一种磺酸基石墨烯量子点在脑瘤及其脑肿瘤边界成像中的应用的制作方法

1.本发明涉及纳米生物探针成像领域，具体涉及一种磺酸基石墨烯量子点(hso
3-gqd)在脑瘤及其脑肿瘤边界成像中的应用。


背景技术：

2.恶性脑肿瘤是致死率极高的恶性肿瘤之一，尤其是胶质细胞瘤，患者复发率接近100％，5年生存率仍不足5％。由于血脑屏障的阻碍作用，绝大部分的化疗药无法有效的到达脑瘤部位发挥疗效，最佳的治疗手段仍是手术切除。但是由于脑瘤细胞增殖及侵袭能力强，呈弥漫性浸润生长、无明确边界，依赖主观判断难以对肿瘤组织与周边正常组织区进行准确区分。不当的手术操作和不完全的切除导致神经系统的严重损伤和高复发率。因此，发展“可视化”技术，实现对脑瘤及其边界的成像定位，对于帮助脑瘤识别和辅助肿瘤的准确切除，具有非常重要的临床意义。
3.近年来，基于荧光探针的荧光成像具有成本低、安全性好、灵敏度高、实时、无辐射等优点，逐渐被发展作为一种术中导航技术，用于帮助医生区分肿瘤边界、标记微小肿瘤转移病灶。目前，临床批准使用的荧光探针有吲哚菁绿、亚甲基蓝和5-氨基乙酰丙酸等，在包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌神经胶质瘤等多种肿瘤研究中得到了广泛的应用。
4.但是目前的荧光探针仍存在一些问题，例如稳定性差、荧光寿命短，尤其是对肿瘤组织缺乏靶向特异性，限制了荧光术中导航技术的广泛应用。对脑瘤来说，探针应具备穿透血脑屏障和靶向标记肿瘤能力，目前仍是空白。因此，开发具有脑瘤精准靶向功能，具有较高肿瘤组织与正常组织区分标记能力的荧光成像技术，将对最大限度地提高肿瘤的切除效率和提高患者的生存几率具有革命性的临床价值。


