黄曲霉角质酶、编码基因及应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及黄曲霉角质酶、编码基因及应用。


背景技术：

2.角质酶(ec 3.1.1.74)是一种α/β水解酶，属于丝氨酸酯酶，可以催化水解不溶性多聚体植物角质的酯键，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等，是一种多功能裂解酶。除了水解反应外，角质酶还能催化酸与醇的酯化，一些脂肪酸盐与醇的转酯化。最近，角质酶因其在食品、精细化工、制药和环境等各种工业领域的潜在应用而受到广泛关注。
3.角质酶的来源非常广泛，目前自然界中两个主要来源分别是植物的花粉中分离得到的以及各种微生物所分泌产生。其中微生物来源的角质酶主要包括真菌以及少部分的细菌。目前国内外针对真菌来源的角质酶的研究和报道较多，主要集中在镰刀菌属的fusarium solani pisi、fusarium oxysporum，曲霉菌属的aspergillus oryzae以及链核盘菌属的monilinia fructicola。
4.在白酒众多风味物质中，酯类物质所占比例最大，其含量和比重是决定白酒香型和品质的重要因素。研究表明，浓香型白酒主要采用固态发酵生产，以谷物为原料，发酵后的谷物含水量在53～58％之间，可识别为水相体系。然而在水相体系中，酶主要表现为水解酯的性质，是导致酯生产不稳定的原因之一。目前，虽然已有不少角质酶合成酯的报道，但是到目前为止，在水相中角质酶合成风味酯还有待挖掘。


技术实现要素：

5.针对水相中角质酶合成风味酯的研究较少的问题，本发明提供了一种黄曲霉(aspergillus flavus)角质酶、其编码基因及应用。所述黄曲霉角质酶在水相中高效合成丁酸乙酯和己酸乙酯的特性。本发明所述黄曲霉角质酶分别定义为黄曲霉角质酶aflacut-1、黄曲霉角质酶aflacut-2。
6.本发明首先提供黄曲霉(a.flavus)角质酶，其氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
7.黄曲霉角质酶aflacut-1的氨基酸序列seq id no.1：
8.mhlrnivialaatavaspvdlqdrqltggdelrdgpckpitfifarastepgllgistgpavcnrlklarsgdvacqgvgprytadlpsnalpegtsqaaiaeaqelfeqavskcpdtqivaggysqgtavmngaikrlsadvqdkikgvvlfgytrnaqergqianfpkdkvkvycavgdlvclgtlivapphfsylsdtgdasdlllsqlg。
9.黄曲霉角质酶aflacut-2的氨基酸序列seq id no.2：
10.mhlaikslfvsllgasvlasplpsnalvernaplneflsallshlpaidgtidavsgvitdfdqlladltgarttqngyigvctdytvlfargtsepgnvgvlvgpplseafeqavgakalsfqgvngynadvagylaggdaagsksmaslasevlskcpdtklvmsgysqgcqivhnaveqlpaadaskissvllfgdpyagkafpnvdasrvhtvchagdticnnsvvilpphltyavdvtgavqfavaaan。
11.本发明还提供了编码所述黄曲霉角质酶的编码基因，如seq id no.3或seq id no.4所示。
12.黄曲霉角质酶aflacut-1的编码基因seq id no.3：
13.atgcatctccgcaacatagtcattgcactggctgcgactgcagtggcaagcccggtggacctccaggaccgccaattgactggtggggatgagctgcgggatggcccttgcaagcccattacgtttatctttgcccgggcttccacggagccaggccttctgggcatttcaacgggccctgcggtctgcaatcggttgaagttggctagatcaggcgatgttgcctgccagggtgtaggacccagatatacggcggatctcccatcaaatgctctgccagagggaacatcccaagctgccattgcagaggcacaagaactgtttgaacaagctgtttccaagtgccccgacacgcagatcgttgccgggggttacagccaaggaacagctgtcatgaatggggctattaagcgcctttccgcagatgtgcaggacaagatcaaaggcgttgtactgttcgggtacacacgcaacgctcaagagagaggccagattgccaactttcccaaagataaagtcaaggtctattgcgccgtgggagatcttgtctgcctgggaacactgattgtggcaccgccgcacttctcatacctttctgatactggtgatgccagcgatctccttctatcccagctgggataa。
