一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液及其制备方法与流程

1.本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及到一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤包在身体表面，直接同外界环境接触，具有保护、排泄、调节体温和感受外界刺激等作用，是人体最大的器官。也因此，皮肤极易遭受损伤，例如由太阳引起的红斑、灼伤，例如因外部环境造成的烧伤、皮肤溃疡等，例如因如糖尿病足和静脉溃疡等病引起的创面型溃疡。而医学和医美领域对于这种皮肤外表皮损伤的治疗和修复已经比较完善了，现有技术中存在大量针对外皮损伤的修复技术，例如症状较轻的轻微晒伤，可以采用具有缓解功效的芦荟胶等护肤品进行护理；例如症状轻的烫伤，可以采用微整形技术进行修复，而较为严重的烧伤等则可以通过外科手术移植的方法进行修复。
3.可以看出上述方法均为对皮肤表皮的损伤进行的修复措施，但实际生活中，人随着年龄的增长，一些真皮成分和胶原蛋白的减少，会导致皮肤出现凹陷，表皮显著起皱和松垂，这种由于皮肤内部成分丧失而导致的皮肤问题，导致许多爱美的女性产生困扰，因此急需一种可以从皮肤内部解决皮肤凹陷、衰老根本问题的修复液，来使肌肤“重焕生机”。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液及其制备方法，可以进入人体皮肤组织中，使胶原蛋白再生，通过填充和交联的方法提供支撑，提高细胞的增殖、分化能力，对受损的皮肤从内部进行修复。
5.为达上述目的，本发明提供了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括成纤维细胞液、胶原蛋白、积雪草提取物、弹性蛋白、ph调节剂以及抗炎剂，所述成纤维细胞液由成纤维细胞与生长因子和海藻酸钠任意组合后得到；
6.所述弹性蛋白和胶原蛋白由章鱼经过破碎、酶解、浓缩后制得；
7.所述成纤维细胞由人疤痕皮肤进行原代培养后制得。
8.进一步的，所述皮肤用复配液中成纤维细胞的含量为50～80mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为10～200mg/l。
9.进一步的，以重量份计，包括成纤维细胞液30～35份、积雪草提取物10～30份、抗炎剂0.1～1.0份；所述ph调节剂调节所述皮肤用复配液的ph值为4.5～9.0。
10.进一步的，所述ph调节剂为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液，所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物。
11.进一步的，所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
12.将章鱼破碎，得到章鱼糜，与水加热混合后得到浆液；
13.将所述浆液离心后收集沉淀，在所述沉淀中加入清水，得到匀浆液；
14.将所述匀浆液加入复合酶依次进行酶解、过滤后浓缩干燥，制得含有胶原蛋白和
弹性蛋白的混合物。
15.进一步的，所述成纤维细胞液由质量比为10～50:0.01～0.5:10～20的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠混合得到。
16.进一步的，所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
17.将人疤痕皮肤破碎后，进行二氧化碳孵育，孵育后再置于含有小牛血清的dmem培养基中继续培育，得到原代成纤维细胞；
18.将原代成纤维细胞继续培养后进行饥饿处理和重悬，进行传代培养后得到。
19.进一步的，所述生长因子包括ngf、tgf-α、egf、fgf和pdgf中的至少一种。
20.第二方面，本发明公开了第一方面任一所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液的制备方法，包括以下步骤：
21.将胶原蛋白、积雪草提取物、弹性蛋白以及抗炎剂混合均匀后，在搅拌状态下加入成纤维细胞液和ph调节剂调节ph后制得。
22.进一步的，所述搅拌的温度为20～30℃。
23.综上所述，本发明具有以下优点：
