一种CRISPR-Cas9工程噬菌粒的构建方法与流程

一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法
技术领域
1.本发明属于微生物的技术领域，特别涉及一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法。


背景技术：

2.crispr-cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的dna里一个称为crispr的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的dna切断而使之失效。
3.研究微生物组不仅表明了某些物种对人体健康的重要性，而且还揭示了传统抗菌药物缺乏杀灭特异性的不足。抗生素的使用促进了抗生素耐药性(antimicrobial resistance，amr)的出现，迫切需要开发针对物种的选择性抗生素，以用于操纵复杂的微生物群落。crispr-cas是一种在许多原核生物中发现的适应性免疫系统，可设计用于靶向细菌基因组，导致细胞死亡。
4.基于原核生物的获得性免疫系统研发出的crispr-cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使dna双链切割功能的cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgrna(single guide rna)。当细胞内同时表达sgrna和cas9蛋白时，cas9蛋白通过与sgrna结合，靶向到目的dna序列上发挥dna双链切割的功能。dna序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的dna修复机制(dna repair)。当细菌受到噬菌体的侵染时，被释放到细菌细胞质中的噬菌体基因组的某段dna序列被识别并整合到crispr的spacer区域，随后转录出相应的crrna前体(pre-crrna)。crrna前体经过修饰和加工，生成向导rna(guide-rna)。由于grna中存在一段来源于噬菌体基因组的序列，因此grna可以通过碱基的互补配对原则识别噬菌体的基因组，同时存在于细胞质中的grna和cas蛋白特异性结合，并靶向到噬菌体基因组参与dna的切割与降解。
5.如专利申请202211652615.3公开了一种适用于深海真菌fs441的crispr/cas9载体及其构建方法和应用。本发明首次利用crispr/cas9系统构建聚酮杂萜类phomeroids新骨架化合物生物合成基因被敲除的重组p._tersafs441菌株，建立了一种高效的适用于深海真菌p._tersafs441的crispr/cas9基因敲除体系，并通过代谢产物分析证实了ctg1506p450基因在phomeroids生物合成过程中的关键作用，从而为p._tersafs441新型聚酮杂萜类化合物phomeroids生物合成机制解析奠定分子生物学基础。
6.然而，该方法是针对深海真菌p._tersafs441的crispr/cas9基因敲除，应用受到很大局限。


技术实现要素：

7.基于此，为解决抗生素耐药性肆虐问题，因此本发明的首要目地是提供一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法对大肠杆菌puc119噬菌粒进行改造，将pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9核酸酶基因序列整合至
puc119，构建crispr-cas9工程噬菌粒，能够有利于crispr-cas9工程噬菌粒的快速准确构建，大大提高了crispr-cas9工程噬菌粒的适应性。
8.本发明的另一个目地在于提供一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法通过酶切和同源重组的方法对噬菌粒puc119进行改造，将卡那霉素(kana)抗性基因n20靶点序列、grna和cas9蛋白表达序列整合到puc119中，构建具有靶向消除卡那霉素(kana)抗性基因功能的重组噬菌粒，将其命名为puc-φ：kana。以大肠杆菌puc119原始噬菌粒载体构建的重组噬菌粒能选择性地插入靶点序列从而特异性消除抗生素耐药性基因，pam区域识别的原型间隔序列(即n20靶点序列)的碱基对决定靶向基因的类型，赋予其所在宿主细胞序列特异性消除抗性基因的能力，同时puc119载体上的hindiii、xbai、bamhi酶切位点提供了外源dna的插入位置，将靶点、grna scaffold、cas9核酸酶等crispr-cas9元件通过同源重组插入其中，并对构建完成的工程噬菌粒进行序列特异性抗菌功能探究，有助于验证crispr-cas体系改造工程噬菌体开发特异性抗菌药物的可能性。
9.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
10.一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法通过大肠杆菌crispr/cas9系统的cas蛋白行使dna双链切割功能，使其能识别kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒；首先构建了含kana抗性基因n20靶点序列的puc-kana-1.5k载体，包含pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的cas9基因序列与puc-kana-1.5k载体同源重组，构建了含kana-n20靶点序列、grna scaffold、完整cas9基因序列的重组噬菌粒puc-φ：kana。
11.该质粒可靶向卡那霉素(kana)抗性基因，消除含kana抗性的质粒和细菌基因组，消除质粒带来的kana抗性或靶向敲除基因组中的kana抗性基因导致细菌死亡，为进一步开发工程噬菌体药物药物奠定基础。
12.具体包括如下步骤：
13.s1，puc-φ:kana载体构建；
14.先进行puc-kana-1.5k载体构建，设计靶点n20，并由此搭建puc-φ：kana载体；
15.其中，设计靶点n20为设计crispr靶点即卡那霉素(kana)抗性基因n20序列：gcgacaatctatcgattgta，并结合同源臂序列设计引物puc-kana-f:aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgta catcgccgcagcggtttcag。
16.puc-kana-1.5k载体构建具体包括：使用hindiii-hf限制性内切酶和xbai限制性内切酶对puc119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，与n20靶点接头进行同源重组连接。
17.进一步，puc-kana-1.5k载体构建体系如下：rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf 4μl，xbai 4μl，puc119质粒载体23μl，ddh2o补足100μl，37℃反应4h。
18.使用引物puc-kana-f和puc-cas1-r(cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc)对grna scaffold、cas9基因部分序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：kod fx neo buffer 18.5μl，引物(10um)各0.5μl，模板puc-φ0.5μl，pcr条件：94℃-2min(1cycles)；98℃-20sec，68℃-90sec(35cycles)；68℃-10min，10℃-∞。
19.将酶切后的puc119载体与含n20的puc-kana片段进行同源重组，体系如下：酶切后
gtggcaccgagtcggtgc；
35.puc-kana-1.5k中的cas9基因部分序列为：
36.atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcg
37.gtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacag
38.accgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagac
39.agcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaa
40.tcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagt
41.ttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtc
42.atcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactat
43.ctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatc
44.tatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagattt
45.aaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaat
46.caattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattcttt
47.ctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtga
48.gaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaatt
49.ttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatactta
50.cgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttt
51.tggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatac
52.tgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。
53.pcr扩增的puc-kana-1.5k序列为：
54.aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgca
55.gcggtttcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatca
56.acttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaattctctagaaacaatactta
57.atactatagaatgataacaaaataaactactttttaaaagaattttgtgttataatct
58.atttattattaagtattgggtaatattttttgtagagatattttgaaaaagaaaaatta
59.aagcatattaaactaatttcggaggtcattaaaactattattgaaatcatcaaactca
60.ttatggatttaatttaaactttttattttaggaggcaaaaatggataagaaatactca
61.ataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatat
62.aaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaa
63.aaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtc
64.tcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctaca
65.ggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaa
66.gagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaata
67.tagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaa
68.attggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcata
69.tgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgat
70.gtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaacc
71.ctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatc
72.aagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttattt
73.gggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgattt
74.ggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataat
75.ttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatc
76.agatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctccc
77.ctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。
78.所述puc-kana-3.3k片段扩增使用引物pc2-f和puc-cas2-r(tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc)对剩余部分的cas9基因序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约3300bp处的条带，反应体系如下：赛默飞superfi ii pcr预混液10μl，引物各0.5μl，模板pcas质粒1μl，ddh2o补足至20μl；pcr条件：98℃-30sec(1cycles)；98℃-10sec，68℃-10sec，72℃-1min40sec(35cycles)；72℃-18min，4℃-∞。
79.进一步，扩增引物如下所示：
80.pc2-f为：
81.ctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcga
82.puc-cas2-r为：
83.tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc。
84.进一步，各片段基因序列下所示：
85.扩增的cas9-3.3k序列为：
86.tttttttgaattctctagaaacaatacttaatactatagaatgataacaaaataaact
87.actttttaaaagaattttgtgttataatctatttattattaagtattgggtaatattttt
88.tgtagagatattttgaaaaagaaaaattaaagcatattaaactaatttcggaggtcat
89.taaaactattattgaaatcatcaaactcattatggatttaatttaaactttttatttta
90.ggaggcaaaaatggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgt
91.cggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctg
92.ggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgaca
93.gtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacac
94.gtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagt
95.agatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaag
96.catgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaat
97.atccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggattt
98.gcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattg
99.agggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtaca
100.aacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaa
101.agcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcag
102.ctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggttt
103.gacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttca
104.aaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatg
105.ctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatccta
106.agagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatca
tcaagacttgactcttttaaaagctttag。
107.对于puc-φ：kana质粒构建，扩增引物如下所示：
108.pc1-s-f3
109.cgcgagagcgtatgaaacg pc2-r
110.ccaccatatttttttggatcccagtcttttttacgagcaataagcttgtccgaa
111.进一步，各片段基因序列下所示
112.puc-φ：kana质粒载体
113.aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgca
114.gcggtttcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatca
115.acttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaattctctagaaacaatactta
116.atactatagaatgataacaaaataaactactttttaaaagaattttgtgttataatct
117.atttattattaagtattgggtaatattttttgtagagatattttgaaaaagaaaaatta
118.aagcatattaaactaatttcggaggtcattaaaactattattgaaatcatcaaactca
119.ttatggatttaatttaaactttttattttaggaggcaaaaatggataagaaatactca
120.ataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatat
121.aaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaa
122.aaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtc
123.tcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctaca
124.ggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaa
125.gagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaata
126.tagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaa
127.attggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcata
128.tgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgat
129.gtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaacc
130.ctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatc
131.aagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttattt
132.gggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgattt
133.ggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataat
134.ttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatc
135.agatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctccc
136.ctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaa
137.aagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatc
138.aaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataa
139.atttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaacta
140.aatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatc
141.aaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatt
142.tttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattat
143.gttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaag
144.aaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatc
145.atttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactacca
146.aaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaat
147.atgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagcca
148.ttgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaaga
149.ttatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagataga
150.tttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattt
151.tttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgacctta
152.tttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatg
153.ataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcg
154.aaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttg
155.aaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttga
156.catttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatg
157.aacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgt
158.aaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgt
159.tattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgaga
160.gcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaaga
161.gcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaa
162.aatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatg
163.atgtcgatcacattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggt
164.cttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagta
165.gtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaa
166.cgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaag
167.ctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcaca
168.aattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagag
169.gttaaagtgattaccttaaaatctaaattagtttctgacttccgaaaagatttccaatt
170.ctataaagtacgtgagattaacaattaccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgcc
171.gtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaatcggagtttgtctatg
172.gtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgctaagtctgagcaagaaatagg
173.caaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaa
174.attacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaatcgaaactaatggggaa
175.actggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagtgcgcaaagtattg
176.tccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacaggcggattctcc
177.aaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaaaaaagac
178.tgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagtcctag
179.tggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagttac
180.tagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttaga
181.agctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatag
182.tctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaa
183.aaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtc
184.attatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtgg
185.agcagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcg
186.tgttattttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacataga
187.gacaaaccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatc
188.ttggagctcccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatac
189.gtctacaaaagaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatg
190.aaacacgcattgatttgagtcagctaggaggtgactga
191.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
192.本发明通过大肠杆菌crispr-cas9系统的cas蛋白行使dna双链切割功能，使其能识别kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒，能够有利于crispr-cas9工程噬菌粒的快速准确构建，大大提高了crispr-cas9工程噬菌粒的适应性。
193.本发明构建了含kana抗性基因n20靶点序列的puc-kana-1.5k载体，包含pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的cas9基因序列与puc-kana-1.5k载体同源重组，构建了含kana-n20靶点序列、grna scaffold、完整cas9基因序列的重组噬菌粒puc-φ：kana。该质粒可靶向卡那霉素(kana)抗性基因，消除含kana抗性的质粒和细菌基因组，消除质粒带来的kana抗性或靶向敲除基因组中的kana抗性基因导致细菌死亡，为进一步开发工程噬菌体药物奠定基础。
附图说明
194.图1是本发明所实施的技术线路图。
195.图2是本发明所实施的puc119载体酶切产物凝胶电泳图。
196.图3是本发明所实施的puc-φ质粒扩增产物凝胶电泳图。
197.图4是本发明所实施的puc-kana-1.5k载体菌落pcr图。
198.图5是本发明所实施的puc-kana-1.5k载体质粒大小检测图。
199.图6是本发明所实施的puc-kana-1.5k载体酶切鉴定示意图。
200.图7是本发明所实施的pcas质粒扩增产物凝胶电泳图。
201.图8是本发明所实施的puc-kana-1.5k载体酶切结果示意图。
202.图9是本发明所实施的puc-φ：kana载体菌落pcr图。
