一种靶向溶酶体脂滴敏感型荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种靶向溶酶体脂滴敏感型荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.脂滴(ld)和溶酶体是细胞中的重要细胞器。lds是细胞中最具脂溶性的亚细胞细胞器，在能量储存、蛋白质降解、膜合成和运输、脂质代谢调节和信号转导等生理过程中发挥重要作用。然而，lds的失衡可能会导致一系列疾病，如糖尿病、脂肪肝、高血脂、动脉粥样硬化甚至阿尔茨海默病。溶酶体可以降解和回收活细胞中的外源和内源性生物分子，并可以消耗脂滴为细胞提供能量。溶酶体的异常可导致炎症和与肿瘤密切相关的疾病。因此，单个荧光探针检测活细胞中lds和溶酶体的能力对于研究脂滴和溶酶体之间的相互作用具有重要意义。
3.目前，使用荧光检测的方法多种多样，其中荧光探针是使用最广泛的方法之一。荧光探针具有独特的优势，如高灵敏度、优异的时空分辨率和对生物样品的低损伤，已广泛开发用于活细胞的原位成像和各种活性分子的检测。在过去几十年中，用于检测lds或溶酶体的荧光探针层出不穷。因此，能够用单个荧光探针对活细胞中的两个亚细胞进行成像是非常有意义的。


技术实现要素：

4.本发明设计并合成了一种靶向溶酶体脂滴敏感型荧光探针，该探针能够同时靶向脂滴与溶酶体。在hela细胞成像实验中，细胞毒性低，能准确定位细胞。
5.本发明还提供了一种能够简单高效制备靶向溶酶体脂滴敏感型荧光探针的制备方法。
6.本发明还提供了一种上述荧光探针的应用。
7.本发明采用以下技术方案，合成了一种可以同时靶向溶酶体和脂滴的有机小分子荧光探针。
8.本发明合成的荧光探针的分子结构式如下：
[0009][0010]
探针btd-lyso的合成路线如下：
[0011]
[0012]
将化合物1(51.8mg,0.2mmol)，化合物2(75.7mg,0.4mmol)，pd(oac)2(9.0mg,0.04mmol)，k2co3(110.6mg,0.8mmol)溶解在thf(2.5ml)中，在氮气的氛围下，在100℃下搅拌4小时。反应结束后，粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,v/v＝10/1)纯化，得到红褐色固体btd-lyso(53.7mg,73％)1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.70(d,j＝8.3hz,1h),8.19(d,j＝16.1hz,1h),8.02(d,j＝8.1hz,1h),7.78
–
7.58(m,3h),7.03(d,j＝7.9hz,2h),3.76(s,4h),3.20(d,j＝43.1hz,4h).
13
c nmr(400mhz,dmso-d6)δ152.3,138.7,138.5,137.2,136.9,136.7,129.4,127.1,123.6,119.7,115.0,115.0,95.0,66.4,47.8.hrms(esi):calcd for c18h16n4o3s[m+h]
+
396.1016,found 369.1010.
