一种喜光花提取物杀线虫剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及杀线虫剂领域，特别涉及一种喜光花提取物杀线虫剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.根结线虫被认为是危害最大的线虫之一，属于世界性病害，其造成的损失在整个栽培作物的损失中占90％以上，每年给全世界造成1700多亿美元的农业损失，阿维菌素、噻唑磷、氟吡菌酰胺等化学杀线虫剂一直被公认为是防治根结线虫最有效的办法，然而，在全球农业的快速发展中，传统的化学杀线虫剂的施药量和施药次数不断增加导致了根结线虫抗药性的产生，使得根结线虫的防治成本相应增加，除此之外，化学杀线虫剂在杀灭有害线虫的同时，也杀伤了大量天敌，破坏了生态平衡，污染了人类的生存环境。化学杀线虫剂的施用越来越不符合现代人类绿色消费的理念，因此开发具有新的杀线虫机理的绿色杀线虫剂变得越来越重要。
3.植物源农药是植物自身防御功能与有害生物和环境胁迫相适应演变、协同进化的结果，是从植物中提取出来的、由植物产生的次生代谢产物，具有选择性高、对环境友好、不易产生抗性等特点，符合现代农药与环境和谐相容的要求。近年来，从植物中提取天然杀线虫活性物质的研究逐渐引起国内外学者的兴趣，但目前植物源化合物在根结线虫防治中应用进展缓慢，因此亟待挖掘和应用高效杀线虫植物防治根结线虫。
4.喜光花是灌木，为大戟科喜光花属植物，是海南特有种植物，目前国内外学者对喜光花的研究较少，宋小平等用gc-ms联用确定了喜光花叶挥发油中主要含烷、烯和醇类等19种化学成分；阚素琴等用gc-ms联用确定了喜光花果挥发油中的32种成分，主要成分为酯、酮、烯、醇类；唐贝等研究发现喜光花叶中含有抗肿瘤成分，从喜光花叶中分离得到36种化学成分，其中包含酸、酮、酯、醇以及生物碱类化合物。现有研究结果表明喜光花可能存在抗肿瘤活性，但对喜光花的农用活性，尤其是杀线虫活性尚未见有人研究报道，因此研究喜光花的杀线虫活性极有意义。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种喜光花的提取物杀线虫剂及其制备方法和应用。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.喜光花提取物或者乙萘酚在制备杀线虫剂中的应用。
8.进一步的，所述乙萘酚的施用浓度为100μg
·
ml-1以上。
9.进一步的，喜光花提取物或者乙萘酚在制备植物杀线虫剂中的应用。
10.进一步的，喜光花提取物或者乙萘酚在制备辣椒苗和番茄苗杀线虫剂中的应用。
11.进一步的，所述线虫为南方根结线虫(meloidogyne incognita)。
12.一种喜光花提取物杀线虫剂的制备方法，所述喜光花提取物按照以下方法制备：
13.s1.将喜光花叶在45-55℃下干燥3-5d、粉碎，加入溶剂中，制得粗提物；喜光花叶
与溶剂的质量比为10～15:1；
14.s2.将步骤s1中制得的粗提物溶于水中，制得粗提物水溶液，再用有机溶剂分别萃取3～5次制得有机相，将有机相在40～50℃真空条件下浓缩，制得有机溶剂萃取物；
15.s3.用有机溶剂体系对步骤s2中制得的有机溶剂萃取物进行柱色谱分离，制得分离物；
16.s4.将步骤s3中制得的分离物加入凝胶柱中，加入洗脱剂等度洗脱，制得馏分；
17.s5.将步骤s4中制得的馏分加入半制备液相色谱仪，进一步纯化，制得喜光花提取物；所述喜光花提取物包含活性成分乙萘酚。
18.进一步的，步骤s1中所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、二氯甲烷或水中至少一种；步骤s2中所述有机溶剂为石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的一种或多种。
19.进一步的，步骤s3中所述有机溶剂体系为石油醚/乙酸乙酯、石油醚/氯仿或石油醚/正丁醇中至少一种；有机溶剂体系中两种组分的体积比为1:4～6。
20.进一步的，步骤s4中所述凝胶柱采用羟丙基葡聚糖凝胶柱；所述洗脱剂为甲醇、乙醇或二氯甲烷中至少一种；所述洗脱剂的体积浓度为90％～100％。
