及dmf，反应6h，抽干，dmf洗涤，然后加入哌啶的dmf溶液脱保护20min，dmf洗涤；加入fmoc-aeea-oh的活化液，反应2h，抽干，dmf洗涤；重复脱保护、偶联的步骤偶联fmoc-γglu(α-otbu)-oh和二十烷二酸单叔丁基酯，反应完成后，抽干，dmf洗涤，加入裂解液反应2h，过滤，滤液旋干，得到中间产物；然后加入pfp-oh和二氯甲烷，在0℃下加入edci，反应15min，然后在25℃反应2h，反应完成后，反应液依次采用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到油状粘稠物，加入四氢呋喃制成油状粘稠物溶液；然后在5℃下加入fmoc-lys-oh溶液，加完后在25℃继续反应3h，反应完成后，调节ph至3-4，旋干四氢呋喃，dcm萃取，有机相干燥浓缩，纯化，得到fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh。
21.更优选地，第一步反应中fmoc-aeea-oh的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为2mol/kg，diea的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为4mol/kg，dmf的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为5l/kg。
22.更优选地，第二步偶联反应中，fmoc-aeea-oh的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg。
23.更优选地，第三步偶联反应中，fmoc-γglu(α-otbu)-oh的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg。
24.更优选地，第四步偶联反应中，二十烷二酸单叔丁基酯的使用量与rink amide am
树脂的使用量的关系为0.8mol/kg；裂解液为tfe的dcm溶液，裂解液中tfe的量为dcm的20wt%。
25.更优选地，第五步反应中，pfp-oh的使用量为中间产物的20-30wt%，二氯甲烷的使用量为中间产物的200-400wt%，edci的使用量为中间产物的20-40wt%。
26.更优选地，第六步反应中，四氢呋喃的使用量为油状粘稠物的量的400-600wt%，fmoc-lys-oh溶液由fmoc-lys-oh与碳酸钠溶液和四氢呋喃混合制成，fmoc-lys-oh溶液的混合中，碳酸钠溶液含有10wt%的碳酸钠，碳酸钠溶液的使用量为四氢呋喃的80-120wt%，fmoc-lys-oh溶液中fmoc-lys-oh的含量为0.2mol/l，fmoc-lys-oh溶液的使用量为油状粘稠物溶液的80-120wt%。
27.更优选地，哌啶的dmf溶液为脱保护液，脱保护液中哌啶的体积使用量为dmf的体积使用量的20%。
28.优选地，氨基酸活化液的制备中，将氨基酸试剂和hobt加入dmf中，然后在冰浴下加入dic，活化5min，得到氨基酸活化液。
29.更优选地，氨基酸活化液的制备中，氨基酸衍生物的使用量与dmf的使用量的关系为0.2mol/l，hobt的使用量与dmf的使用量的关系为20g/l，dic的使用量与dmf的使用量的关系为20 g/l。
30.更优选地，氨基酸试剂包括如下种类：fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh。
31.优选地，将rink amide am树脂加入固相反应器中，dmf溶胀及洗涤，然后加入氨基酸活化液，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，dmf洗涤，然后加入哌啶的dmf溶液脱保护20min，dmf洗涤，茚三酮检测结果呈阳性。氨基酸活化液的使用量以其中氨基酸试剂为计量基准，氨基酸试剂的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg。哌啶的dmf溶液为脱保护液，脱保护液中哌啶的体积使用量为dmf的体积使用量的20%。
32.优选地，重复偶联、脱保护的步骤，按替尔泊肽的肽序依次加入fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh的氨基酸活性液。