24.1、本发明公开了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，是一种可以既可以用于注射的针剂型药液，也可以用于涂敷的凝胶型产品。其中，胶原蛋白和弹性蛋白均从章鱼中提取得到，因此在胶原蛋白和弹性蛋白中还含有少量的牛磺酸、维生素等物质，既可以促进人体的新陈代谢，提高机体免疫力，也可以促进皮肤修复，使凹陷的肌肤重新富有光泽和弹性，延缓衰老。其中成纤维细胞液包括成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠，从人疤痕皮肤培养得来的成纤维细胞活性高，可以提高细胞增殖的能力、dna代谢的能力以及胶原合成的能力。生长因子可以根据不同的种类对不同的细胞进行分化和生长，以促进和刺激细胞的生长。因此，本发明的皮肤用复配液可以在皮肤内部进行构建细胞，促进细胞再生和分化，通过细胞再生和胶原蛋白修复，以解决皮肤凹陷和衰老的问题。
25.2、本发明公开的皮肤用复配液，可以提高皮肤细胞增殖分化能力，促进皮肤细胞进行新陈代谢，并提高其合成胶原的能力。可以刺激基底细胞分裂，快速改善皮肤的外观，延长细胞的生长周期，改善和增加衰老皮肤的厚度和密度及胶原纤维，减少皮肤皱纹。
附图说明
26.图1为使用本发明的复配液前后的皮肤组织结构示意图；
27.图2为皮肤中弹性蛋白和胶原蛋白的位置关系图。
具体实施方式
28.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
29.除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
30.一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括成纤维细胞液、胶原蛋白、积雪草提
取物、弹性蛋白、ph调节剂以及抗炎剂，所述成纤维细胞液由成纤维细胞与生长因子和海藻酸钠任意组合后得到；
31.所述弹性蛋白和胶原蛋白由章鱼经过破碎、酶解、浓缩后制得；
32.所述成纤维细胞由人疤痕皮肤进行原代培养后制得。
33.本发明中，成纤维细胞在椭圆形的，有两个或多个核仁的有斑点的核周围具有分支的细胞质。活跃的成纤维细胞可以通过其丰富的粗糙内质网来识别。失活的成纤维细胞(称为纤维细胞)较小，呈纺锤形，并具有减少的粗糙内质网。尽管成纤维细胞在必须覆盖较大空间时会相互分离和分散，但当拥挤时，它们通常会局部排列成平行排列。当人体进入一定年龄段时，人体皮肤会因为胶原蛋白流失、成纤维细胞失活，造成皮肤凹陷，坍塌等情况发生，面部显示老态，如图1所示，左边为修复后的正常结构图，右边为凹陷状态的结构图。本发明中采用原代培养后进行传代培养，可以根据活性选择传代后的成纤维细胞，以提高本发明中的细胞活性。本发明中，成纤维细胞的主要功能是通过连续分泌细胞外基质的前体来维持结缔组织的结构完整性。成纤维细胞分泌细胞外基质所有成分的前体，主要是磨碎的物质和各种纤维。细胞外基质的组成决定结缔组织的物理性质。因此，通过在组分中添加含有成纤维细胞的细胞液，可以在组织中持续制造胶原纤维、糖胺聚糖、网状和弹性纤维等真皮组织的组分。
34.胶原蛋白是一种生物高分子，也是动物体内最多的功能性蛋白，其具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物活性，以胶原蛋白为基质，可以提高复配液在人体内的相容性能，以促进各种组分在组织内部交联反应。在本发明的组分中添加胶原蛋白(有部分胶原蛋白也是通过成纤维细胞作用得到的)，不仅可以直接向皮肤中提供胶原蛋白，还可以促进皮肤的蛋白质的产生，例如原纤维蛋白和弹性蛋白。
35.弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，尽管弹性蛋白只占真皮总蛋白的2％，但它对皮肤弹性起着重要作用。弹性蛋白是皮肤老化产生松弛、下垂和细皱纹的主要原因，随着皮肤自然老化，弹性纤维分解越来越显著，到70岁，大多数弹性纤维受影响。已知皮肤的凹陷、老化和坍塌，是纤维结构的断裂、失活，因此补充碳纤纤维的主要成分，也是一种可以提高皮肤张力和弹性的方法。弹性纤维与胶原纤维共同存在(如图2所示)，可以赋予皮肤组织以弹性和抗张能力，其中胶原蛋白给予皮肤支撑和力量，而弹性蛋白则赋予皮肤弹性，两者相辅相成。
36.积雪草提取物可以紧致表皮和真皮连接的部位，可以使皮肤变柔软，光滑更有弹性。在本发明中，可以帮助真皮层促进胶原蛋白形成并使纤维蛋白重生，连接起来。同时积雪草提取物作为一种天然植物提取物，可具有促进成纤维细胞和胶原细胞的合成、抗菌、消炎等多种作用。同时，本发明中的成纤维细胞是从人疤痕皮肤中培养得到的，积雪草提取物中的积雪草苷具有促进疤痕成纤维细胞的活力，可以合成和分泌胶原纤维(胶原蛋白为主要成分)和细胞外基质。同时可以调节复配液的基质性能，减少敏感成分的存在，提高组织的相容性。
37.本发明所采用的积雪草提取物可以通过市售购得，也可以通过常规提取方法制备得到。例如，采用下述提取方法：将积雪草粉碎后加3～5倍量的体积份数为80～90％乙醇溶液浸泡4～6小时后，加热回流提取2～3次，每次提取时间为1～2h，合并提取液，过滤，滤液经回收乙醇后浓缩成浸膏，最后干燥成粉末即可。