203.图10是本发明所实施的puc-φ：kana载体质粒大小检测图。
204.图11是本发明所实施的puc-φ：kana载体酶切鉴定示意图。
205.图12是本发明所实施的puc-φ：kana载体质粒lb+kana平板菌落生长情况示意图。
206.图13是本发明所实施的puc-φ：kana载体质粒验证lb+carb平板示意图。
207.图14是本发明所实施的puc-φ：kana载体质粒lb+carb平板菌落生长情况示意图。
208.图15是本发明所实施的puc-φ：kana载体质粒验证lb+kana平板示意图。
具体实施方式
209.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
210.图1所示为本发明实现的技术路线，图中所示，本发明所实现的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，包括如下步骤：
211.s1，puc-φ:kana载体构建。
212.先进行puc-kana-1.5k载体构建，设计靶点n20，并由此搭建puc-φ：kana载体。
213.其中，设计靶点n20为设计crispr靶点即卡那霉素(kana)抗性基因n20序列：gcgacaatctatcgattgta，并结合同源臂序列设计引物puc-kana-f:aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgta catcgccgcagcggtttcag。
214.puc-kana-1.5k载体构建具体包括：使用hindiii-hf限制性内切酶和xbai限制性内切酶对puc119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，与n20靶点接头进行同源重组连接。
215.s2、设计扩增引物进行pcr扩增，获得cas9基因序列剩余部分的pcr扩增产物，获得puc-kana-3.3k片段。
216.s3、puc-kana-1.5k载体使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶进行酶切，cas9基因序列的pcr扩增产物进行凝胶电泳胶回收，然后将puc-kana-1.5k载体和puc-kana-3.3k片段进行同源重组，获得含n20靶点的puc-φ：kana质粒载体。
217.s4、制备含pks质粒感受态，使用puc-φ：kana质粒载体转化已制备好的含pks质粒的dh5α感受态，通过crispr将含kana抗性基因pks质粒消除，制得噬菌粒puc-φ：kana。
218.下面结合实验对本发明的实施进行具体说明。
219.一，实验一：puc-kana1.5k载体构建。
220.1、实验材料。
221.1.1、实验仪器：pcr仪、azure300成像仪、离心机、低速离心机、电热恒温水槽、摇床培养箱、生化培养箱、手动单道可调式移液器、wix-ep300电泳仪、制冰机。
222.1.2、实验试剂：bamhi-hf限制性内切酶、hindiii-hf限制性内切酶、xbai限制性内切酶、dl2000 dna ladder、琼脂糖、全式金dh5α感受态、lb肉汤、琼脂粉、tris-乙酸电泳缓冲液(50
×
tae)、ddh2o、rcutsmart buffer、2x taq pcr master mix(blue)、羧苄青霉素、genered核酸染料、10
×
dna loading buffer、d15000 dna marker。
223.1.3、实验材料：全式金5分钟dna快速纯化试剂盒、全式金dna凝胶快速纯化试剂盒、天根easygeno assembly cloning kit同源重组试剂盒、擎科高纯度质粒dna小量提取试剂盒、一次性无菌培养皿。
224.2、实验方法。
225.2.1、puc-kana-1.5k载体构建：设计crispr靶点n20序列：puc-kana-f(aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgta catcgccgcagcggtttcag)。
226.使用hindiii-hf限制性内切酶和xbai限制性内切酶对puc119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，体系如下：rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf4μl，xbai 4μl，puc119质粒载体23μl，ddh2o补足100μl，37℃水浴加热反应4h。酶切产物使用全式金5分钟dna快速纯化试剂盒进行回收。
227.使用引物puc-kana-f(10um)和puc-cas1-r(10um，cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc)对grna scaffold、cas9基因部分序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：kod fx neo buffer 18.5μl，引物(10um)各0.5μl，模
板puc-φ0.5μl，pcr条件：94℃-2min(1cycles)；98℃-20sec，68℃-90sec(35cycles)；68℃-10min，10℃-∞。扩增产物使用全式金dna凝胶纯化试剂盒进行回收。
228.将酶切后的puc119载体与含n20的puc-kana片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc119载体约63ng，含n20的puc-kana片段约106ng，2
×
basic assembly mix 5μl，pcr仪50℃反应25min。
229.同源重组产物转化全式金dh5α感受态，摇床培养箱37℃，200rpm，复苏60min，涂布于无菌lb+carb培养基平板上，生化培养箱37℃恒温静置过夜培养。通过菌落pcr、质粒大小检测、酶切鉴定筛选阳性克隆：菌落pcr引物为puc-kana-f(10um)、puc-cas1-r(10um)，反应体系如下：1
×
taq pcr master mix(blue)7μl，引物各0.25μl，单克隆菌(溶于15μl水)3μl，pcr条件：95℃-7min(1cycles)；95℃-30sec，60℃-30sec，72℃-1min45sec(35cycles)；72℃-10min，10℃-∞；菌落pcr筛选的阳性克隆进行摇菌，使用擎科生物高纯度质粒dna小量提取试剂盒提取质粒，进行质粒大小检测。质粒大小正确的阳性克隆再使用hindiii-hf限制性内切酶进行酶切鉴定，体系如下：rcutsmart buffer 2μl，质粒～400ng，hindiii-hf 0.5μl，ddh2o补足20μl，37℃水浴加热酶切3h。酶切鉴定的阳性克隆，送擎科生物进行测序。
230.2.2puc-kana-3.3k片段构建。
231.使用引物pc2-f(10um)和puc-cas2-r(10um，tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc)对剩余部分的cas9基因序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约3300bp处的条带；pcr扩增使用赛默飞高保真ii pcrdna聚合酶，反应体系如下：superfi ii pcr预混液10μl，引物各0.5μl，模板pcas质粒1μl，pcr条件：98℃-30sec(1cycles)；98℃-10sec，68℃-10sec，72℃-1min40sec(35cycles)；72℃-18min，4℃-∞。扩增产物使用全式金dna凝胶纯化试剂盒进行回收。扩增引物如表1所示，各片段基因序列如表2所示，pcr扩增条件如表3所示。
232.表1扩增引物
[0233][0234]
[0235]
表2 puc各片段基因序列
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240][0241]
表3扩增条件
[0242]
[0243][0244]
