桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是一种常见的消化道恶性肿瘤，其包括结肠癌和直肠癌，是一种多步骤、多因素复杂作用的疾病。世界卫生组织(who)国际癌症研究机构(iarc)于2020年最新发布的全球癌症负担数据显示，结直肠癌已成为全球第三大常见癌症和第二大常见癌症死亡原因。早期结直肠癌缺乏典型的临床表现和体征，诊断困难。目前绝大多数患者就诊时已处于中晚期，导致结直肠癌患者手术治疗后预后差异较大。现有证据显示，肿瘤细胞中胆固醇代谢异常活跃，对肿瘤的发生发展起到重要作用。比如，胆固醇可通过激活pi3k/akt信号通路来刺激结直肠癌。胆固醇生物合成途径中的其他几种酶在各种肿瘤中广泛高表达。例如，3-羟基-3-甲基戊二酰-coa合成酶1(hmgcs1)在不同的肿瘤类型中表达上调，以代谢和非代谢方式促进肿瘤进展。此外，一项研究利用癌症基因组学生物门户网站分析了癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,tcga)队列中胆固醇合成基因的基因拷贝数或表达，结果表明角鲨烯环氧酶(sqle)是许多肿瘤中上调最显著的基因之一。越来越多的证据表明，在各种肿瘤中，sqle的过度表达与预后不良呈正相关。例如，sqle的mrna和蛋白表达在结直肠癌中上调(p《0.01)，并预测结直肠癌患者的生存率低。
3.桑白皮是桑树的根皮，最早记载于公元前1世纪的中草药古籍《神农本草经》。现代药理学研究结果表明，桑白皮主要具有降糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心脏等作用。桑白皮中黄酮类化合物种类最多，含量最高，是桑白皮发挥药效作用的主要成分。桑根皮醇(morusinol)是从桑白皮中提取的一种黄酮类活性物质。1977年，c konno等人以桑树的根皮为原料进行冷甲醇提取，并用乙醚和水分离得到提取物。其中，乙醚可溶物分为酸性部分、中性部分和碱性部分，通过硅胶层析酸性部分得到一种黄色结晶物质，命名为桑根皮醇。目前针对桑根皮醇的研究较少，现已证明桑根皮醇具有抗炎性、抗菌性、抗肿瘤和抗血小板活性。然而，未有报道桑根皮醇干扰肿瘤细胞胆固醇生物合成，以及也未有报道桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用，为癌症临床治疗提供了新的药物。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.1、桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用。
7.2、桑根皮醇在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
8.本发明优选的，桑根皮醇在制备降低结直肠癌细胞中总胆固醇水平的药物中的应用。
9.本发明优选的，桑根皮醇在制备抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径的主要转录调控因子srebf2表达的药物中的应用。
10.本发明优选的，桑根皮醇在制备抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径中hmgcs1、hmgcr、mvk、idi1、fdps、ggpps、sqle、lss、dhcr24和dhcr7的mrna表达的药物中的应用。
11.本发明优选的，桑根皮醇在制备抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径中hmgcr、sqle的蛋白表达的药物中的应用。
12.本发明的有益效果在于：本发明首次公开了桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用，通过降低结直肠癌细胞总胆固醇水平、抑制srebf2和胆固醇生物合成途径中多种酶的表达，进而抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成。本发明的实施拓宽了桑根皮醇的医药用途，并作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用，对临床治疗具有重要意义。
附图说明
13.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
14.图1为总胆固醇(tc)检测试剂盒检测桑根皮醇处理后结直肠癌细胞总胆固醇水平的结果(hct116、hct15、sw620、sw480、lovo均为人结直肠癌细胞系)；
15.图2为实时荧光定量pcr(rt-qpcr)实验检测桑根皮醇处理后结直肠癌细胞srebf2的mrna表达水平；
16.图3为实时荧光定量pcr(rt-qpcr)实验检测桑根皮醇处理后结直肠癌细胞hmgcs1、hmgcr、mvk、idi1、fdps、ggpps、sqle、lss、dhcr24和dhcr7的mrna表达；；
17.图4为免疫印迹实验检测桑根皮醇处理后结直肠癌细胞srebf2、hmgcs1、hmgcr、sqle的蛋白表达水平；
18.图5为mtt法检测外源补充胆固醇对桑根皮醇处理后结直肠癌细胞活力；