技术实现要素：

5.针对目前脑瘤方面缺乏精准靶向型成像探针，本发明的目的是提供一种磺酸基石墨烯量子点(hso
3-gqd)在脑瘤及其脑肿瘤边界成像中的应用。该hso
3-gqd具有肿瘤细胞核特异性靶向能力，从而实现对肿瘤细胞的精准标记。
6.第一方面，本发明要求保护hso
3-gqd在制备用于靶向标记脑瘤的产品中的应用。
7.所述hso
3-gqd为粒径范围1.5-4nm,表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点。所述hso
3-gqd是以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制备得到的水溶性溶液。
8.进一步地，所述高温反应的温度可为180-220℃(如200℃)。在本发明的具体实施方式中，所述高温反应是在聚四氟乙烯反应釜中进行的。进行所述高温反应的时间为10-15h(如12h)。
9.进一步地，进行所述还原反应时采用的还原剂为亚硫酸钠(如浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液)。
10.第二方面，本发明要求保护hso
3-gqd在制备用于靶向识别脑瘤边界的产品中的应用。
11.所述hso
3-gqd为粒径范围1.5-4nm,表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点。所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。
12.进一步地，所述高温反应的温度可为180-220℃(如200℃)。在本发明的具体实施方式中，所述高温反应是在聚四氟乙烯反应釜中进行的。进行所述高温反应的时间为10-15h(如12h)。
13.进一步地，进行所述还原反应时采用的还原剂为亚硫酸钠(如浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液)。
14.第三方面，本发明要求保护hso
3-gqd在制备能够穿透血脑屏障的产品中的应用。
15.所述hso
3-gqd为粒径范围1.5-4nm,表面具有-so3h基团修饰的石墨烯量子点。所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。
16.进一步地，所述高温反应的温度可为180-220℃(如200℃)。在本发明的具体实施方式中，所述高温反应是在聚四氟乙烯反应釜中进行的。进行所述高温反应的时间为10-15h(如12h)。
17.进一步地，进行所述还原反应时采用的还原剂为亚硫酸钠(如浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液)。
18.第四方面，本发明要求保护hso
3-gqd在制备用于对脑瘤进行辅助诊断和/或治疗的产品中的应用。
19.所述hso
3-gqd为粒径范围1.5-4nm,表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点。所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。
20.进一步地，所述高温反应的温度可为180-220℃(如200℃)。在本发明的具体实施方式中，所述高温反应是在聚四氟乙烯反应釜中进行的。进行所述高温反应的时间为10-15h(如12h)。
21.进一步地，进行所述还原反应时采用的还原剂为亚硫酸钠(如浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液)。
22.在上述第一方面至第四方面中，所述hso
3-gqd可为烘干固体、水溶液、或用生理盐水、pbs缓冲液、细胞培养基等作为溶剂的溶液。
23.在上述第一方面至第四方面中，所述hso
3-gqd可按照包括如下步骤的方法制备得到：
24.将芘加入到浓硝酸(如16mol/l浓硝酸)中，保持80℃恒温磁力搅拌(转速可为500-800rpm/min)，回流24h；溶液冷却至室温，溶液加入去离子水稀释，随后用0.22mm滤膜过滤，抽滤后所得固体产物转移至浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液中，磁力搅拌0.5h(转速可为500-800rpm/min)，将混匀的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜，180-220℃(如200℃)下反应10-15h(如12h)，冷却至室温，抽滤得到黑棕色溶液即为所述hso
3-gqd。
25.进一步地，所述方法中，将芘加入到浓硝酸中具体可为按照1g芘50ml浓度为16mol/l浓硝酸的比例将芘加入到浓硝酸中。
26.在上述第一方面至第四方面中，所述产品均可为用于成像的产品。
27.进一步地，所述成像的应用对象包括并不限于细胞、组织、动物或人体。
28.在本发明的具体实施方式中，所述成像为活体、共聚焦显微镜荧光成像。
29.进一步地，所述成像(如活体成像)的激发波长范围为380-460nm，发射波长范围为480-560nm。最佳激发波长为440nm，发射波长为508nm。
30.在上述第一方面至第四方面中，所述脑瘤包括但不限于胶质瘤、听神经瘤、脑膜瘤、生殖细胞瘤及蝶鞍区肿瘤等在内的脑瘤类型。
31.实验证明，本发明所制备的hso
3-gqd，能够有效穿透血脑屏障，精准靶向标记脑瘤，并清晰的分辨脑瘤肿瘤组织边界，鉴于目前对脑瘤精准切除困难的临床现状，本发明有望对脑胶质瘤边界的精准定位提供“可视化”导航，具备良好的应用前景。另外，本发明对于脑瘤的辅助诊断和治疗也具有重要意义。