38.抗炎剂中的多酚和抗生素之间有良好的结合力，可以提高复配液的亲水性、抗菌性和抗炎性能，满足医学和美容学的需求。当注入皮肤内部时，细菌粘附时，可以释放抗生素和多酚，调节炎症反应，有效杀菌，减轻组织的排异反应。
39.生长因子是一类调节微生物正常生长代谢所必需的有机物，可以促进细胞分化增长，加速愈合。
40.海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-d-甘露糖醛酸和α-l-古洛糖醛酸按(1
→
4)键连接而成，是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。本发明中的海藻酸钠一方面是一种纤维结构，可以缠绕在复配液组分表面，提高复配液的稳定性。另一方面可以提高成纤维细胞液的胶凝性能，将成纤维细胞保护在胶凝液内部，当进入人体皮肤后，通过体温打开胶凝的缺口，释放出成纤维细胞，与组织进行合成和分化。
41.在本发明一些可选的实施例中，所述皮肤用复配液中成纤维细胞的含量为50～80mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为10～200mg/l。
42.在本发明一些可选的实施例中，以重量份计，包括成纤维细胞液30～35份、积雪草提取物10～30份、抗炎剂0.1～1.0份；所述ph调节剂调节所述皮肤用复配液的ph值为4.5～9.0。
43.更优选的，包括成纤维细胞液35份、积雪草提取物10份和抗炎剂1.0份。
44.在本发明一些可选的实施例中，所述ph调节剂为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液，所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物。
45.本发明中，多酚溶液的浓度为0.2～0.8g/l，抗生素溶液的浓度为0.05～10g/l。
46.上述方案中，多酚类化合物具有良好的亲水抗污、抗炎、抗菌及抗氧化功能，且其结构可提供多种作用力，包括静电、氢键、疏水作用、共价键等，可有效提高活性物质的装载及缓释，提高功能性物质的缓释及活性；通过功能性分子茶多酚与抗生素分子协同作用，不仅弥补了单一固定抗生素材料的抗污和抗炎性不足、体内不稳定引发炎症的缺陷，同时还通过茶多酚与抗生素两条途径，协同提升复配液的亲水抗污、抗炎、抗菌的能力，显著提高复配液的生物相容性。因此采用本发明的复配液进行胶原蛋白重生和填充时，可以减少皮肤敏感的几率，可以加快炎症消失，使美容针留在皮肤上的红肿消失速度加快。
47.在本发明的实施例中，所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
48.将章鱼破碎，得到章鱼糜，与水加热混合后得到浆液；
49.将所述浆液离心后收集沉淀，在所述沉淀中加入清水，得到匀浆液；
50.将所述匀浆液加入复合酶依次进行酶解、过滤后浓缩干燥，制得含有胶原蛋白和弹性蛋白的混合物。
51.具体的，所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
52.将章鱼破碎，得到章鱼糜，加入5～15倍质量的水加热至20～30℃，混合得到浆液；
53.将所述浆液通过高速离心机进行2～5次的离心，优选为4次的离心。前两次的以300g和2000g的离心力离心处理10min后弃去沉淀，再将上清液以10000的离心力离心30min后弃去沉淀，取上清液再以100000的离心力离心60min，收集沉淀。
54.将沉淀加入水中，再加入ph调节ph至7.0左右后加入沉淀质量5％～10％的复合酶进行酶解。复合酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋
白酶的混合物。所述复合酶与胶原蛋白的质量比为1～5:100。酶解的温度为30～50℃，酶解的ph为7～7.5，酶解的时间为1～4h。
55.酶解结束后，将得到的胶原蛋白与弹性蛋白的混合物进行过滤，浓缩和干燥。
56.本发明中，浓缩和干燥可采用常规参数进行。
57.章鱼是一种重要的海洋经济动物，其具有生命周期短、生长快的特点，因此资源丰富。本发明对章鱼的组织进行酶解，得到的蛋白混合物里既有胶原蛋白也有弹性蛋白，完全满足本发明的复配液对胶原蛋白和弹性蛋白的需求。同时活性成分含量高，可溶性好，吸收性高，作为本发明的原料，与其它组分的适配性也高。章鱼是一种高蛋白产品，它体内富含18种氨基酸，包含人体所需的八种必须氨基酸。特别是天然牛磺酸含量在水产品中含量最高。牛磺酸具有消炎、镇痛、维持机体渗透压平衡的作用，其在本发明中还可以提高机体免疫能力，具有调节神经传导功能。