[0013]
本发明靶向溶酶体脂滴敏感型荧光探针的用途：该荧光探针可以同时对应用于复杂生物体细胞中的脂滴和溶酶体检测；对探针做了荧光光谱测试和细胞成像；
[0014]
本发明采用上述技术方案具有以下优点：
[0015]
(1)探针的合成步骤简单，原料来源广泛；
[0016]
(2)该探针对脂滴响应效果好，进入细胞快，稳定性好。
[0017]
(3)在细胞成像实验中，细胞毒性低，能够同时对细胞内的脂滴和溶酶体进行成像。
[0018]
(4)故而，本发明是一种低成本、高灵敏度、样品用量少、对脂滴和溶酶体靶向效果好的荧光探针。
附图说明
[0019]
图1为探针btd-lyso的1h nmr图谱；
[0020]
图2为探针btd-lyso的
13
c nmr图谱；
[0021]
图3为探针btd-lyso在不同溶剂的紫外吸收图谱；
[0022]
图4为探针btd-lyso在不同比例的dioxane与meoh荧光发射图谱；
[0023]
图5为图4的归一化谱图；
[0024]
图6为探针btd-lyso的mtt结果图；
[0025]
图7为探针btd-lyso在细胞中荧光动力学过程图；
[0026]
图8为探针btd-lyso的脂滴共定位实验；a)hela细胞的明场；b)bodipy(500nm)染色绿色通道(λ
ex
＝405nm,λ
em
＝470-500nm)；c)btd-lyso(10μm)染色红色通道(λ
ex
＝496nm,λ
em
＝700-800nm)；d)为(b)和(c)的合并图像；e)为b)和c)的荧光共定位曲线；
[0027]
图9为探针btd-lyso的溶酶体共定位实验a)hela细胞的明场；b)lyso-tracker green(50nm)染色绿色通道(λ
ex
＝405nm,λ
em
＝500-530nm)；c)btd-lyso(10μm)染色红色通道(λ
ex
＝496nm,λ
em
＝700-800nm)；d)为(b)和(c)的合并图像；e)为b)和c)的荧光共定位曲线。
具体实施方式
[0028]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，btd-lyso代表荧光探针。
[0029]
实施例1
[0030]
探针btd-lyso的合成路线如下：
[0031][0032]
将化合物1(51.8mg,0.2mmol)，化合物2(75.7mg,0.4mmol)，pd(oac)2(9.0mg,0.04mmol)，k2co3(110.6mg,0.8mmol)溶解在thf(2.5ml)中，在氮气的氛围下，在100℃下搅拌4小时。反应结束后，粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,v/v＝10/1)纯化，得到红褐色固体btd-lyso(53.7mg,73％)1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.70(d,j＝8.3hz,1h),8.19(d,j＝16.1hz,1h),8.02(d,j＝8.1hz,1h),7.78
–
7.58(m,3h),7.03(d,j＝7.9hz,2h),3.76(s,4h),3.20(d,j＝43.1hz,4h).
13
c nmr(400mhz,dmso-d6)δ152.3,138.7,138.5,137.2,136.9,136.7,129.4,127.1,123.6,119.7,115.0,115.0,95.0,66.4,47.8.hrms(esi):calcd for c
18h16
n4o3s[m+h]
+
396.1016,found 369.1010.
[0033]
探针的1h nmr图谱见图1，
13
c nmr图谱见图2。
[0034]
探针btd-lyso的分子式为：c
18h16
n4o3s。
[0035]
实施例2
[0036]
取荧光探针btd-lyso溶于二甲基亚砜(dmso)中，制成1mm的储备液。将储备液与常见的有机溶剂和pbs稀释成10μμ工作溶液，进行紫外吸收测试。如图3所示，发现其吸收峰在500nm左右，最大吸收波长在上述极性的溶剂中有微小的变化，这意味着在基态时偶极矩受不同溶剂的影响较小。
[0037]
实施例3
[0038]
取荧光探针btd-lyso溶于二甲基亚砜(dmso)中，制成1mm的储备液。将储备液与不同比例的dioxane和甲醇稀释成10μμ工作溶液，进行荧光测试。以500nm的激发波长测试其荧光发射强度。如图4,5所示，探针在700-800nm的波长范围(wavelength)内显示出了一定的荧光强度。随着溶剂中dioxane比例增加，溶剂的极性减小，探针的荧光强度增加。以上数据表明该探针对脂滴有着很好的响应效果。