21.进一步的，步骤s5中所述流动相为甲醇和水，流动相中甲醇和水的体积比为55～65：33～45，流动相流速为4～6ml/min。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.(1)本发明首次报道了喜光花提取物乙萘酚的杀线虫活性，为开发具有新的杀线虫机理的绿色杀线虫剂提供了新的资源。
24.(2)本发明的喜光花的提取物杀线虫剂不仅具有优异的离体杀线虫活性，而且对线虫卵孵化也有明显的抑制作用，具有高效、毒性低、持续性好的优点，有效防治辣椒苗和番茄苗中南方根结线虫病害。
25.(3)本发明提供了喜光花叶粗提物的提取方法和活性成分的分离方法，有效提升活性化合物的纯度，提高喜光花提取物的杀线虫效果。
具体实施方式
26.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
27.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
28.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.实施例1-喜光花提取物杀线虫剂的制备方法
30.s1.将5kg喜光花叶在45℃下干燥5d、粉碎，加入500g甲醇溶液中，制得400g甲醇粗提物；
31.s2.将步骤s1中制得的400g甲醇粗提物溶于2l水中，制得甲醇粗提物水溶液，再用2l石油醚分别萃取5次制得有机相，将有机相在40℃真空条件下浓缩，制得20g石油醚萃取物；
32.s3.用体积比为1:5的石油醚/乙酸乙酯溶剂体系对步骤s2中制得的20g石油醚萃取物进行柱色谱分离，制得2.1g分离物；
33.s4.将步骤s3中制得的2.1g分离物加入sephadex lh-20凝胶柱中，加入体积分数为100％的甲醇洗脱剂等度洗脱，流速3ml/min，洗脱150min，制得400mg馏分；
34.s5.将步骤s4中制得的400mg馏分加入半制备液相色谱仪，流动相为体积分数60:40的甲醇和水，流速5ml/min，洗脱时间9min，进一步纯化，制得20mg喜光花提取物；所述喜光花提取物包含活性成分乙萘酚。
35.实施例2-喜光花提取物杀线虫剂的制备方法
36.s1.将5kg喜光花叶在50℃下干燥4d、粉碎，加入500g甲醇溶液中，制得400g甲醇粗提物；
37.s2.将步骤s1中制得的400g甲醇粗提物溶于2l水中，制得甲醇粗提物水溶液，再用2l石油醚分别萃取4次制得有机相，将有机相在45℃真空条件下浓缩，制得20g石油醚萃取物；
38.s3.用体积比为1:5的石油醚/乙酸乙酯溶剂体系对步骤s2中制得的20g石油醚萃取物进行柱色谱分离，制得2.3g分离物；
39.s4.将步骤s3中制得的2.3g分离物加入sephadex lh-20凝胶柱中，加入体积分数为100％的甲醇洗脱剂等度洗脱，流速3ml/min，洗脱130min，制得400mg馏分；
40.s5.将步骤s4中制得的400mg馏分加入半制备液相色谱仪，流动相为体积分数60:40的甲醇和水，流速5ml/min，洗脱时间9min，进一步纯化，制得20mg喜光花提取物；所述喜光花提取物包含活性成分乙萘酚。
41.实施例3-喜光花提取物杀线虫剂的制备方法
42.s1.将5kg喜光花叶在55℃下干燥3d、粉碎，加入500g甲醇溶液中，制得400g甲醇粗提物；
43.s2.将步骤s1中制得的400g甲醇粗提物溶于3l水中，制得甲醇粗提物水溶液，再用3l石油醚分别萃取3次制得有机相，将有机相在50℃真空条件下浓缩，制得20g石油醚萃取物；
44.s3.用体积比为1:5的石油醚/乙酸乙酯溶剂体系对步骤s2中制得的20g石油醚萃取物进行柱色谱分离，制得2.6g分离物；
45.s4.将步骤s3中制得的2.6g分离物加入sephadex lh-20凝胶柱中，加入体积分数为100％的甲醇洗脱剂等度洗脱，流速3ml/min，洗脱120min，制得400mg馏分；
46.s5.将步骤s4中制得的400mg馏分加入半制备液相色谱仪，流动相为体积分数60:40的甲醇和水，流速5ml/min，洗脱时间9min，进一步纯化，制得20mg喜光花提取物；所述喜光花提取物包含活性成分乙萘酚。
47.试验例1-乙萘酚的杀线活性研究
48.采用浸虫法测定乙萘酚对南方根结线虫二龄幼虫的活性。用无菌水将南方根结线虫二龄幼虫配制成100条/ml的线虫水溶液备用。分别称量10mg实验例1～3的喜光花提取物，分别加入1ml dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶解后，用质量浓度0.5％的聚山梨醇酯-80水溶液定容至5ml，制得2000μg