58.优选的，所述成纤维细胞液由质量比为10～50:0.01～0.5:10～20的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠混合得到。
59.更优选的，所述成纤维细胞液由质量比为50:0.02:10的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠组成。
60.在本发明的实施例中，所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
61.将人疤痕皮肤破碎后，进行二氧化碳孵育，孵育后再置于含有小牛血清的dmem培养基中继续培育，得到原代成纤维细胞；
62.将原代成纤维细胞继续培养后进行饥饿处理和重悬，进行传代培养后得到。
63.具体的，所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
64.将人疤痕皮肤剪去表皮和皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块，接种于培养瓶中，在50ml/l的co2孵育箱中赋予5h后加入含有100ml/l的小牛血清的dmem培养基，继续培养，每2d换液一次。待细胞长出后即为原代成纤维细胞。
65.将原代成纤维细胞继续培养至70～80％左右融合时，用pbs缓冲液清洗细胞1～3次，更换无血清培养基继续培养24h，收集上清液进行离心，过滤后取沉淀用含20ml/l的小牛血清的dmem重悬细胞，按照1～3传代，得到第3～6代的成纤维细胞。
66.在本发明的实施例中，所述生长因子包括ngf、tgf-α、egf、fgf和pdgf中的至少一种。
67.其中，ngf，神经生长因子(nerve growth factor，ngf)能促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。
68.tgf，包括转化生长因子-α和转化生长因子-β，对细胞发育、生长、增殖、分化、凋亡均具有重要的生理调节作用。转化生长因子-α是一种多肽类生长因子，对许多正常细胞只有转化作用。在肝脏中，转化生长因子-α可以增加肝细胞dna的合成、刺激肝细胞再生，是肝细胞增殖分化过程中，促进dna合成的必不可少的丝裂原，在疾病肝组织增生分化时有表达。
69.egf，表皮生长因子，是一种强有力的细胞分裂因子，具有多种生物活性，egf具有修复表皮、抗衰老、淡化色斑、平复皱纹、滋润之功效，人体中egf的含量多少直接决定着皮肤的年轻程度，egf因此又被誉为“美丽因子”。egf可以促进dna、rna和功能蛋白质的生物合成，可以促进细胞外大分子的合成，如本发明的弹性纤维蛋白，可以增加皮肤的含水量，进
而增加皮肤的弹性。还可以促进细胞营养物质从细胞外主动运至细胞内，增加细胞内的营养。还可以促进真皮细胞分泌合成胶原纤维、糖蛋白和多糖等功能分子，使皮下真皮组织饱满、肌纤维排列整齐紧密，从而减少和消除皱纹。
70.fgf，成纤维细胞生长因子，它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。
71.pdgf，血小板衍生生长因子，具有促分裂效应，可以刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的分裂增生，还可以刺激停滞的成纤维细胞等进入分裂增殖周期。
72.第二方面，本发明公开了第一方面任一所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液的制备方法，包括以下步骤：
73.将胶原蛋白、积雪草提取物、弹性蛋白以及抗炎剂混合均匀后，在搅拌状态下加入成纤维细胞液和ph调节剂调节ph后制得。
74.以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
75.实施例1
76.本实施例提供了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括以下原料：
77.成纤维细胞液35份、胶原蛋白、积雪草提取物30份、弹性蛋白以及抗炎剂1.0份，通过碳酸氢钠溶液调节所述皮肤用复配液的ph值为6.8。
78.本实施例中，成纤维细胞的含量为80mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为200mg/l。所述成纤维细胞液由质量比为50:0.02:10的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠混合得到。其中生长因子包括质量比为1:1的egf和pdgf。
