一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.结核病是由分枝杆菌引起的致命疾病，结核分枝杆菌是人类结核病的主要病原菌，严重危害人民健康。近年来，耐多药或广泛耐药菌株的迅速出现，使得耐药结核变成了治疗难题。现有技术中针对易感结核分枝杆菌的治疗已经开发出了一线和二线抗结核药物，如异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素等。但是，这些药物对耐药结核分枝杆菌所致的结核病几乎没有临床治疗效果。
3.甲硫氨酸氨基肽酶1(methionine aminopeptidase 1，mtmet-ap1)是一种双核金属蛋白酶，负责切除新生肽链n端的起始甲硫氨酸，其编码基因是细胞存活的必需基因，从细菌到人类的所有生命形式中都是保守的。目前已发现mtmet-ap1是结核分枝杆菌在宿主细胞内诱导毒力表达的关键因子，它通过提供起始蛋白表达所需的原料甲硫氨酸，来影响结核分枝杆菌的致病能力，是新型的药物靶点，该发现对于开发新的治疗结核病的药物及方法具有重要意义。
4.因此，如何提供一种具有高灵敏度、抗环境干扰能力强的适用于体内和体外检测甲硫氨酸氨基肽酶1的特异性荧光探针底物，并建立高通量筛选mtmet-ap1抑制剂的荧光检测方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出了一种高特异性、廉价易得且灵敏度高的检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针及其制备方法与应用。
6.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
7.一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针，所述荧光探针结构式如式(1)所示，
[0008][0009]
有益效果：本发明以甲硫氨酸基团作为甲硫氨酸氨基肽酶1的代谢识别位点，以1,3-二氯-7-氨基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮为荧光基团。可用于结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶的可视化检测。
[0010]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
以甲硫氨酸与1,3-二氯-7-氨基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮为原料，通过酰化反应制备得到所述检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针。
[0012]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在检测重组表达甲硫氨酸氨基肽酶1或
结核分枝杆菌内源性甲硫氨酸氨基肽酶1活性中的应用。
[0013]
有益效果：本发明中特异性荧光探针水解产物为长发射波长荧光探针，其在甲硫氨酸氨基肽酶1活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组甲硫氨酸氨基肽酶1或结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶1活性的定量测定。
[0014]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的方法，利用所述荧光探针作为甲硫氨酸氨基肽酶1的特异性底物进行水解反应，再利用荧光检测定量检测单位时间内的7-氨基-1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2(9氢)-酮的生成率来定量测定甲硫氨酸氨基肽酶1的活性。
[0015]
更为优选的，所述甲硫氨酸氨基肽酶1为重组表达甲硫氨酸氨基肽酶1或结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶1。
[0016]
检测甲硫氨酸氨基肽酶1能够为发现抑制结核分枝杆菌的活性分子提供技术支持。
[0017]
优选的，所述水解反应前，先将甲硫氨酸氨基肽酶1的反应体系进行预孵；
[0018]
所述反应体系包括buffer缓冲液和甲硫氨酸氨基肽酶1，且甲硫氨酸氨基肽酶1浓度为0-17.5μg/ml；
[0019]
所述预孵温度为37℃，预孵时间为3min，预孵ph为7-8。
[0020]
在接近于中性体系中对于酶活力的检测，有利于该探针应用于生物体系中酶活性的可视化检测。
[0021]
优选的，所述水解反应中，所述荧光探针浓度为2.5μmol/l；
[0022]
所述水解反应温度为37℃，时间为30min；
[0023]
本发明仅需在30分钟的催化反应时间，体现了探针较快的反应速率。
[0024]
优选的，所述荧光检测中激发波长为600nm，最大发射波长为668nm。
[0025]
有益效果：本发明提供的荧光探针及其水解产物具有不同的光学属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测。
[0026]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在甲硫氨酸氨基肽酶1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价中的应用。
[0027]
应用该体系可快速高效发现甲硫氨酸氨基肽酶1的抑制剂，为抗结核药物筛选提供丰富的候选物质资源。