33.优选地，将上述步骤得到的替尔泊肽-树脂加入裂解液中，反应2h，过滤，滤液浓缩，加入冰冻乙醚，析出沉淀，得到替尔泊肽粗产物。裂解液中含有tfa、tis和水，裂解液中tfa的体积分数为90%，裂解液中tis的体积分数为5%，裂解液中水的体积分数为5%。
34.优选地，硅胶的活化中，将硅胶浸入盐酸中，在50-70℃下加热处理4-12h，处理完
成后，蒸馏水洗涤至中性，干燥，然后于100-150℃下活化2-6h，得到活化硅胶。
35.更优选地，硅胶的活化中，盐酸的浓度为3-6mol/l，硅胶的使用量为盐酸的20-40wt%。
36.更优选地，硅胶的活化中，盐酸的浓度为5mol/l，盐酸的使用量为1000g，硅胶的使用量为300g。
37.优选地，氯丙基硅胶的制备中，将活化硅胶加入甲苯中，然后加入3-氯丙基三乙氧基硅烷，在100-120℃下搅拌反应12-36h，反应完成后，冷却过滤，依次采用甲苯、乙醇和乙醚洗涤，干燥，得到氯丙基硅胶。
38.更优选地，氯丙基硅胶的制备中，活化硅胶的使用量为甲苯的20-40wt%，3-氯丙基三乙氧基硅烷的使用量为活化硅胶的50-150wt%。
39.更优选地，氯丙基硅胶的制备中，甲苯的使用量为100g，活化硅胶的使用量为30g，3-氯丙基三乙氧基硅烷的使用量为30g。
40.优选地，功能化硅胶的制备中，将氯丙基硅胶加入甲苯中，然后加入改性剂，回流搅拌6-24h，反应完成后，冷却过滤，洗涤，干燥，得到功能化硅胶。
41.更优选地，功能化硅胶的制备中，氯丙基硅胶的使用量为甲苯的5-15wt%，改性剂为二聚氨基氰，二聚氨基氰的使用量为氯丙基硅胶的20-150wt%。
42.更优选地，功能化硅胶的制备中，改性剂为乙酰唑胺，乙酰唑胺的使用量为氯丙基硅胶的20-150wt%更优选地，功能化硅胶的制备中，甲苯的使用量为100g，氯丙基硅胶的使用量为10g，二聚氨基氰的使用量为10g。
43.更优选地，功能化硅胶的制备中，乙酰唑胺的使用量为10g。
44.优选地，替尔泊肽的纯化中，将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。
45.更优选地，替尔泊肽的纯化中，分离柱中上层为硅胶，中层为功能化硅胶，下层为硅胶，分离柱中功能化硅胶占比为80wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。
46.优选地，改性硅藻土的制备中，将硅藻土加入去离子水中，超声分散，然后加入乙酰丙酸，搅拌混合均匀，在60-80℃下处理1-5h，处理完成后，过滤，洗涤，干燥，得到改性硅藻土。
47.更优选地，改性硅藻土的制备中，硅藻土的使用量为去离子水的1-5wt%，乙酰丙酸的使用量为硅藻土的1-5wt%。
48.更优选地，改性硅藻土的制备中，去离子水的使用量为100g，硅藻土的使用量为3g，乙酰丙酸的使用量为0.09g。
49.优选地，替尔泊肽的纯化中，分离柱中上层为硅胶，中层为功能化硅胶和改性硅藻土，下层为硅胶，分离柱中改性硅藻土的使用量为功能化硅胶的50-200wt%，功能化硅胶和改性硅藻土的复配使用量的占比为80wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。在对替尔泊肽的纯化研究中，本发明发现还可以采用改性硅藻土与功能化硅胶复配，改性硅藻土由乙酰丙酸对硅藻土进行改性处理制成，然后将功能化硅胶与改性硅藻土复配使用，进一步提高了替尔泊肽的纯化效果。
50.本发明由于采用了硅胶与3-氯丙基三乙氧基硅烷反应生成带有氯丙基基团的硅
胶，然后再进一步与含胺基的试剂反应，制成功能化硅胶，本发明中含胺基的试剂包括二聚氨基氰或乙酰唑胺；然后将功能化硅胶应用于分离柱中，对替尔泊肽进行分离纯化；进一步，还可以通过乙酰丙酸对硅藻土进行改性得到改性硅藻土，然后将功能化硅胶与改性硅藻土进行复配，应用于替尔泊肽的分离纯化中，因而具有如下有益效果：本发明制备得到的功能化硅胶具有优异的吸附性能，并且含有功能化硅胶的分离柱对替尔泊肽具有好的分离纯化效果。因此，本发明是一种分离效果好、纯度高的替尔泊肽的制备方法。
附图说明
51.图1为功能化硅胶红外光谱图；图2为替尔泊肽纯度图。
具体实施方式