79.ph调节剂为碳酸钠溶液，所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物，复配液中多酚溶液的浓度为0.2g/l，抗生素溶液的浓度为0.05g/l。
80.所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
81.将章鱼破碎，得到章鱼糜，加入10倍质量的水加热至30℃，混合得到浆液；
82.将所述浆液通过高速离心机进行4次的离心。前两次的以300g和2000g的离心力离心处理10min后弃去沉淀，再将上清液以10000的离心力离心30min后弃去沉淀，取上清液再以100000的离心力离心60min，收集沉淀。
83.将沉淀加入水中，再加入ph调节ph至7.0左右后加入沉淀质量10％的复合酶进行酶解。复合酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶以任意比混合的混合物。所述复合酶与胶原蛋白的质量比为5:100。酶解的温度为40℃，酶解的ph为7.0，酶解的时间为2h。
84.酶解结束后，将得到的胶原蛋白与弹性蛋白的混合物进行过滤，浓缩和干燥。
85.所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
86.将人疤痕皮肤剪去表皮和皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块，接种于培养瓶中，在50ml/l的co2孵育箱中赋予5h后加入含有100ml/l的小牛血清的dmem培养基，继续培养，每2d换液一次。待细胞长出后即为原代成纤维细胞。
87.将原代成纤维细胞继续培养至80％左右融合时，用pbs缓冲液清洗细胞3次，更换无血清培养基继续培养24h，收集上清液进行离心，过滤后取沉淀用含20ml/l的小牛血清的
dmem重悬细胞，按照1～3传代，得到第3代的成纤维细胞。
88.实施例2
89.本实施例提供了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括以下原料：
90.成纤维细胞液30份、胶原蛋白、积雪草提取物20份、弹性蛋白以及抗炎剂0.5份，通过碳酸钠溶液将复配液的ph调节至7.0。
91.本实施例中，成纤维细胞的含量为60mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为150mg/l。所述成纤维细胞液由质量比为50:0.05:10的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠组成，生长因子包括等质量的pdgf和ngf。
92.所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物，所述复配液中多酚的浓度为0.5g/l，抗生素的浓度为1.0g/l。
93.所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
94.将章鱼破碎，得到章鱼糜，加入15倍质量的水加热至28℃，混合得到浆液；
95.将所述浆液通过高速离心机进行4次的离心。前两次的以300g和2000g的离心力离心处理10min后弃去沉淀，再将上清液以10000的离心力离心30min后弃去沉淀，取上清液再以100000的离心力离心60min，收集沉淀。
96.将沉淀加入水中，再加入ph调节ph至7.0左右后加入沉淀质量5％的复合酶进行酶解。复合酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物。所述复合酶与胶原蛋白的质量比为1:100。酶解的温度为50℃，酶解的ph为7，酶解的时间为4h。
97.酶解结束后，将得到的胶原蛋白与弹性蛋白的混合物进行过滤，浓缩和干燥。
98.所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
99.将人疤痕皮肤剪去表皮和皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块，接种于培养瓶中，在50ml/l的co2孵育箱中赋予5h后加入含有100ml/l的小牛血清的dmem培养基，继续培养，每2d换液一次。待细胞长出后即为原代成纤维细胞。
100.将原代成纤维细胞继续培养至80％左右融合时，用pbs缓冲液清洗细胞2次，更换无血清培养基继续培养24h，收集上清液进行离心，过滤后取沉淀用含20ml/l的小牛血清的dmem重悬细胞，按照1～3传代，得到第5代的成纤维细胞。
101.实施例3
102.本实施例提供了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括以下原料：