14.黄曲霉角质酶aflacut-2的编码基因seq id no.4：
15.atgcatcttgctatcaagtctctctttgtttctctcctcggagccagcgttctcgcaagccctcttcccagcaatgctctggttgagagaaacgctcccctgaatgagttcctcagcgctcttctgtcgcatctgcctgccatcgatggcaccatcgacgcggtgtcgggtgtgatcaccgattttgatcaattgctcgccgacctcactggtgctcgaaccacgcaaaatgggtatattggtgtctgcacggactacaccgttctcttcgcccgcggaaccagtgagcccggaaacgtcggtgtccttgttggacctcctctttccgaagcttttgagcaagccgtcggtgcgaaagccttgagcttccagggcgtcaacggctataacgcagatgtcgcgggttatttggctggaggtgacgctgccggtagcaagtcaatggcatccctggccagcgaagttctctccaagtgtcctgacactaagctcgtcatgagcggctactctcagggttgccagattgttcacaacgccgttgagcagctccctgccgcagacgctagcaagatcagcagcgtcctcctcttcggagacccatacgcgggcaaggccttccccaacgttgatgcttcccgtgtgcacactgtgtgccacgccggagatactatttgcaacaacagcgtcgttatcctgccccctcacctgacctacgctgttgatgtgactggcgcggttcaatttgctgttgcggctgcgaactaa。
16.本发明还提供了上述黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成丁酸乙酯和/或己酸乙酯的应用。
17.本发明还提供了上述黄曲霉角质酶在制备含丁酸乙酯和/或己酸乙酯的酒用酯香液或白酒中的应用。
18.其中，所述应用中，黄曲霉角质酶是通过构建含有所述黄曲霉角质酶编码基因的大肠杆菌重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得。
19.优选地，所述大肠杆菌为pet32(a)表达载体。
20.其中，所述应用中，黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成丁酸乙酯和/或己酸乙酯的酯化温度为30℃，ph为4.0。
21.其中，所述应用中，黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成丁酸乙酯的时间为24h，酸醇比为2:100。
22.其中，所述应用中，黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成己酸乙酯的时间为18h，酸醇比为5:100。
23.有益效果：本发明利用生物基因工程技术，克隆并诱导表达获得黄曲霉角质酶aflacut-1和aflacut-2及其编码基因，并构建含有所述黄曲霉角质酶编码基因的大肠杆菌
表达质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得该酶。与现有技术相比，本发明的黄曲霉角质酶经催化体系验证具有在水相体系催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯的特性，其在30℃，ph为4.0时，丁酸乙酯和己酸乙酯的相对转化率达到最高，且可以通过调节反应体系中温度、ph、反应时间等参数实现己酸乙酯的靶向合成。丁酸乙酯和己酸乙酯是白酒酿造领域重要的风味成分，因此，本发明所述的黄曲霉角质酶在白酒酿造领域具有潜在的应用前景。
附图说明
24.图1为黄曲霉角质酶aflacut-1和aflacut-2的编码基因pcr扩增结果：m：dna分子量标准，泳道1：黄曲霉角质酶aflacut-2核酸条带；泳道2：黄曲霉角质酶aflacut-1核酸条带；
25.图2为黄曲霉角质酶的纯化电泳图(m：低分子量标准蛋白；1：空质粒2：aflacut-1；3：aflacut-2)；
26.图3为黄曲霉角质酶aflacut-1和aflacut-2在水相中催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯含量测定图；
27.图4为黄曲霉角质酶aflacut-2的最适反应温度和最适反应ph测定曲线图；
28.图5为黄曲霉角质酶aflacut-2催化合成丁酸乙酯的最适反应时间和最佳酸醇摩尔比测定曲线图；