[0028]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶1活性评估中的应用。
[0029]
可视化评价结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶的活力对于评估病原菌毒力至关重要，同时也为特异性的抗菌药物发现提供指导。
[0030]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在甲硫氨酸氨基肽酶1抑制剂的高通量筛选中的应用。抑制剂具有抑制结核分枝杆菌的潜力，是抗结核药物发现的重要资源。
[0031]
本发明公开了一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针及其制备方法与应用，本发明提供的特异性荧光探针底物可被甲硫氨酸氨基肽酶1选择性的水解，生成荧光属性明显改变的水解产物，具有高特异性，可被荧光检测器检测。并且，利用该探针反应可对结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶1的活性和功能进行定量评价，并可用于甲硫氨酸氨基肽酶1抑制剂的筛选。同时，本发明提供的ddan-mt具有长波长的荧光发射波长，可以较好的减弱生物背景荧光的干扰，具有高灵敏度。此外，本发明提供的ddan-mt可经简单的化学合成获
得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
附图说明
[0032]
构成本技术的一部分的附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
[0033]
图1为实施例1中ddan-mt核磁共振氢谱(1h-nmr)；
[0034]
图2为实施例1中ddan-mt核磁共振碳谱(
13
c-nmr)；
[0035]
图3为实施例1中ddan-mt高分辨质谱；
[0036]
图4为ddan-mt及其水解产物的紫外吸收及荧光发射光谱；
[0037]
图5为实施例2中不同水解酶对ddan-mt的筛选实验结果；
[0038]
图6为实施例3中不同离子及氨基酸对ddan-mt的筛选实验结果；
[0039]
图7为实施例4中甲硫氨酸氨基肽酶1催化ddan-mt探针反应的酶线性变化；
[0040]
其中，a为不同酶活力催化作用下的荧光光谱，b为酶活力与荧光强度的相关性分析。
具体实施方式
[0041]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0042]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0043]
本发明实施例中的原料均通过市售途径购买获得。
[0044]
实施例1
[0045]
一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针，其结构式如式(1)所示：
[0046][0047]
该荧光探针名称为2-氨基-n-(6,8-二氯-9,9-二甲基-7-氧-7,9-二氢吖啶-2-基)-4-(甲硫基)丁酰胺(ddan-mt)。
[0048]
其合成路线为：
[0049][0050]
制备方法具体包括以下步骤：
[0051]
(1)将化合物1(1.52g)和化合物2(2.1g)置于100ml单口瓶，加入thf(5ml)和h2o(5ml)溶解(橘红色)，冰浴搅拌10min。然后将naoh水溶液(10.6ml，2m)缓慢滴入反应液，反应液由橘红色变为蓝色后，冰浴下搅拌2h。再将反应溶液倒入乙酸乙酯(300ml)和饱和nh4cl(350ml)水溶液的混合液中，搅拌，分层，然后用饱和nh4cl(350ml)水溶液洗涤有机层，得到蓝紫色有机层(化合物3)。
[0052]
(2)将na2s2o4(50g，保险粉)溶于h2o(500ml)中，得到na2s2o4水溶液。向na2s2o4(250ml)水溶液中加入上述蓝紫色有机层，搅拌25min后，反应液由蓝紫色变为橘黄色，分液，再将na2s2o4(250ml)水溶液加入到有机层中搅拌25min，再次分液，将有机层用饱和nacl水洗，干燥，得到棕黑色固体(化合物4)。
[0053]
(3)将hcl水溶液(200ml,2n)置于250ml两口瓶，通n215 min。将化合物4溶于meoh(12ml)，并缓慢滴入hcl溶液中，然后在n2环境下，105℃回流1.5h。将反应液冷却至室温，然后加入丙烯酸乙酯(200ml)，搅拌分层，水层基本无色，丙烯酸乙酯层呈棕色，分液。再次用丙烯酸乙酯(150ml)萃取一遍水相，合并机层，然后用饱和nacl水洗，分液，得到棕色有机层。
[0054]
(4)将3.2g的naio4溶于110ml的h2o中，加入上述棕色有机层，室温搅拌1h，反应液由棕色变为红色。分液，用饱和nacl水洗有机相，干燥黑红色固体。粗产物经etoh(8ml)超声打浆、过滤、烘干后，得到化合物6。将化合物6和7用ch2cl2溶解，室温搅拌1h去保护。除去溶剂后，残留物用ch2cl2/meoh(16/1，v/v)在sio2柱上纯化，得到ddan-mt为橙色固体(20mg，收率：32.4％)。
[0055]
ddan-mt的结构鉴定波谱数据如下：
[0056]
核磁共振氢谱(如图1)：1h-nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.85(s,1h),7.74(d,j＝2.1hz,1h),7.73(d,j＝2.1hz,1h),7.67(s,1h),4.08
–
4.05(m,1h),2.61
–
2.56(m,2h),2.19
–
2.13(m,1h),2.13
–
2.07(m,4h),1.83(s,6h).