52.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种替尔泊肽的纯化方法fmoc-aeea-oh的活化液的制备：将fmoc-aeea-oh和hobt加入dmf中，然后在冰浴下加入dic，活化5min，得到fmoc-aeea-oh的活化液。fmoc-aeea-oh的使用量与dmf的使用量的关系为0.2mol/l，hobt的使用量与dmf的使用量的关系为20g/l，dic的使用量与dmf的使用量的关系为20 g/l。
53.按上述步骤，制备fmoc-γglu(α-otbu)-oh和二十烷二酸单叔丁基酯的活化液，即将fmoc-aeea-oh替换为fmoc-γglu(α-otbu)-oh或二十烷二酸单叔丁基酯。
54.fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh的制备：将rink amide am树脂加入固相反应器中，dmf溶胀并洗涤，加入fmoc-aeea-oh、diea及dmf，反应6h，抽干，dmf洗涤，然后加入哌啶的dmf溶液脱保护20min，dmf洗涤；加入fmoc-aeea-oh的活化液，反应2h，抽干，dmf洗涤；重复脱保护、偶联的步骤偶联fmoc-γglu(α-otbu)-oh和二十烷二酸单叔丁基酯，反应完成后，抽干，dmf洗涤，加入裂解液反应2h，过滤，滤液旋干，得到中间产物；然后加入pfp-oh和二氯甲烷，在0℃下加入edci，反应15min，然后在25℃反应2h，反应完成后，反应液依次采用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水溶液洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得到油状粘稠物，加入四氢呋喃制成油状粘稠物溶液；然后在5℃下加入fmoc-lys-oh溶液，加完后在25℃继续反应3h，反应完成后，调节ph至4，旋干四氢呋喃，dcm萃取，有机相干燥浓缩，纯化，得到fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh。第一步反应中fmoc-aeea-oh的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为2mol/kg，diea的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为4mol/kg，dmf的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为5l/kg；第二步偶联反应中，fmoc-aeea-oh的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg；第三步偶联反应中，fmoc-γglu(α-otbu)-oh的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg；第四步偶联反应中，二十烷二酸单叔丁基酯的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg；裂解液为tfe的dcm溶液，裂解液中tfe的量为dcm的20wt%；第五步反应中，pfp-oh的使用量为中间产物的25wt%，二氯甲烷的使用量为中间产物的300wt%，edci的使用量为中间产物的30wt%；第六步反应中，四氢呋喃的使用量为油状粘稠物的量的
500wt%，fmoc-lys-oh溶液由fmoc-lys-oh与碳酸钠溶液和四氢呋喃混合制成，fmoc-lys-oh溶液的混合中，碳酸钠溶液含有10wt%的碳酸钠，碳酸钠溶液的使用量为四氢呋喃的100wt%，fmoc-lys-oh溶液中fmoc-lys-oh的含量为0.2mol/l，fmoc-lys-oh溶液的使用量为油状粘稠物溶液的100wt%。哌啶的dmf溶液为脱保护液，脱保护液中哌啶的体积使用量为dmf的体积使用量的20%。
55.氨基酸活化液的制备：将氨基酸衍生物和hobt加入dmf中，然后在冰浴下加入dic，活化5min，得到氨基酸活化液。氨基酸衍生物的使用量与dmf的使用量的关系为0.2mol/l，hobt的使用量与dmf的使用量的关系为20g/l，dic的使用量与dmf的使用量的关系为20 g/l。
56.氨基酸衍生物包括如下种类：fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh， fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh。