附图说明
32.图1为制备的hso
3-gqd原液及稀释液在白光和紫外光下的实物图片。
33.图2为实施例1中制备的hso
3-gqd利用透射电镜及原子力显微镜对其形貌和尺寸进行表征。a为低倍透射电镜图；b为高倍透射电镜图；c为原子力显微镜表征图。
34.图3为实施例1中制备的hso
3-gqd的红外光谱、荧光光谱及紫外光谱图。a为红外光谱图；b为荧光光谱图；c为紫外吸收图。
35.图4为体外血脑屏障模型的建立及hso
3-gqd对血脑屏障的穿透能力。a为不同初始细胞形成的体外血脑屏障；b为hso
3-gqd对不同初始细胞形成的血脑屏障的穿透能力。
36.图5为hso
3-gqd对小鼠胶质瘤模型、大鼠胶质瘤模型脑瘤的靶向标记性。a为荧光素酶标记的大/小鼠胶质瘤模型构建成功活体成像；b为hso
3-gqd对大鼠/小鼠胶质瘤靶向活体成像。
37.图6为hso
3-gqd对小鼠胶质瘤肿瘤标记的全脑切片。ai，bi为胶质瘤小鼠脑部核磁共振扫描图；aii，bii为hso
3-gqd靶向标记的胶质瘤小鼠脑部荧光成像图。
38.图7为hso
3-gqd对胶质瘤边界识别。a为小鼠脑胶质瘤细胞切片共聚焦成像；b为大鼠脑胶质瘤细胞切片共聚焦成像。
39.图8为hso
3-gqd不同时间的体内分布。
具体实施方式
40.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
41.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.实施例1、hso
3-gqd的制备
43.将1g芘加入到50ml的16mol/l浓硝酸中，80℃下恒温磁力搅拌，转速500-800rpm/min，回流24h；24h后，溶液冷却至室温，用500ml去离子水，0.22μm滤膜，冲洗抽滤，得到过滤后的反应产物；将反应产物转移至100ml浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液(溶剂为水)中，磁力搅拌0.5h，转速500-800rpm/min；随后将混匀的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜，并转入干
燥箱，在200℃下反应12h，冷却至室温，抽滤得到黑棕色溶液即为所制备的hso
3-gqd。
44.实施例2、hso
3-gqd原液及稀释液在白光和紫外光下的实物图片
45.将上述实施例1制备的hso
3-gqd原液和稀释100倍的稀释液分别在白光和紫外光照射下拍照，如图1所示，可见实施例1制备的hso
3-gqd原液呈现黑棕色，紫外照射下发明亮的黄光；稀释100倍的稀释液为澄清的棕色溶液，无沉淀，具有良好的水溶性和分散性，紫外照射下呈现明亮的蓝色光。
46.实施例3、hso
3-gqd的形貌和尺寸表征
47.分别利用透射电镜和原子力显微镜对实施例1制备的hso
3-gqd的形貌和尺寸进行表征。如图2中a所示，低倍透射电镜下显示，hso
3-gqd分散性良好，呈单分散状态，平均粒径为3nm，图2中b所示，在高倍显微镜下，hso
3-gqd呈现规则的六边形晶体结构；图2中c所示，原子力显微镜显示hso
3-gqd的平均厚度为1.307nm。该实施例所示结果显示hso
3-gqd为石墨烯量子点。
48.实施例4、hso
3-gqd的红外吸收峰、荧光光谱和紫外光谱表征
49.将实施例1中制备得到的hso
3-gqd进行液体红外光谱表征，如图3中a所示，hso
3-gqd具有-nh(3570cm-1
)、-oh(3400cm-1
)、-no2(1653cm-1
)、-c＝c(1404cm-1
)，c＝c-h(1124cm-1
)、hso
3-(1034cm-1
)、-ch(889cm-1
)以及c-s(613cm-1
)特征峰。图3中b所示，hso
3-gqd激发发射波长范围广，最佳激发波长为440nm，发射波长为508nm。图3中c所示，hso
3-gqd的紫外吸收峰值在382nm。
50.实施例5、体外血脑屏障模型的建立及hso
3-gqd对血脑屏障的穿透能力
51.将不同初始细胞数(5000、10000、20000、30000个)的小鼠脑微血管内皮细胞(购于尚恩生物货号：snl-158)培养在transwell的上室中，分别在培养的第3天和第7天通过光学显微镜观察血脑屏障膜的生成情况。如图4中a所示，第3天细胞已经致密生长，不见细胞空隙，培养至第7天，细胞已经长成非常致密的细胞膜，表明体外血脑屏障模型的成功建立。随后将100μl的hso
3-gqd(浓度为100mg/l)(实施例1制备)加入到transwell的上室中，可以看到加入hso
3-gqd的上室发蓝色光，下室加入pbs，未有量子点穿透时，下室不发光。加入hso
3-gqd 0.5h后，下室观察到明显的蓝色，2h时，下室的蓝色荧光强度增强(图4中b)，该结果表明，本发明实施例1制备的hso
3-gqd成功的穿透血脑屏障。
52.实施例6、hso
3-gqd对小鼠胶质瘤模型、大鼠胶质瘤模型脑瘤的靶向标记性
53.建立胶质瘤动物模型：balb/c裸鼠脑内植入10μl,1
×
105cells/μl的u-251mg-luc-rfp-puro双标记的人神经胶质细胞瘤细胞(订购于上海澳音生物，货号sac0404lr)/gl261-luc-rfp-puro双标记的小鼠胶质瘤(购于上海澳音生物，货号sac0135lr)，sd大鼠脑内植入15μl,1
×