[0057]
核磁共振碳谱(如图2)：
13
c-nmr(150mhz,dmso-d6)δ172.42,167.77,148.51,141.62,140.52,139.32,139.11,136.98,135.70,133.68,132.55,118.95,117.32,52.65,38.52,30.59,28.22,26.31,14.41.
[0058]
高分辨质谱(如图3)：hrms(+)m/z 438.0810[m+h]
+
,计算值m/z438.0732.
[0059]
实施例2
[0060]
体外测定不同水解酶的选择性：
[0061]
(1)分别准备9种不同的包括种类水解酶的体外代谢反应体系199μl，该反应体系为ph 7.4的buffer缓冲液(100mm hepes,50mm nacl及200μmcocl2)和水解酶(11μg/ml)，并于37℃条件下震荡预孵3分钟；
[0062]
其中，9种不同种类水解酶分别为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、二肽基肽酶iv、氨基肽酶n、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、人脂肪酶、猪脂肪酶和甲硫氨酸氨基肽酶1；
[0063]
(2)向步骤(1)预孵后的9种体外代谢反应体系中分别加入1μl浓度为500μm(终浓度2.5μm)的ddan-mt，在37℃下反应30min，然后加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
[0064]
(3)用高速冷冻离心机在4℃、20000
×
g的条件下高速离心20min，分别取上清液，通过利用荧光检测得出7-氨基-1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2(9氢)-酮的生成率(荧光检测条件为：ex＝600nm，em＝668nm)。
[0065]
如图4，ddan-mt和酶促代谢产物ddan显示了不同的紫外吸收光谱，其ddan-mt显著红移。在600nm激发光下，ddan显示出较强的荧光光谱。
[0066]
如图5，荧光检测结果显示，甲硫氨酸氨基肽酶1(mtmet-ap1)催化反应的反应速率远远高于其它水解酶，说明甲硫氨酸氨基肽酶1催化ddan-mt的反应有很好的选择性，本发明提供的ddan-mt可应用于甲硫氨酸氨基肽酶1的活性测定。
[0067]
实施例3
[0068]
体外测定不同金属离子及氨基酸对ddan-mt荧光强度的影响：
[0069]
(1)在ph 7.4的buffer缓冲液(100mm hepes,50mm nacl及200μmcocl2)中，分别加入不同类型的金属离子(终浓度200μm)或者氨基酸(终浓度10μm)，并将其于37℃条件下震荡预孵3分钟；
[0070]
其中，金属离子包括钠离子、锌离子、硫酸根离子、碳酸根离子、锰离子、钙离子、碘离子、铬离子、钡离子、镍离子、钾离子、镁离子、铜离子、二价铁离子、三价铁离子和钴离子中的一种；
[0071]
氨基酸包括赖氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、谷胱甘肽和酪氨酸中的一种；
[0072]
(2)向步骤(1)所得预孵后的体外代谢反应体系中加入1μl浓度为500μm(终浓度2.5μm)的ddan-mt，在37℃下反应30min，然后加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
[0073]
(3)用高速冷冻离心机在4℃、20000
×
g的条件下高速离心20min，取上清液，通过利用荧光检测得出7-氨基-1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2(9氢)-酮的生成率(荧光检测条件为：ex＝600nm，em＝668nm)。
[0074]
如图6，荧光测试结果显示，各种金属离子或者氨基酸对探针本身的荧光强度没有影响，说明本探针具有较高的抗干扰性。。
[0075]
实施例4
[0076]
甲硫氨酸氨基肽酶1催化ddan-mt探针反应的线性研究：
[0077]
(1)准备体外代谢反应体系199μl，该反应体系为ph 7.4的buffer缓冲液(100mm hepes,50mm nacl及200μm cocl2)、甲硫氨酸氨基肽酶1(0-17.5μg/ml)，并于37℃条件下震荡预孵3min；
[0078]
(2)向步骤(1)得到的预孵后的反应体系中加入1μl浓度为500μm(终浓度2.5μm)的ddan-mt，在37℃下反应30min，然后加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