57.替尔泊肽的制备：将rink amide am树脂加入固相反应器中，dmf溶胀及洗涤，然后加入氨基酸活化液，反应2h，茚三酮检测结果呈阴性，抽干，dmf洗涤，然后加入哌啶的dmf溶液脱保护20min，dmf洗涤，茚三酮检测结果呈阳性。氨基酸活化液的使用量以其中氨基酸试剂为计量基准，氨基酸试剂的使用量与rink amide am树脂的使用量的关系为0.8mol/kg。哌啶的dmf溶液为脱保护液，脱保护液中哌啶的体积使用量为dmf的体积使用量的20%。重复偶联、脱保护的步骤，按替尔泊肽的肽序依次加入fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-thr(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh的氨基酸活性液。将按上述步骤制备得到的替尔泊肽-树脂加入裂解液中，反应2h，过滤，滤液浓缩，加入冰冻乙醚，析出沉淀，得到替尔泊肽粗产物。裂解液中含有tfa、tis和水，裂解液中tfa的体积分数为90%，裂解液中tis的体积分数为5%，裂解液中水的体积分数为5%。
58.硅胶的活化：将硅胶浸入盐酸中，在60℃下加热处理6h，处理完成后，蒸馏水洗涤至中性，干燥，然后于130℃下活化4h，得到活化硅胶。盐酸的浓度为5mol/l，盐酸的使用量为1000g，硅胶的使用量为300g。
59.氯丙基硅胶的制备：将活化硅胶加入甲苯中，然后加入3-氯丙基三乙氧基硅烷，在110℃下搅拌反应24h，反应完成后，冷却过滤，依次采用甲苯、乙醇和乙醚洗涤，干燥，得到氯丙基硅胶。甲苯的使用量为100g，活化硅胶的使用量为30g，3-氯丙基三乙氧基硅烷的使用量为30g。
60.功能化硅胶的制备：将氯丙基硅胶加入甲苯中，然后加入二聚氨基氰，回流搅拌
12h，反应完成后，冷却过滤，洗涤，干燥，得到功能化硅胶。甲苯的使用量为100g，氯丙基硅胶的使用量为10g，二聚氨基氰的使用量为10g。
61.替尔泊肽的纯化：将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。分离柱中上层为硅胶，中层为功能化硅胶，下层为硅胶，分离柱中功能化硅胶占比为80wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。洗脱液为含有0.1wt%tfa的乙腈及水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水的使用量相同。
62.实施例2：一种替尔泊肽的纯化方法本实施例与实施例1相比，不同之处在于功能化硅胶的制备。
63.功能化硅胶的制备：将氯丙基硅胶加入甲苯中，然后加入乙酰唑胺，回流搅拌12h，反应完成后，冷却过滤，洗涤，干燥，得到功能化硅胶。甲苯的使用量为100g，氯丙基硅胶的使用量为10g，乙酰唑胺的使用量为10g。
64.实施例3：一种替尔泊肽的纯化方法本实施例与实施例1相比，不同之处在于功能化硅胶的制备。
65.功能化硅胶的制备：将氯丙基硅胶加入甲苯中，然后加入二聚氨基氰和乙酰唑胺，回流搅拌12h，反应完成后，冷却过滤，洗涤，干燥，得到功能化硅胶。甲苯的使用量为100g，氯丙基硅胶的使用量为10g，二聚氨基氰的使用量为5g，乙酰唑胺的使用量为5g。
66.实施例4：一种替尔泊肽的纯化方法本实施例与实施例1相比，不同之处在于替尔泊肽的纯化。
67.改性硅藻土的制备：将硅藻土加入去离子水中，超声分散，然后加入乙酰丙酸，搅拌混合均匀，在70℃下处理3h，处理完成后，过滤，干燥，得到改性硅藻土。去离子水的使用量为100g，硅藻土的使用量为3g，乙酰丙酸的使用量为0.09g。
68.替尔泊肽的纯化：将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。分离柱中上层为硅胶，中层为功能化硅胶和改性硅藻土，下层为硅胶，分离柱中功能化硅胶占比为40wt%，改性硅藻土比为40wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。洗脱液为含有0.1wt%tfa的乙腈及水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水的使用量相同。
69.实施例5：一种替尔泊肽的纯化方法本实施例与实施例2相比，不同之处在于替尔泊肽的纯化。