103.成纤维细胞液32份、胶原蛋白、积雪草提取物12份、弹性蛋白以及抗炎剂0.1份，通过氢氧化钠溶液将所述复配液的ph值调节至8.0。
104.本实施例中，成纤维细胞的含量为75mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为100mg/l。所述成纤维细胞液由质量比为50:0.02:15的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠组成，生长因子包括等质量的fgf、pdgf和egf。
105.所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物，所述复配液中多酚的浓度为0.3g/l，抗生素的浓度为0.05g/l。
106.所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
107.将章鱼破碎，得到章鱼糜，加入5倍质量的水加热至30℃，混合得到浆液；
108.将所述浆液通过高速离心机进行4次的离心。前两次的以300g和2000g的离心力离
心处理10min后弃去沉淀，再将上清液以10000的离心力离心30min后弃去沉淀，取上清液再以100000的离心力离心60min，收集沉淀。
109.将沉淀加入水中，再加入ph调节ph至7.0左右后加入沉淀质量8％的复合酶进行酶解。复合酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物。所述复合酶与胶原蛋白的质量比为3:100。酶解的温度为45℃，酶解的ph为7.5，酶解的时间为3h。
110.酶解结束后，将得到的胶原蛋白与弹性蛋白的混合物进行过滤，浓缩和干燥。
111.所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
112.将人疤痕皮肤剪去表皮和皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块，接种于培养瓶中，在50ml/l的co2孵育箱中赋予5h后加入含有100ml/l的小牛血清的dmem培养基，继续培养，每2d换液一次。待细胞长出后即为原代成纤维细胞。
113.将原代成纤维细胞继续培养至70％左右融合时，用pbs缓冲液清洗细胞1次，更换无血清培养基继续培养24h，收集上清液进行离心，过滤后取沉淀用含20ml/l的小牛血清的dmem重悬细胞，按照1～3传代，得到第6代的成纤维细胞。
114.实施例4
115.本实施例提供了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括以下原料：
116.成纤维细胞液35份、胶原蛋白、积雪草提取物30份、弹性蛋白以及抗炎剂0.5份，通过碳酸钠溶液将复配液的ph调节至7.2。
117.本实施例中，成纤维细胞的含量为50mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为180mg/l。所述成纤维细胞液由质量比为50:0.01：10的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠组成，生长因子包括等质量的fgf、pdgf和ngf。
118.所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物。所述复配液中多酚的浓度为0.8g/l，抗生素的浓度为0.2g/l。
119.所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
120.将章鱼破碎，得到章鱼糜，加入12倍质量的水加热至26℃，混合得到浆液；
121.将所述浆液通过高速离心机进行4次的离心。前两次的以300g和2000g的离心力离心处理10min后弃去沉淀，再将上清液以10000的离心力离心30min后弃去沉淀，取上清液再以100000的离心力离心60min，收集沉淀。
122.将沉淀加入水中，再加入ph调节ph至7.0左右后加入沉淀质量7％的复合酶进行酶解。复合酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物。所述复合酶与胶原蛋白的质量比为5:100。酶解的温度为30℃，酶解的ph为7.2，酶解的时间为2h。
123.酶解结束后，将得到的胶原蛋白与弹性蛋白的混合物进行过滤，浓缩和干燥。
124.所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