[0039]
实施例4
[0040]
在进行细胞成像之前，我们要对btd-lyso进行细胞毒性实验，采用标准的mtt比色法检测探针btd-lyso在体外对hela细胞的细胞毒性。首先，将2
×
105个细胞/ml的细胞接种在96孔板中，然后用不同浓度的btd-lyso(0、2、5、10、15和20μm)处理24小时。随后，向每个孔中加入10μl mtt(5mg/ml)并再孵育3小时。最后，除去培养基，加入100μl dmso以溶解甲瓒晶体。将平板轻微摇动约10分钟，用酶标仪测量570nm处的吸光度。如图6所示，btd-lyso在hela细胞中的mtt分析显示存活率超过80％，表明该探针可作为复杂生物环境中脂滴和溶酶体标记的实用工具。
[0041]
实施例5
[0042]
btd-lyso在细胞中的动力学过程。具体操作如下将btd-lyso(10μμ)加入到含有hela细胞共聚焦培养小皿中，从加入btd-lyso开始计时每隔5分钟进行一次细胞成像。如图7所示，发现当5分钟时，细胞已经有较为明显的颜色。到25分钟时，荧光强度达到最大值，此后荧光强度几乎不变。说明btd-lyso在细胞成像中能够迅速成像，且具有良好的稳定性。
[0043]
实施例6
[0044]
btd-lyso对脂滴进行细胞共定位成像。具体操作如下将hela细胞，bodipy(500nm)与btd-lyso(10μμ)孵育20分钟，然后用无菌pbs缓冲液清洗细胞三次，然后在进行细胞共定位成像。如图8所示，如图8c所示，细胞脂质滴上有明显的红色荧光(λ
ex
＝496nm,λ
em
＝700-800nm)，而在图8b中，荧光成像由商业有机染料bodipy收集(λ
ex
＝405nm,λ
em
＝470-500nm)，表现出明显的绿色荧光。此外，共定位图显示，绿色和红色图基本重叠，皮尔逊系数高达86％。所有上述特征表明，探针btd-lyso可用于细胞lds标记。
[0045]
实施例7
[0046]
btd-lyso对溶酶体进行细胞共定位成像。具体操作如下将hela细胞，lyso-tracker green(50nm)与btd-lyso(10μμ)孵育20分钟，然后用无菌pbs缓冲液清洗细胞三次，然后在进行细胞共定位成像。如图9所示，如图9c所示，细胞溶酶体上有明显的红色荧光(λ
ex
＝496nm,λ
em
＝700-800nm)，而在图9b中，荧光成像由商业有机染料lyso-tracker green收集，表现出明显的绿色荧光(λ
ex
＝405nm,λ
em
＝500-530nm)。此外，共定位图显示，绿色和红色图基本重叠，皮尔逊系数高达83％。所有上述特征表明，探针btd-lyso可用于细胞溶酶体标记。
[0047]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种靶向溶酶体脂滴敏感型的荧光探针btd-lyso，其特征在于，所述荧光探针btd-lyso具有式i所示结构；2.权利要求1所述荧光探针btd-lyso的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将化合物1、化合物2、pd(oac)2和k2co3溶解在thf中，在氮气的氛围下，在100℃下搅拌4小时，反应结束后，粗品经硅胶柱层析纯化，得到所述荧光探针btd-lyso；化合物1具有式ii所示结构：化合物2具有式iii所示结构：3.权利要求1所述荧光探针btd-lyso在生物检测中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述生物检测包括生物细胞体系检测。5.权利要求1所述荧光探针btd-lyso在生物细胞体系中脂滴和溶酶体的传感检测中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述传感检测包括荧光检测和细胞成像检测。7.一种生物细胞体系中脂滴和溶酶体的传感检测元件，其特征在于，包括权利要求1所述荧光探针btd-lyso。

技术总结
本发明属于有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及一种靶向溶酶体脂滴敏感型荧光探针及其制备方法和应用。该探针能够同时靶向脂滴与溶酶体。在HeLa细胞成像实验中，细胞毒性低，能准确定位细胞，能够同时对细胞内的脂滴和溶酶体进行成像。本发明是一种低成本、高灵敏度、样品用量少、对脂滴和溶酶体靶向效果好的荧光探针。探针。探针。


技术研发人员：王宏伟 张华 刘兴丽 张艳艳 杨晓娟 张鑫评 张煜松 王建勇 李聪聪 王琳
受保护的技术使用者：郑州轻工业大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/9/9