29.图6为黄曲霉角质酶aflacut-2催化合成己酸乙酯的最适反应时间和最佳酸醇摩尔比测定曲线图。
具体实施方式
30.本发明目的在于提供一种真菌角质酶，其来源于黄曲霉，具有在水相中高效合成丁酸乙酯和己酸乙酯的特性。
31.本发明首先提供黄曲霉(a.flavus)角质酶aflacut-1和aflacut-2，其氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
32.本发明还提供了编码上述黄曲霉角质酶aflacut-1和aflacut-2的编码基因，分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
33.本发明还提供了重组载体，其含有上述黄曲霉角质酶的编码基因；其中，所述重组载体选自昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。在本发明的一种优选实施方式中，所述重组载体是在基础质粒pet32(a)的多克隆位点插入seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列。
34.本发明还提供了重组细胞，其含有上述重组载体。其中，所述重组细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供了含有所述重组细胞的重组菌，其是通过将上述重组载体导入宿主细胞所得到，其中所述宿主细胞是bl21(de3)。
35.本发明还提供了所述黄曲霉角质酶的制备方法，其包括以下步骤：构建含有上述黄曲霉角质酶的编码基因的重组质粒，转化至宿主细胞中，进行目的蛋白的诱导表达，纯化，即得。
taq酶。pcr反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火，1min，72℃延伸，1min，72℃终延伸，10min。pcr扩增结束，产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
60.检测正确后，利用dna纯化/琼脂糖凝胶回收试剂盒(湖南艾科瑞生物科技有限公司的steadypure pcr反应液纯化试剂盒)进行产物纯化回收。
61.将上述纯化产物，用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切，与经过同样酶切的pet-32(a)载体连接，转化至e.coli dh5α，在含有氨苄抗生素(100mg/ml)的lb平板上筛选阳性转化子。所述lb平板培养基成分为：10g/l氯化钠，10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸粉，100μg/ml氨苄青霉素。
62.提取阳性转化子的质粒，送去金唯智公司测序，将测序结果与目的基因的序列比对，比对无误即得到正确的重组质粒。
63.将上述正确的重组质粒转化至宿主e.coli.bl21(de3)感受态细胞中，从平板上挑选阳性转化子，将含有该载体的阳性转化子命名为bl21(de3)/pet-32(a)-cut，重组菌构建成功。
64.二、角质酶的表达
65.将重组菌bl21(de3)/pet-32(a)-cut于5ml含氨苄抗生素的lb液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。所述液体lb培养基成分为：10g/l氯化钠，10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸粉，100μg/ml氨苄青霉素。
66.种子液按2％(v/v)转接至50ml含氨苄青霉素的液体lb培养基中，37℃，200rpm培养至od
600
为0.6～0.8左右，加入iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)至终浓度0.1mm。
67.上述培养基加完iptg后，在16℃，180rpm低温诱导20h，诱导结束离心(4℃，6000rpm，10min)收集菌体，用适量的100mm tris-hcl(ph 8.0)缓冲液把菌体悬浮再离心，收集菌体。
68.上述收集菌体中再加入20ml100 mm tris-hcl(ph 8.0)缓冲液重悬菌体，菌悬液置于冰水混合物中用超声波破碎仪破碎细胞(破碎功率30％，工作程序为超声2s，停顿3s，破碎20～30min)。
69.将破碎后的菌液于4℃，8000rpm离心20min，将上清液倒入无菌离心管中，即为粗酶液；管中的沉淀重悬于tris-hcl缓冲液中。
70.分别取上述破碎后离心上清和离心沉淀，做sds-page分析，检测目的蛋白是否为可溶性表达。
71.三、角质酶纯化与sds-page鉴定