106cells/μl的c6-luc-rfp-puro双标记的大鼠胶质瘤细胞(购于上海澳音生物，货号sac0071lr)。如图5中a所示，注射肿瘤细胞4天后，利用体内显像系统检测luc的生物发光，脑部显示蓝绿色荧光，表明动物脑瘤模型构建成功。将100μl的hso
3-gqd(实施例1制备)尾静脉注射至脑胶质瘤模型鼠体内(每kg小鼠体重注射100mg hso
3-gqd)，0.5h后进行活体成像，如图5中b所示，hso
3-gqd在所有脑瘤动物模型中，均靶向标记脑瘤。
54.实施例7、hso
3-gqd对胶质瘤肿瘤标记的全脑切片
55.按照实施例6，将脑瘤动物模型进行核磁共振成像，随后将脑取出，制作全脑的冰冻切片，并进行dapi细胞核染色，随后利用共聚焦显微镜观察。如图6所示，hso
3-gqd可清晰
的靶向标记肿瘤(白色箭头)，相比核磁共振成像，荧光成像分辨率更高，对肿瘤的形状，大小等细节标记更精准。
56.实施例8、hso
3-gqd对胶质瘤边界识别
57.按照实施例7，将全脑切片放大倍数观察，如图7中a所示的小鼠胶质瘤冰冻切片中，dapi不具备特异性，无法区分肿瘤边界，而hso
3-gqd的绿色荧光可清晰的将肿瘤的轮廓边缘标记出来。如图7中b所示，在大鼠胶质瘤冰冻切片中，hso
3-gqd的绿色荧光与dapi蓝色荧光重叠，表明hso
3-gqd定位在脑瘤细胞核中，并且从hso3-gqd的荧光中可以清晰的划分肿瘤组织边界。
58.实施例9、hso
3-gqd不同时间的体内分布
59.将100μl的hso
3-gqd尾静脉注射至gl-261脑胶质瘤模型鼠(每kg小鼠体重注射100mg hso
3-gqd)(参见实施例6)体内。分别于给药后0.5h、6h、12h和24h后处死小鼠，收集脑瘤及其他正常组织，用体内成像系统对器官和肿瘤进行成像，并记录荧光强度，观察hso
3-gqd在体内随时间的分布和代谢情况。如图8所示，注射hso
3-gqd0.5 h后，即可观察到明显的脑瘤靶向标记，除此之外，hso
3-gqd在肝脏、肺和肾脏也有聚集；注射6h后，脑部靶向仍可明显的观察到，并且肺的聚集减少；而注射12h后，hso
3-gqd的仅在肾脏聚集，其他脏器已经没有明显聚集；24h后，仍在肾脏观察到少量的hso
3-gqd，其他脏器未观察到。以上结果表明，注射hso
3-gqd0.5 h即可出现脑瘤靶向，并且在脑部停留超过6h，hso
3-gqd在12h后大部分经由肾脏排出，不会在肝脏停留过长时间，保证了使用的安全性。
60.上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.hso
3-gqd在制备用于靶向标记脑瘤的产品中的应用；所述hso
3-gqd为粒径范围为1.5-4nm，表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点；所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。2.hso
3-gqd在制备用于靶向识别脑瘤边界的产品中的应用；所述hso
3-gqd为粒径范围为1.5-4nm，表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点；所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。3.hso
3-gqd在制备能够穿透血脑屏障的产品中的应用；所述hso
3-gqd为粒径范围为1.5-4nm，表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点；所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。4.hso
3-gqd在制备用于对脑瘤进行辅助诊断和/或治疗的产品中的应用；所述hso
3-gqd为粒径范围为1.5-4nm，表面具有-hso3基团修饰的石墨烯量子点；所述hso
3-gqd为以芘为前体物，经过硝化反应、还原反应及高温反应后制得的水溶性物质。5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述hso
3-gqd按照包括如下步骤的方法制备得到：将芘加入到浓硝酸中，保持80℃恒温磁力搅拌，回流24h；溶液冷却至室温，溶液加入去离子水稀释，随后用0.22mm滤膜过滤，抽滤后所得固体产物转移至浓度为0.5mol/l的亚硫酸钠溶液中，磁力搅拌0.5h，将混匀的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜，180-220℃下反应10-15h，冷却至室温，抽滤得到黑棕色溶液即为所述hso
3-gqd。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述方法中，将芘加入到浓硝酸中为按照1g芘对应50ml浓硝酸的比例将芘加入到浓硝酸中。7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为用于成像的产品。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述成像为活体、共聚焦显微镜荧光成像。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述成像的激发波长范围为380-460nm，发射波长范围为480-560nm。

技术总结
本发明公开了一种磺酸基石墨烯量子点(HSO


技术研发人员：丁琳 李富荣 梁敏莉
受保护的技术使用者：深圳市人民医院
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/9/9