125.将人疤痕皮肤剪去表皮和皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块，接种于培养瓶中，在50ml/l的co2孵育箱中赋予5h后加入含有100ml/l的小牛血清的dmem培养基，继续培养，每2d换液一次。待细胞长出后即为原代成纤维细胞。
126.将原代成纤维细胞继续培养至75％左右融合时，用pbs缓冲液清洗细胞3次，更换无血清培养基继续培养24h，收集上清液进行离心，过滤后取沉淀用含20ml/l的小牛血清的
dmem重悬细胞，按照1～3传代，得到第4代的成纤维细胞。
127.实施例5
128.本实施例提供了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，包括以下原料：
129.成纤维细胞液30份、胶原蛋白、积雪草提取物20份、弹性蛋白以及抗炎剂0.75份，通过碳酸氢钠溶液将复配液的ph值调节至7.0。
130.本实施例中，成纤维细胞的含量为68mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为200mg/l。所述成纤维细胞液由质量比为50:0.01:15的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠组成，生长因子包括等质量的fgf、pdgf、ngf、egf和tgf-α。
131.所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物。所述复配液中多酚的浓度为0.6g/l，抗生素的浓度为2g/l。
132.所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：
133.将章鱼破碎，得到章鱼糜，加入15倍质量的水加热至27℃，混合得到浆液；
134.将所述浆液通过高速离心机进行4次的离心。前两次的以300g和2000g的离心力离心处理10min后弃去沉淀，再将上清液以10000的离心力离心30min后弃去沉淀，取上清液再以100000的离心力离心60min，收集沉淀。
135.将沉淀加入水中，再加入ph调节ph至7.0左右后加入沉淀质量8％的复合酶进行酶解。复合酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶等质量混合的混合物。所述复合酶与胶原蛋白的质量比为3:100。酶解的温度为50℃，酶解的ph为7.5，酶解的时间为4h。
136.酶解结束后，将得到的胶原蛋白与弹性蛋白的混合物进行过滤，浓缩和干燥。
137.所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：
138.将人疤痕皮肤剪去表皮和皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块，接种于培养瓶中，在50ml/l的co2孵育箱中赋予5h后加入含有100ml/l的小牛血清的dmem培养基，继续培养，每2d换液一次。待细胞长出后即为原代成纤维细胞。
139.将原代成纤维细胞继续培养至80％左右融合时，用pbs缓冲液清洗细胞3次，更换无血清培养基继续培养24h，收集上清液进行离心，过滤后取沉淀用含20ml/l的小牛血清的dmem重悬细胞，按照1～3传代，得到第6代的成纤维细胞。
140.对比例1
141.本对比例与实施例1的区别仅在于，将所述成纤维细胞更换为常规市售的成纤维细胞。
142.对比例2
143.本对比例与实施例1的区别仅在于，抗炎剂仅采用抗生素溶液，不添加多酚溶液。
144.对比例3
145.本对比例与实施例1的区别仅在于，仅采用市售的胶原蛋白，不采用弹性蛋白。
146.试验例
147.大鼠皮肤创面愈合实验研究
148.(1)实验动物及分组：选取体重在300g左右的成年雄性大鼠，随机分为5组，每组10只大鼠。第一组为实验组，对应实施例1的产品，第二组为空白对照组，第三组、第四组和第五组为对照组，分别对应对比例1-3的产品。
149.(2)大鼠创面模型制备：大鼠麻醉后固定四肢，消毒后在背部距脊柱左侧1.5cm、距前肢根部3.0cm处做一直径5mm的圆形全层皮肤伤口，将成模当天记为第0d。
150.(3)实验方法：实验组每天在皮肤伤口处涂抹2ml本发明皮肤修复用胶原蛋白溶液，其中皮肤修复用胶原蛋白溶液的制备方法为：将1g的皮肤修复用胶原蛋白加入1l的蒸馏水中，混匀后即得；空白对照组每天涂抹2ml的蒸馏水。所有大鼠在常规条件下单笼饲养。每天同一时间清创换药，至创面有完整上皮覆盖。
151.(4)伤口愈合率测定：实验7d后，每天用游标卡尺测量创面大小(十字测量法)，创伤口面积按椭圆面积计算，并计算伤口愈合率。
152.伤口愈合率/％＝(原创创面面积-未愈合创面面积/原创创面面积)*100％；