72.基于pet-32(a)质粒中有编码his-tag标签蛋白的序列，选择ni柱进行纯化重组蛋白。在蛋白上样后(即粗酶液)，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合在柱子上，其它的杂蛋白流出。ni柱中的硫酸镍还可以和咪唑结合，这时候再用咪唑洗脱，咪唑便竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱下来，收集流出液便是所要的目的蛋白。具体步骤如下：
73.(1)用10ml去离子水洗掉柱子里的乙醇。
74.(2)加入10倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱。
75.(3)将粗酶液与镍柱中的镍与磁力搅拌器上混合40min，收集流出液体为穿出样品，未结合在柱上的的蛋白会在此时穿出。
76.(4)加入10倍柱体积结合缓冲液再次平衡镍柱，一些结合能力弱的杂蛋白会在此时被洗脱下来。
77.(5)用不同浓度的咪唑(60mm、80mm、100mm、200mm、400mm)进行梯度洗脱。
78.(6)用10倍柱体积的洗脱缓冲液将目标蛋白彻底从镍柱上洗脱下来。
79.(7)最后加入5～10倍柱体积的20％的乙醇封存镍柱，于4℃保存。
80.(8)将纯化时每一步收集的液体进行制备sds-page样品并跑胶检测蛋白最佳的洗脱条件以及洗脱纯度。最终确定咪唑浓度200mm为最适洗脱浓度，收集该浓度的流出液，此为纯酶液。
81.将上述纯酶液进行sds-page电泳。结果如图2所示，其中，列m为低分子量标准蛋白质marker；泳道3为蛋白aflacut-2的纯酶液；结果表明，成功得到重组蛋白。
82.四、重组蛋白超滤浓缩
83.对已纯化好的蛋白使用超滤管除掉咪唑和盐离子。具体步骤如下：
84.(1)全新的超滤管是干燥状态的，使用前加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或冰箱预冷几分钟，然后将水倒掉。
85.(2)倒入蛋白液，4℃，4000rpm开始离心。
86.(3)当浓缩至1～2ml时，继续加入剩下的蛋白液，直至所有的浓缩液都加完为止。
87.(4)加入新的置换缓冲液(20mm tris-hcl，ph 8.0)，反复置换使蛋白液最终的咪唑浓度和盐浓度降至20mm左右。
88.(5)咪唑浓度和盐浓度降至20mm左右后，取出蛋白液，即为最终纯酶液。
89.实施例2角质酶aflacut-1和aflacut-2在水相中催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯含量的检测
90.角质酶酯化力测定方法：水相酯化体系包含100μl酶液，终浓度各10mm的混合有机酸(丁酸、己酸)以及终浓度为1m的无水乙醇，加入到柠檬酸缓冲液中(50mm，ph 4.0)至终体积为1ml。以不加酶液的反应体系为对照。将上述混合反应液在30℃温度下，以150rpm的转速搅拌24h。此后向反应混合物中加入1ml正己烷进行萃取，剧烈涡旋30s，12000rpm离心5min，将上层即正己烷层过滤后进行气相色谱分析。
91.气相色谱检测条件：色谱柱agilent hp-innowax(30m
×
320μm
×
0.25μm)，载气为高纯氮气(》99.999％)；柱流速为0.8ml/min；检测器温度150℃；进样口温度200℃；程序升温：起始温度50℃，保持8min，以5℃/min升至150℃，保持15min；进样体积为1μl；分流进样，分流比为10:1。
92.如图3所示，与对照相比，aflacut-1催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯的能力较弱，而aflacut-2可在水相中催化合成68.15mg/l丁酸乙酯和715.3mg/l己酸乙酯。此外，aflacut-2在水相条件下对不同短链脂肪酸的催化能力差异较大，这暗示着其对底物具有明显的偏好性，有利于定向调控风味酯的合成。综上所述，选择角质酶aflacut-2作为后续的研究对象。
93.实施例3温度和ph对角质酶aflacut-2在水相中合成风味酯的影响
94.一、角质酶催化生产风味酯的最佳温度测定
95.根据上述酯化力测定方法，催化体系中其他条件不变，只考察在不同温度下(20℃；30℃；40℃；50℃)，角质酶在体系中催化丁酸乙酯和己酸乙酯的含量。在酶促反应条件下，1min内生成1μmol丁酸乙酯或己酸乙酯所需的酶量定义为1个酶活力单位(u)。根据产物与外标峰面积之比计算产物的含量。以最高酶活力定义为100％计算相对酶活力。其结果如
图4-a所示。
96.结果由图4-a显示，角质酶生产风味酯的最佳催化温度为30℃。值得注意的是，当温度达到40℃时，以丁酸为底物，角质酶aflacut-2酶活显著降低，相对酶活力仅为30℃酶活力的35.1％，但以已酸为底物时，相对酶活力为88.9％，仅下降了11.1％。由此推断，可以通过调节酯化反应温度来实现特定短链脂肪酸酯的合成，进而实现风味酯的定向调控，对提升基酒品质具有重要的应用价值。