2.3、puc-φ：kana质粒构建。
[0245]
使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶对puc-kana-1.5k载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约5000bp处的条带，体系如下：rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf 4μl，bamhi-hf 4μl，puc-kana-1.5载体13μl，ddh2o补足100μl，37℃反应4h。酶切产物使用全式金5分钟dna快速纯化试剂盒进行回收。
[0246]
将酶切后的puc-kana-1.5k载体与puc-kana-3.3k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc-kana-1.5k载体约99ng，puc-kana-3.3k片段约232ng，2
×
easygeno assembly mix 5μl，pcr仪50℃反应30min。
[0247]
同源重组产物转化全式金dh5α感受态，摇床培养箱37℃，200rpm，复苏60min，涂布于无菌lb+carb培养基平板上，生化培养箱37℃恒温静置过夜培养。通过菌落pcr、质粒大小检测、酶切鉴定筛选阳性克隆：菌落pcr引物pc1-s-f3、pc2-r，反应体系如下：1
×
taq pcr master mix(blue)7μl，引物各0.25μl，单克隆菌(溶于15μl水)3μl，pcr条件：95℃-7min(1cycles)；95℃-30sec，60℃-30sec，72℃-1min(35cycles)；72℃-10min，10℃-∞；菌落pcr筛选约1500bp的阳性克隆进行摇菌，使用擎科生物高纯度质粒dna小量提取试剂盒提取质粒，进行质粒大小检测。质粒大小正确的阳性克隆再使用hindiii-hf限制性内切酶进行酶切鉴定，体系如下：rcutsmart buffer 2μl，质粒～400ng，hindiii-hf 0.5μl，ddh2o补足20μl，37℃酶切3h。酶切鉴定的阳性克隆，送擎科生物进行测序。
[0248]
3、结果分析。
[0249]
3.1、puc-kana-1.5k载体构建。
[0250]
使用hindiii-hf限制性内切酶和xbai限制性内切酶对puc119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，如图2所示；puc-φ载体pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，如图3所示；回收片段与含n20靶点的酶切产物puc119同源重组，构
建puc-kana-1.5k载体，以酶切前的puc119质粒载体作为阳性对照，菌落pcr结果如图4所示，连接上n20的阳性克隆可以扩增出约1000bp的片段；筛选出的阳性克隆进行质粒大小检测，酶切前的puc119质粒载体作为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳鉴定约2400bp处的条带结果如图5所示。质粒大小正确的阳性克隆进行酶切鉴定，连接上靶点n20的阳性克隆能酶切出约5000bp的片段，以酶切前的puc119质粒载体作为阳性对照，为3100bp左右的条带，如图6所示。筛选出的阳性克隆经测序验证后得到序列正确的puc-kana-1.5k载体，用于后续载体构建。
[0251]
3.2、puc-kana-3.3k片段构建。
[0252]
使用引物pc2-f(10um)和puc-cas2-r(10um，tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc)对剩余部分的cas9基因序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约3300bp处的条带，如图7所示；
[0253]
3.3、puc-φ：kana质粒构建。
[0254]
使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶对puc-kana-1.5k载体进行酶切，回收片段琼脂糖凝胶电泳鉴定约5000bp处的条带，如图8所示；puc-kana-3.3k回收片段与puc-kana-1.5k酶切产物同源重组，构建puc-φ：kana质粒载体，以puc-φ质粒载体作为阳性对照，酶切前的puc-kana-1.5k载体为阴性对照，菌落pcr结果如图9所示，连接成功的阳性克隆可以扩增出约1000bp的片段；筛选出的阳性克隆进行质粒大小检测，以puc-φ质粒载体作为阳性对照，酶切前的puc-kana-1.5k载体为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳鉴定约5000bp处的条带，如图10所示；质粒大小正确的阳性克隆进行酶切鉴定，连接上靶点n20的阳性克隆能酶切出约2500bp和5000bp两条片段，以puc-φ质粒载体作为阳性对照，酶切前的puc-kana-1.5k载体为阴性对照，如图11所示。筛选出的阳性克隆经测序验证后得到序列正确的puc-φ：kana质粒载体。
[0255]
二，实验二：含pks质粒感受态制备。
[0256]
1、实验材料。
[0257]
1.1、实验仪器：低温离心机、摇床培养箱、生化培养箱、手动单道可调式移液器、制冰机。
[0258]
1.2、实验试剂：lb肉汤、全式金dh5α感受态、硫酸卡那青霉素、无水氯化钙、丙三醇。
[0259]
2、实验方法。
[0260]
将含kana抗性基因的pks质粒转化全式金dh5α感受态，涂布于无菌lb+kana培养基平板上，37℃生化培养箱过夜培养，获得dh5α(含pks质粒)细菌以制备感受态细胞。
[0261]
1.第一天：下午取-80℃保存菌株，划线，37℃生化培养箱过夜培养。
[0262]
2.第二天：从37℃生化培养箱培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落转入3-4ml新鲜lb+kana培养基，37℃，200rpm摇床培养箱过夜培养。
[0263]
3.第三天：取1ml新鲜的16～20h过夜培养物转到一个含有100ml lb+kana培养基的1l或500ml三角瓶中。于37℃，200rpm摇床培养箱剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200rpm)，每隔20～30min测量od600值≈0.4-0.5。
[0264]
4.将三角瓶放在冰上，晃动，使其温度均匀下降；在无菌条件下(超净台中)将细菌转移到一个用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。
[0265]
5.低温离心机4℃，4500rpm离心10min，以回收细胞。
[0266]
6.倒掉上清液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
[0267]
7.加入10ml冰预冷的0.1mcacl2，轻轻晃动离心管，重悬每份沉淀，冰上放置5-10min。
[0268]
8.低温离心机4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。
[0269]
9.倒掉上清液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
[0270]
10.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1m cacl2：甘油＝4：1，重悬每份沉淀。
[0271]
11.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl分装到无菌离心管，液氮中冰冻，-80℃贮存备用。
[0272]
3、结果分析。
[0273]
新鲜制备的感受态转化效率极高，保存半年有效。
[0274]
三，实验三：puc-φ：kana载体靶向杀灭效果验证。
[0275]
1、实验材料。
[0276]