·
ml-1喜光花提取物的水溶液，加45ml水稀释，制得100μg
·
ml-1喜光花提取物的水溶液。用移液枪吸取1ml线虫水溶液加入12孔板中，同时吸取1ml配制好的100μg
·
ml-1喜光花提取物的水溶液加入样品孔，制成混合测试液，振荡使药液混合，于28℃黑暗处培养。以阿维菌素为阳性对照，以加等量dmf和聚山梨醇酯-80的无菌水为空白对照，观察记录线虫的死亡情况，体态法鉴别线虫死亡，活线虫身体弯曲，可以游动，死亡线虫身体僵直不动，同时结合针刺法进行鉴别，计算线虫的死亡率及校正死亡率。
49.死亡率(％)＝(线虫死亡数/线虫总数)
×
100％
50.校正死亡率(％)＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)
×
100％
51.表1.实施例1～3中乙萘酚和阿维菌素杀线虫活性
[0052][0053]
结果表明，实施例1～3中活性成分乙萘酚具有极其优异的杀线虫活性，当浓度为100μg
·
ml-1时，对南方根结线虫的致死活性均为100％，同商品用药剂阿维菌素相当。乙萘酚的ec50分别为38.0μg
·
ml-1。
[0054]
试验例2-乙萘酚对南方根结线虫卵孵化的影响
[0055]
将实施例1～3的样品加水稀释成浓度为200μg
·
ml-1、400μg
·
ml-1的乙萘酚药液，取1ml南方根结线虫卵液分别加入1ml浓度为200μg
·
ml-1、400μg
·
ml-1的乙萘酚药液中，制成浓度为100μg
·
ml-1、200μg
·
ml-1的药液，无菌水作为对照，在25℃条件下处理2、4、8、16、24h后，保持卵粒沉积在12孔板底部，用移液枪吸出药液并置换成灭菌水，(25
±
1)℃培养箱孵育，每组实验重复3次，7d后在体视显微镜下检查卵的孵化情况，计算孵化抑制率。
[0056]
孵化抑制率(％)＝(对照组孵化率-处理组孵化率)/对照组孵化率
×
100％
[0057]
表2.实验例1～3中乙萘酚对线虫卵孵化的影响
[0058][0059]a“‑”
表示未测试
[0060]
试验例2结果表明，乙萘酚对南方根结线虫卵孵化也有明显的抑制作用，随着处理时间和药剂浓度的增加，乙萘酚对线虫卵孵化的抑制率会随之增加。
[0061]
试验例3-乙萘酚对南方根结线虫的番茄苗盆栽防效实验
[0062]
在根结线虫发生较为严重的地块，选取50-60cm的番茄苗50株，移栽到准备好210mm
×
170mm的花盆内，每盆一株，将实施例2样品配置成200μg
·
ml-1和500μg
·
ml-l浓度的乙萘酚药液，番茄苗栽植7d后，在植株根际灌入配制好的药液，以10μg
·
ml-1的阿维菌素为阳性对照，以清水为对照溶液，每个处理5个重复。60d后统计番茄根上产生的根结数，并计算防治效果，测试结果如表3所示：
[0063]
抑制效果(％)＝(对照组线虫数-处理组线虫数)/对照组线虫数
×
100％
[0064]
表3.乙萘酚对南方根结线虫番茄苗盆栽防效实验
[0065][0066]a“‑”
表示无数据
[0067]
试验例3结果表明，乙萘酚的杀线虫活性随着用药浓度的增加而增加，保护活性测定数据表明当乙萘酚浓度为500μg
·
ml-1、200μg
·
ml-1、100μg
·
ml-1时，对南方根结线虫的抑制效果分别为51.65％、34.64％、23.50％，当乙萘酚浓度为500μg
·
ml-1时，保护活性稍低于商品用药剂阿维菌素。治疗活性测定数据表明当乙萘酚浓度为500μg
·
ml-1、200μg
·
ml-1、100μg
·
ml-1时，对南方根结线虫的抑制效果分别为51.53％、33.29％、16.03％，当乙萘酚浓度为500μg
·
ml-1时，治疗活性跟商品用药剂阿维菌素相当。在同等浓度下，乙萘酚的保护活性和治疗活性没有变化，而阿维菌素的保护活性较治疗活性则呈下降趋势。
[0068]
试验例4-乙萘酚对南方根结线虫的辣椒苗田间药效实验
[0069]
选取15-20cm的辣椒幼苗360株，将实施例2样品配置成200μg
·
ml-1、500μg
·
ml-1的乙萘酚溶液，辣椒幼苗移栽后用200μg
·
ml-1、500μg
·