70.改性硅藻土的制备：将硅藻土加入去离子水中，超声分散，然后加入乙酰丙酸，搅拌混合均匀，在70℃下处理3h，处理完成后，过滤，干燥，得到改性硅藻土。去离子水的使用量为100g，硅藻土的使用量为3g，乙酰丙酸的使用量为0.09g。
71.替尔泊肽的纯化：将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。分离柱中上层为硅胶，中层为功能化硅胶和改性硅藻土，下层为硅胶，分离柱中功能化硅胶占比为40wt%，改性硅藻土比为40wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。洗脱液为含有0.1wt%tfa的乙腈及水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水的使用量相同。
72.实施例6：一种替尔泊肽的纯化方法本实施例与实施例3相比，不同之处在于替尔泊肽的纯化。
73.改性硅藻土的制备：将硅藻土加入去离子水中，超声分散，然后加入乙酰丙酸，搅拌混合均匀，在70℃下处理3h，处理完成后，过滤，洗涤，干燥，得到改性硅藻土。去离子水的使用量为100g，硅藻土的使用量为3g，乙酰丙酸的使用量为0.09g。
74.替尔泊肽的纯化：将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。分离柱中上层为硅胶，中层为功能化硅胶和改性硅藻土，下层为硅胶，分离柱中功能化硅胶占比为40wt%，改性硅藻土比为40wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。洗脱液为含有0.1wt%tfa的乙腈及水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水的使用量相同。
75.对比例1：一种替尔泊肽的纯化方法本对比例与实施例1相比，不同之处在于替尔泊肽的纯化。
76.替尔泊肽的纯化：将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。分离柱中仅使用硅胶。
77.对比例2：一种替尔泊肽的纯化方法本对比例与实施例1相比，不同之处在于替尔泊肽的纯化。
78.替尔泊肽的纯化：将替尔泊肽粗产物加到分离柱上，然后通过洗脱液洗脱纯化，得到纯化的替尔泊肽。分离柱中上层为硅胶，中层为改性硅藻土，下层为硅胶，分离柱中改性硅藻土占比为80wt%，上、下层的硅胶各占10wt%。
79.试验例：1.红外光谱本发明对实施例1制备的功能化硅胶进行红外光谱检测，其结果如图1所示，其中，在3446cm-1
处为硅羟基的红外吸收峰，在2874cm-1
处为亚甲基的红外吸收峰，在2247cm-1
处碳氮三键的红外吸收峰，在1091cm-1
处为硅氧硅的红外吸收峰。
80.2.替尔泊肽纯度本发明中各实施例中制备得到的替尔泊肽的纯度结果如图2所示，其中，s1为实施例1，s2为实施例2，s3为实施例3，s4为实施例4，s5为实施例5，s6为实施例6，d1为对比例1，d2为对比例2，本发明通过将功能化硅胶用于替尔泊肽的纯化分离中后，得到的替尔泊肽的纯度高，本发明中的功能化硅胶是首先通过硅胶与3-氯丙基三乙氧基硅烷反应生成带有氯丙基基团的硅胶，然后再进一步与含胺基的试剂反应，制成功能化硅胶，本发明中可以使用二聚氨基氰或乙酰唑胺，使用乙酰唑胺制成的功能化硅胶对替尔泊肽的纯化效果优于使用二聚氨基氰制成的功能化硅胶对替尔泊肽的纯化效果，而在将二聚氨基氰和乙酰唑胺共同用于功能化硅胶的制备中，二聚氨基氰和乙酰唑胺的共同使用优于二聚氨基氰或乙酰唑胺的单一使用。而当硅胶进行功能化处理时，其对替尔泊肽的纯化效果相对于功能化硅胶而显得较差；本发明还可以采用乙酰丙酸对硅藻土进行改性处理，然后将改性硅藻土用于替尔泊肽的纯化中，而改性硅藻土对替尔泊肽的纯化效果弱于未功能化处理的硅胶，在将功能化硅胶与改性硅藻土复配使用时，即在功能化硅胶与改性硅藻土的复配量与功能化硅胶或改性硅藻土的单一使用量一致时，复配的功能化硅胶与改性硅藻土的使用效果优于其部分使用量的效果叠加之和，表明功能化硅胶与改性硅藻土的复配具有更优异的性能，其复配使用具有意想不到的优势。
81.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

技术特征：