[0079]
(3)用高速冷冻离心机在4℃、20000
×
g的条件下，高速离心20min，取上清液，通过利用荧光检测得出7-氨基-1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2(9氢)-酮的生成率(荧光检测条件为：ex＝600nm，em＝668nm)。
[0080]
如图7，荧光检测结果显示，甲硫氨酸氨基肽酶1(mtmet-ap1)催化ddan-mt的探针反应在0-11μg/ml范围内呈现良好的酶线性关系，r2值为0.9983，说明本发明中ddan-mt可应用于复杂样本中甲硫氨酸氨基肽酶1的活性及其表达量的测定。
[0081]
以上，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针结构式如式(1)所示：2.一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以甲硫氨酸与1,3-二氯-7-氨基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮为原料，通过酰化反应制备得到所述检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针。3.如权利要求1所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在检测重组表达甲硫氨酸氨基肽酶1或结核分枝杆菌内源性甲硫氨酸氨基肽酶1活性中的应用。4.一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述荧光探针作为甲硫氨酸氨基肽酶1的特异性底物进行水解反应，再利用荧光检测定量检测单位时间内7-氨基-1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2(9氢)-酮的生成率，进而定量测定甲硫氨酸氨基肽酶1的活性。5.根据权利要求4所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的方法，其特征在于，所述水解反应前，先将甲硫氨酸氨基肽酶1的反应体系进行预孵；所述反应体系包括buffer缓冲液和甲硫氨酸氨基肽酶1，且甲硫氨酸氨基肽酶1浓度为0-17.5μg/ml；所述预孵温度为37℃，预孵时间为3min，预孵ph为7-8。6.根据权利要求4所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的方法，其特征在于，所述水解反应中，所述荧光探针在反应体系中的浓度为2.5μmol/l；所述水解反应温度为37℃，时间为30min。7.根据权利要求4所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的方法，其特征在于，所述荧光检测中激发波长为600nm，最大发射波长为668nm。8.如权利要求1所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在甲硫氨酸氨基肽酶1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价中的应用。9.如权利要求1所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶1活性评估中的应用。10.如权利要求1所述的一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针在甲硫氨酸氨基肽酶1抑制剂的高通量筛选中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测甲硫氨酸氨基肽酶1的荧光探针及其制备方法与应用，所述荧光探针结构式如式(1)所示。本发明同时公开了其制备方法和应用，并且公开了利用该荧光探针对甲硫氨酸氨基肽酶1的活性进行定量检测的方法。本发明提供的特异性荧光探针在应用过程中具有高特异性，可被荧光检测器检测。同时，本发明提供的DDAN-MT具有长波长的荧光发射波长，可以较好的减弱生物背景荧光的干扰，具有高灵敏度。此外，本发明提供的DDAN-MT可经简单的化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。本低。本低。


技术研发人员：王超 马骁驰 冯磊 张铭 武玉卓 于振龙
受保护的技术使用者：大连医科大学
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/9/9