97.二、角质酶催化生产风味酯的最佳ph测定
98.根据上述酯化力测定方法，催化体系中其他条件不变，加入不同ph的50mm柠檬酸缓冲液(ph 2.0-5.0)，使角质酶在不同ph条件下催化丁酸乙酯和己酸乙酯的含量。以最高酶活力定义为100％计算相对酶活力。其结果如图4-b所示。
99.结果由图4-b显示，角质酶生产风味酯的最佳ph为4.0。
100.以上结果证实，本发明构建的黄曲霉角质酶具有在水相体系中高效催化丁酸乙酯和己酸乙酯的能力；其最适酯化温度为30℃，最适酯化ph为4.0。值得注意的是，与合成丁酸乙酯相比，该角质酶在催化合成己酸乙酯时具有更为宽泛的ph适应性，由此可以推测可以通过调控反应体系中ph从而实现特异性合成己酸乙酯。
101.实施例4角质酶aflacut-2催化合成酯条件的优化
102.为进一步优化反应体系，通过测定角质酶aflacut-2在水相中催化丁酸和乙醇生成丁酸乙酯的含量，确定反应的最佳时间和最佳酸醇比。以24h时的酶活力定为100％，其它条件下的酶活为相对酶活力。图5-a表明角质酶aflacut-2催化合成丁酸乙酯的最佳反应时间为24h；以酸醇摩尔比为1:100时的酶活为100％，图5-b表明随着酸浓度的升高，相对酶活力升高，当酸与醇的比例为2:100时，相对酶活力达到最高，之后随着酸浓度的升高，酶活力降低。因此，过多的丁酸可能会使反应体系的ph降低，导致酶的构象发生变化，从而影响角质酶aflacut-2的催化活性。
103.通过测定角质酶aflacut-2在水相中催化己酸和乙醇生成己酸乙酯的含量，确定反应的最佳时间和最佳酸醇比。以24h时的酶活力为100％，其它条件下的酶活为相对酶活，从图6-a可知角质酶aflacut-2催化合成己酸乙酯的最佳反应时间为18h，相对酶活力达到151.23％，这意味着通过控制酯化反应时间可以调控混酸条件下风味酯合成的比例。以酸醇摩尔比为1:100时的酶活力为100％，从图6-b中可知随着酸浓度的升高，相对酶活力升高，当酸醇摩尔比为5:100时，相对酶活力最高，说明增加己酸的浓度有利于角质酶aflacut-2催化合成己酸，该酶对己酸的耐受性优于丁酸。
104.需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

技术特征：
1.黄曲霉(a.flavus)角质酶，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的黄曲霉角质酶，其特征在于：所述角质酶的编码基因分别如seq id no.3或seq id no.4所示。3.权利要求1或2所述的黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成丁酸乙酯和/或己酸乙酯的应用。4.权利要求1或2所述的黄曲霉角质酶在制备含丁酸乙酯和/或己酸乙酯的酒用酯香液或白酒中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述黄曲霉角质酶是通过构建含有所述黄曲霉角质酶编码基因的大肠杆菌重组质粒，再将重组质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得。6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成丁酸乙酯和/或己酸乙酯的酯化温度为30℃，ph为4.0。7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成丁酸乙酯的时间为24h，酸醇摩尔比为2:100。8.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：黄曲霉角质酶在水相体系中催化合成己酸乙酯的时间为18h，酸醇摩尔比为5:100。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及黄曲霉角质酶、编码基因及应用。针对水相中角质酶合成风味酯的研究较少的问题，本发明提供了一种黄曲霉角质酶、编码基因及应用。本发明利用生物基因工程技术，获得黄曲霉角质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明的角质酶在水相体系能催化合成丁酸乙酯和己酸乙酯，其在30℃，pH为4.0时，丁酸乙酯和己酸乙酯的相对转化率达到最高，且可以通过调节反应体系中温度、pH、反应时间等参数实现己酸乙酯的靶向合成。因此，本发明所述的角质酶在白酒酿造领域产风味酯方面具有潜在的应用前景。酒酿造领域产风味酯方面具有潜在的应用前景。酒酿造领域产风味酯方面具有潜在的应用前景。


技术研发人员：张翠英 郑佳 林良才 王洪 肖冬婷 赵东 梁梦帆
受保护的技术使用者：宜宾五粮液股份有限公司
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/24