1.1、实验仪器：摇床培养箱、生化培养箱、手动单道可调式移液器、制冰机、半自动菌落计数器。
[0277]
1.2、实验试剂：硫酸卡那霉素、羧苄青霉素、lb肉汤、琼脂粉。
[0278]
2、实验方法。
[0279]
使用puc-φ：kana质粒载体转化已制备好的含pks质粒的dh5α感受态，通过crispr将含kana抗性基因pks质粒消除。
[0280]
取dh5α(含pks质粒)感受态200μl，加入4μl序列突变的puc-φ：kana 9号质粒载体(510ng/μl，约2μg)，加入8μl序列正确的puc-φ：kana 4号质粒载体(257ng/μl，约2μg)，同时以等体积无菌水作为对照组，轻轻混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中静置2min，向离心管中加入1ml不含抗生素的lb培养基，混匀后37℃摇床培养箱(200rpm)复苏60min，取100μl复苏液稀释成104的稀释液，各取三份平行100μl涂布于lb+kana培养基上，37℃培养箱过夜培养，菌落计数验证杀灭效果，挑取lb+kana培养基的单菌落加无菌水混匀后点至lb+carb培养基；取未稀释的复苏液100μl涂布至lb+carb培养基，挑取lb+carb培养基的单菌落加无菌水混匀后点至lb+kana培养基。
[0281]
3、结果分析。
[0282]
lb+kana培养基菌落计数结果如下：对照组的菌落有767个、589个、676个，序列突变组的菌落有361个、287个、399个，序列正确组的菌落有322个、588个、478个，在lb+kana培养基生长的菌落为kana抗性未被消除的菌落，菌落数越少则说明kana抗性被消除得越多，如图12所示；取lb+kana培养基的单菌落加无菌水混匀后点至lb+carb培养基，对照组、序列突变组、序列正确组均无菌落生长，进一步验证lb+kana培养基生长的是含有kana抗性质粒的菌落，如图13所示，由此检测puc-φ：kana质粒消除kana抗性成功。
[0283]
lb+carb培养基的菌落生长情况如下：序列突变组的菌落数少于序列正确组的菌落数，对照组由于不含amp抗性则无菌落生长，lb+carb培养基生长的菌落含有amp抗性的puc-φ：kana质粒，同时含有感受态中的pks质粒，如图14所示；取lb+carb培养基的单菌落加无菌水混匀后点至lb+kana培养基，能在其上生长的菌落中存在含kana抗性的pks质粒，无法生长的菌落则不再具有kana抗性，说明其中的pks质粒已被puc-φ：kana消除，同对照
组相比可验证质粒消除效果明显，同时也看对比出序列正确组比序列突变组的效果更加明显，如图15所示，经此检测puc-φ：kana质粒消除kana抗性成功。
[0284]
本发明通过puc-φ质粒的crispr/cas9系统的cas蛋白行使dna双链切割功能，使其能识别kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒；首先构建了含kana抗性基因n20靶点序列的puc-kana-1.5k载体，包含pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的cas9基因序列与puc-kana-1.5k载体同源重组，构建了含kana-n20靶点序列、grna scaffold、完整cas9基因序列的重组噬菌粒puc-φ：kana。经过载体杀灭效果验证该重组载体能够消除含kana抗性基因的质粒。
[0285]
本发明的目的是构建能消除抗生素抗性基因细菌的噬菌粒载体，该噬菌粒在质粒消除可验证其效果，进而可包装成噬菌体在临床应用中发挥作用。
[0286]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于该方法通过大肠杆菌crispr/cas9系统的cas蛋白行使dna双链切割功能，使其能识别kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒；首先构建了含kana抗性基因n20靶点序列的puc-kana-1.5k载体，包含pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的cas9基因序列与puc-kana-1.5k载体同源重组，构建了含kana-n20靶点序列、grna scaffold、完整cas9基因序列的重组噬菌粒puc
‑ꢀ
φ：kana。2.如权利要求1所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：s1， puc-φ:kana载体构建；先进行puc-kana-1.5k载体构建，设计靶点n20，并由此搭建puc-φ：kana载体；其中，设计靶点n20为设计crispr靶点即卡那霉素(kana)抗性基因n20序列：gcgacaatctatcgattgta ， 并 结 合 同 源 臂 序 列 设 计 引 物puc-kana-f:aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgcagcggtttcag；puc-kana-1.5k载体构建具体包括： 使用hindiii-hf限制性内切酶和xbai限制性内切酶对puc119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，与n20靶点接头进行同源重组连接；s2、设计扩增引物进行pcr扩增，获得cas9基因序列剩余部分的pcr扩增产物，获得puc-kana-3.3k片段；s3、puc-kana-1.5k载体使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶进行酶切，cas9基因序列的pcr扩增产物进行凝胶电泳胶回收，然后将puc-kana-1.5k载体和puc-kana-3.3k片段进行同源重组，获得含n20靶点的puc
‑ꢀ
φ：kana质粒载体；s4、制备含pks质粒感受态，使用puc-φ：kana质粒载体转化已制备好的含pks质粒的dh5α感受态，通过crispr将含kana抗性基因pks质粒消除，制得噬菌粒puc
‑ꢀ
φ：kana。3.如权利要求2所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于s1步骤中，puc-kana-1.5k载体构建体系如下： rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf 4μl，xbai 4μl，puc119质粒载体23μl，ddh2o 补足100μl，37℃反应4h；使用引物puc-kana-f和puc-cas1-r(cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc)对grna scaffold、cas9基因部分序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：kod fx neo buffer 18.5μl，引物(10um)各0.5μl，模板puc-φ0.5μl，pcr条件：94℃-2min(1cycles)；98℃-20sec，68℃-90sec(35cycles)；68℃-10min，10℃-∞；将酶切后的puc119载体与含n20的puc-kana片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc119载体约63ng，含n20的puc-kana片段约106ng，2
×
basic assembly mix 5μl，pcr仪50℃反应25min。4.如权利要求2所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于s3步骤中s2步骤中，使用引物puc-kana-f和puc-cas1-r对grna scaffold、cas9基因部分序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：kod fx neo buffer18.5μl，引物各0.5μl，模板puc-φ0.5μl，pcr条件：94℃-2min；98℃-20sec，68℃-90sec(35cycles)；68℃-10min，10℃-∞；