1.一种替尔泊肽的纯化方法，包括：将替尔泊肽粗产物经分离柱纯化，得到替尔泊肽；所述分离柱中至少含有硅胶和功能化硅胶；功能化硅胶由活化硅胶与氯丙基硅烷试剂、改性剂经反应化合制成；所述氯丙基硅烷试剂包括3-氯丙基三乙氧基硅烷，所述改性剂包括二聚氨基氰和/或乙酰唑胺。2.根据权利要求1所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述替尔泊肽粗产物制备中，首先对氨基酸试剂进行活化处理制成氨基酸活化液；然后将含有fmoc-ser(tbu)-oh的氨基酸活化液与rink amide am树脂进行偶联，得到偶联fmoc-ser(tbu)-树脂；然后按替尔泊肽的肽序进行偶联、脱保护直至得到替尔泊肽-树脂，采用裂解液对替尔泊肽-树脂进行裂解。3.根据权利要求2所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述氨基酸试剂包括如下试剂：fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-pro-oh， fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-ser(otbu)-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-lys(aeea-aeea-γglu(α-otbu)-eicosanedioic tbu ester)-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-aib-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-thr(otbu)-oh和 fmoc-glu(otbu)-oh。4.根据权利要求1所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述活化硅胶由硅胶于酸性溶液中活化处理得到。5.根据权利要求1所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述功能化硅胶制备中，首先由3-氯丙基三乙氧基硅烷与硅胶反应制成氯丙基硅胶，然后由改性剂与氯丙基硅胶反应制成；和/或，3-氯丙基三乙氧基硅烷的使用量为活化硅胶的50-150wt%；和/或，改性剂的使用量为氯丙基硅胶的20-150wt%。6.根据权利要求1所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述功能化硅胶制备中使用的溶剂为甲苯。7.根据权利要求1所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述分离柱中还含有改性硅藻土。8.根据权利要求7所述的一种替尔泊肽的纯化方法，其特征是：所述改性硅藻土由乙酰丙酸对硅藻土改性制成，乙酰丙酸的使用量为硅藻土的1-5wt%；和/或，所述改性硅藻土的使用量为功能化硅胶的50-200wt%。9.一种功能化硅胶在分离纯化多肽中的用途，所述功能化硅胶由活化硅胶与氯丙基硅烷试剂、改性剂经反应化合制成；所述氯丙基硅烷试剂包括3-氯丙基三乙氧基硅烷，所述改性剂包括二聚氨基氰和/或乙酰唑胺。10.一种功能化硅胶与改性硅藻土在分离纯化多肽中的用途，所述功能化硅胶由活化硅胶与氯丙基硅烷试剂、改性剂经反应化合制成；所述氯丙基硅烷试剂包括3-氯丙基三乙氧基硅烷，所述改性剂包括二聚氨基氰和/或乙酰唑胺；所述改性硅藻土由乙酰丙酸对硅藻土改性制成。

技术总结
本发明公开了一种替尔泊肽的纯化方法，属于多肽合成纯化技术领域，具体涉及采用了硅胶与3-氯丙基三乙氧基硅烷反应生成带有氯丙基基团的硅胶，然后再进一步与含胺基的试剂反应，制成功能化硅胶，本发明中含胺基的试剂包括二聚氨基氰或乙酰唑胺；然后将功能化硅胶应用于分离柱中，对替尔泊肽进行分离纯化；进一步，还可以通过乙酰丙酸对硅藻土进行改性得到改性硅藻土，然后将功能化硅胶与改性硅藻土进行复配，应用于替尔泊肽的分离纯化中。本发明制备得到的功能化硅胶具有优异的吸附性能，并且含有功能化硅胶的分离柱对替尔泊肽具有好的分离纯化效果。的分离纯化效果。的分离纯化效果。


技术研发人员：王辉平 王佳炜 傅小明 邢海英
受保护的技术使用者：杭州湃肽生化科技有限公司
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/9/9