153.s＝0.25abπ，a为伤口长轴长度，b为伤口短轴长度。
154.各组结果如表1所示，比较各组测试结果，通过统计学分析方法得p＜0.05，表明样本均数差别具有统计学意义。
155.表1
156.组别伤口愈合率实施例188.12％空白对照组40.92％对比例175.80％对比例260.74％对比例364.33％
157.由表1可知，本发明采用的组分制备出的复配液对胶原蛋白的重生和刺激性影响最高，可以快速促进组织胶原蛋白再生，极大得提高了胶原蛋白的含量。
158.以上所述仅是本技术的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本技术。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，包括成纤维细胞液、胶原蛋白、积雪草提取物、弹性蛋白、ph调节剂以及抗炎剂，所述成纤维细胞液由成纤维细胞与生长因子和海藻酸钠任意组合后得到；所述弹性蛋白和胶原蛋白由章鱼经过破碎、酶解、浓缩后制得；所述成纤维细胞由人疤痕皮肤进行原代培养后制得。2.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，所述皮肤用复配液中成纤维细胞的含量为50～80mmol/kg，所述胶原蛋白和弹性蛋白的总含量为10～200mg/l。3.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，以重量份计，包括成纤维细胞液30～35份、积雪草提取物10～30份、抗炎剂0.1～1.0份；所述ph调节剂调节所述皮肤用复配液的ph值为4.5～9.0。4.根据权利要求1或3所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，所述ph调节剂为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液，所述抗炎剂为多酚与抗生素溶液的混合物。5.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，所述弹性蛋白和胶原蛋白通过以下方法制备得到：将章鱼破碎，得到章鱼糜，与水加热混合后得到浆液；将所述浆液离心后收集沉淀，在所述沉淀中加入清水，得到匀浆液；将所述匀浆液加入复合酶依次进行酶解、过滤后浓缩干燥，制得含有胶原蛋白和弹性蛋白的混合物。6.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，所述成纤维细胞液由质量比为10～50:0.01～0.5:10～20的成纤维细胞、生长因子和海藻酸钠混合得到。7.根据权利要求1或6所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，所述成纤维细胞通过以下方法制备得到：将人疤痕皮肤破碎后，进行二氧化碳孵育，孵育后再置于含有小牛血清的dmem培养基中继续培育，得到原代成纤维细胞；将原代成纤维细胞继续培养后进行饥饿处理和重悬，进行传代培养后得到。8.根据权利要求1或6所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液，其特征在于，所述生长因子包括ngf、tgf-α、egf、fgf和pdgf中的至少一种。9.一种权利要求1～8任一项所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液的制备方法，其特征在于，将胶原蛋白、积雪草提取物、弹性蛋白以及抗炎剂混合均匀后，在搅拌状态下加入成纤维细胞液和ph调节剂调节ph后制得。10.根据权利要求9所述的基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液的制备方法，其特征在于，所述搅拌的温度为20～30℃。

技术总结
本发明公开了一种基于胶原蛋白修复的皮肤用复配液及其制备方法，属于微整形美容药物技术领域。本发明公开的复配液，包括成纤维细胞液、胶原蛋白、积雪草提取物、弹性蛋白、pH调节剂以及抗炎剂，所述成纤维细胞液由成纤维细胞与生长因子和海藻酸钠任意组合后得到；所述弹性蛋白和胶原蛋白由章鱼经过破碎、酶解、浓缩后制得；所述成纤维细胞由人疤痕皮肤进行原代培养后制得。本发明公开的复配液中成分相辅相成、吸收性高，各自之间的配合作用可以提高胶原蛋白的重生和分化，对衰老和起皱的、凹陷的皮肤均有较好的修复作用。的皮肤均有较好的修复作用。的皮肤均有较好的修复作用。


技术研发人员：佘亚东 曾凯 黄薪 冯清波 左晓霞
受保护的技术使用者：成都晶都医疗美容医院有限公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/9/9