ml-1的乙萘酚溶液浇灌定植穴，每穴药液量100ml，以清水对照。将地块分为4个小区，每小区30棵辣椒苗，每10d用药一次，共用三次，移栽60d后采收辣椒，将辣椒根冲洗干净后，统计并记录每株辣椒根结数以及每组处理辣椒的产量，计算田间防效及对产量的影响。
[0070]
田间防效(％)＝1-(处理组产生根结数/对照组产生根结数)
×
100％
[0071]
表4.乙萘酚对南方根结线虫辣椒苗田间药效实验
[0072]
处理根结数抑制率对照组18.9
±
6.2a-500μg
·
ml-1
6.4
±
2.466.14％200μg
·
ml-1
7.3
±
3.261.38％
[0073]a“‑”
表示无数据
[0074]
试验例4结果表明，在田间实验中，当乙萘酚浓度为200μg
·
ml-1、500μg
·
ml-1时，对南方根结线虫侵入辣椒植株产生根结数的抑制率分别为61.38％、66.14％，对南方根结线虫具有较好的抑制效果。
[0075]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.喜光花提取物或者乙萘酚在制备杀线虫剂中的应用。2.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述乙萘酚的施用浓度为100μg
·
ml-1以上。3.如权利要求1或2中所述的应用，其特征在于，喜光花提取物或者乙萘酚在制备植物杀线虫剂中的应用。4.如权利要求1或2中所述的应用，其特征在于，喜光花提取物或者乙萘酚在制备辣椒苗和番茄苗杀线虫剂中的应用。5.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述线虫为南方根结线虫(meloidogyne incognita)。6.一种喜光花提取物杀线虫剂的制备方法，其特征在于，所述喜光花提取物按照以下方法制备：s1.将喜光花叶在45-55℃下干燥3-5d、粉碎，加入溶剂中，制得粗提物；喜光花叶与溶剂的质量比为10～15:1；s2.将步骤s1中制得的粗提物溶于水中，制得粗提物水溶液，再用有机溶剂分别萃取3～5次制得有机相，将有机相在40～50℃真空条件下浓缩，制得有机溶剂萃取物；s3.用有机溶剂体系对步骤s2中制得的有机溶剂萃取物进行柱色谱分离，制得分离物；s4.将步骤s3中制得的分离物加入凝胶柱中，加入洗脱剂等度洗脱，制得馏分；s5.将步骤s4中制得的馏分加入半制备液相色谱仪，进一步纯化，制得喜光花提取物；所述喜光花提取物包含活性成分乙萘酚。7.如权利要求6所述的一种喜光花提取物杀线虫剂的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、二氯甲烷或水中至少一种；步骤s2中所述有机溶剂为石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的一种或多种。8.如权利要求6所述的一种喜光花提取物杀线虫剂的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述有机溶剂体系为石油醚/乙酸乙酯、石油醚/氯仿或石油醚/正丁醇中至少一种；有机溶剂体系中两种组分的体积比为1:4～6。9.如权利要求6所述的一种喜光花提取物杀线虫剂的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述凝胶柱采用羟丙基葡聚糖凝胶柱；所述洗脱剂为甲醇、乙醇或二氯甲烷中至少一种；所述洗脱剂的体积浓度为90％～100％。10.如权利要求6所述的一种喜光花提取物杀线虫剂的制备方法，其特征在于，步骤s5中所述流动相为甲醇和水，流动相中甲醇和水的体积比为55～65：33～45，流动相流速为4～6ml/min。

技术总结
本发明提供一种喜光花提取物杀线虫剂及其制备方法和应用，具体涉及喜光花提取物在制备杀线虫制剂中的应用。通过对南方根结线虫致死率和孵化率的测定，发现喜光花中的乙萘酚对线虫不仅具有较好的杀虫活性，而且对南方根结线虫卵孵化也有明显的抑制作用。乙萘酚的杀线虫活性随着用药浓度的增加而增加，对线虫卵孵化的抑制率会随着处理时间和药剂浓度的增加随之增加。随之增加。


技术研发人员：孙然锋 张羲 王帅 胡展 谢佳
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/9/9