所述puc-kana-3.3k片段扩增使用引物pc2-f和puc-cas2-r对剩余部分的cas9基因序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约3300bp处的条带，反应体系如下：赛默飞superfi ii pcr预混液10μl，引物各0.5μl，模板pcas质粒1μl，ddh2o补足至20μl；pcr条件：98℃-30sec(1cycles)；98℃-10sec，68℃-10sec，72℃-1min40sec(35cycles)；72℃-18min，4℃-∞。5.如权利要求2所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于s3步骤中，使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶对puc-kana-1.5k载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳回收约5000bp处的条带，体系如下：rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf 4μl，bamhi-hf 4μl，puc-kana-1.5载体13μl，ddh2o补足100μl，37℃反应4h；将酶切后的puc119载体与扩增的1.5k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc119载体约63ng，含n20的puc-kana片段约106ng，2
×
basic assembly mix 5μl，50℃反应25min；将酶切后的puc-kana-1.5k载体与puc-kana-3.3k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc-kana-1.5k载体约99ng，puc-kana-3.3k片段约232ng，2
×
easygeno assembly mix5μl，50℃反应30min。6.如权利要求2所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于s4步骤中，同源重组产物转化全式金dh5α感受态，涂布于无菌lb+carb培养基平板上，37℃恒温静置过夜培养；通过菌落pcr、质粒大小检测、酶切鉴定筛选阳性克隆：菌落pcr引物pc1-s-f3、pc2-r，反应体系如下：1
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taq pcr master mix(blue)7μl，引物各0.25μl，单克隆菌(溶于15μl水)3μl，pcr条件：95℃-7min(1cycles)；95℃-30sec，60℃-30sec，72℃-1min(35cycles)；72℃-10min，10℃-∞；菌落pcr筛选约1500bp的阳性克隆进行摇菌，使用擎科生物高纯度质粒dna小量提取试剂盒提取质粒，进行质粒大小检测。7.如权利要求4所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于s2步骤中，引物puc-kana-f的引物序列为：aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgcagcggtttcag；引物puc-cas1-r的引物序列为：cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc。各片段基因序列下所示：grna scaffold为gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcpuc-kana-1.5k中的cas9基因部分序列为atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtaca
aacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。8.如权利要求7所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于扩增引物pc2-f的基因序列为：ctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcga；扩增引物puc-cas2-r的基因序列为：tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc；同时，各片段基因序列下所示：扩增的cas9-3.3k序列为：tttttttgaattctctagaaacaatacttaatactatagaatgataacaaaataaactactttttaaaagaattttgtgttataatctatttattattaagtattgggtaatattttttgtagagatattttgaaaaagaaaaattaaagcatattaaactaatttcggaggtcattaaaactattattgaaatcatcaaactcattatggatttaatttaaactttttattttaggaggcaaaaatggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。9.如权利要求6所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于s4步骤中，扩增引物pc1-s-f3的基因序列为：cgcgagagcgtatgaaacg；扩增引物pc2-r的基因序列为：ccaccatatttttttggatcccagtcttttttacgagcaataagcttgtccgaa。10.如权利要求9所述的crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于，各片段基因序列下所示：puc-φ：kana质粒载体为：aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgcagcggtttcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt
tttgaattctctagaaacaatacttaatactatagaatgataacaaaataaactactttttaaaagaattttgtgttataatctatttattattaagtattgggtaatattttttgtagagatattttgaaaaagaaaaattaaagcatattaaactaatttcggaggtcattaaaactattattgaaatcatcaaactcattatggatttaatttaaactttttattttaggaggcaaaaatggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcacattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggttt
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技术总结
本发明公开了一种CRISPR-Cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法对大肠杆菌pUC119噬菌粒进行改造，将PAM区域识别的原型间隔序列、gRNA scaffold、Cas9核酸酶基因序列整合至pUC119，构建CRISPR-Cas9工程噬菌粒，能够有利于CRISPR-Cas9工程噬菌粒的快速准确构建，大大提高了CRISPR-Cas9工程噬菌粒的适应性。Cas9工程噬菌粒的适应性。Cas9工程噬菌粒的适应性。


技术研发人员：张帮周 徐炜 朱笑蝶 朱珏 李源涛 肖传兴 何剑全
受保护的技术使用者：上海承葛生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/9/9