具体实施方式
19.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
20.实施例1、桑根皮醇对结直肠癌细胞总胆固醇水平的影响
21.桑根皮醇(货号:62949-93-3)购自成都乐美天医药科技有限公司，以二甲基亚砜(dmso)溶解为100mm的母液，储存于-80℃冰箱备用。将结直肠癌细胞系hct116培养于含10％的胎牛血清(fbs)的mccoy's 5a培养基中，hct15、sw620、lovo培养于含10％的fbs的rpmi-1640培养基中，sw480培养于含10％的fbs的dmem培养基中，并加入1％的青霉素/链霉素(p/s)。待细胞生长密度达到80-90％时，将细胞分盘处理，待细胞贴壁后，加入20μm的桑根皮醇处理结直肠癌细胞细系hct116、hct15、sw620、sw480、lovo，同时设置加入等量dmso的对照组，然后利用总胆固醇(tc)检测试剂盒(cod-pap单试剂微板法；购自北京雷根生物技术有限公司，货号：tc1211)检测结直肠癌细胞总胆固醇水平。具体方法如下：
22.(1)倒置显微镜观察细胞生长状态，当细胞生长至80％-90％左右时，应及时进行细胞传代。首先用真空过滤泵吸除培养皿中旧的培养液，加入5ml1
×
磷酸盐缓冲液(pbs)洗
涤细胞，清除残留的血清和培养液；
23.(2)吸除pbs，加入1ml胰蛋白酶，置于37℃co2恒温培养箱使其充分消化；
24.(3)可轻拍培养皿使细胞消化更充分，然后显微镜下观察细胞脱落后，及时加入2ml完全培养基终止消化；移液枪轻轻吹打细胞悬液，之后转移至5ml离心管；设置离心机参数为700rpm、5min，进行离心；
25.(4)配平离心后，小心吸掉上清，再加入3ml完全培养基重悬；之后在显微镜下通过血球计数板对细胞悬液进行计数，并计算每微升细胞悬液的细胞数；
26.(5)每组取106个左右的细胞，1000g离心10min，弃上清，留取沉淀；
27.(6)用pbs清洗2次，1000g离心10min，弃上清，留取沉淀；
28.(7)加入300μl的pbs，冰浴条件下超声破碎细胞，功率300w，每次5s，间隔30s，重复5次，制备好的匀浆液不可离心；
29.(8)根据总胆固醇(tc)检测试剂盒(cod-pap双试剂微板法)说明书所提供的体系在相对应的96孔板加入试剂，充分混匀，37℃烘箱中孵育5min；
[0030][0031]
(9)立即用酶标仪在510nm测定吸光度值(od值)，以空白孔调零，检测标准孔、测定孔的od值，分别记为a标准、a测定；
[0032]
(10)根据说明书提供的计算公式算出对照组和实验组的细胞总胆固醇水平。使用microsoft excel和graph pad prism 8.0软件对数据进行处理和分析。
[0033]
结果如图1所示，用含有20μm的桑根皮醇的培养液培养结直肠癌细胞系hct116、hct15、sw620、sw480、lovo，检测处理48h后结直肠癌细胞总胆固醇水平。桑根皮醇处理后多种结直肠癌细胞系的细胞总胆固醇水平显著降低。结果表明，桑根皮醇可以显著降低结直肠癌细胞总胆固醇水平。
[0034]
实施例2、桑根皮醇对结直肠癌细胞srebf2的mrna表达的影响
[0035]
(1)引物设计
[0036]
在ncbi上查找actb和srebf2(固醇调节因子结合蛋白2)的基因序列，直接在ncbi上查找或设计引物。引物由华大基因合成，主要引物详细信息如下。
[0037][0038]
(2)rna提取
[0039]
①
当观察60mm培养皿中的hct116和hct15细胞生长密度达到40％-50％时，分别加入终浓度20μm桑根皮醇处理48h；
[0040]
②
处理结束后吸除旧的培养基，每盘细胞加入1ml预冷的trizol，使用微量移液枪进行吹洗后，将样品转移到1.5ml离心管中；将样品置于冰上静置30min，以确保其充分裂解；
[0041]
③
12000rpm，4℃离心10min；
[0042]
④
每个样品加入200μl氯仿，之后旋涡振荡15s，冰上静置3min,12000rpm/4℃离心10min；
[0043]
⑤
小心吸取上层水相转移至干净的离心管，加入500μl异丙醇，充分混匀，12000rpm/4℃离心10min，倒掉上清；
[0044]
⑥
将1ml75％乙醇加入样品中洗涤沉淀，12000rpm/4℃离心5min，倒掉上清，室温干燥5min；
[0045]
⑦
每个样品加入30-40μl rnase-free ddh2o，充分溶解rna，上机检测rna浓度；提取的rna溶液可放置于-80℃冰箱保存或用于后续实验。
[0046]
(3)cdna制备
[0047]
①
在不含rnase的离心管中配制以下体系，用微量移液枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2min，目的是为了除去残留基因组的dna：
[0048][0049]
②
逆转录反应体系配制(20μl体系)
[0050]
在第1步的反应管中直接加入ⅱsupermix plus，用微量移液器轻轻吹打混匀；第1步的反应液15μl
[0051]ⅱsupermix plus 5μl
[0052]
③
逆转录程序设置
[0053][0054]
反转录后的cdna可用于后续的荧光实时定量pcr，或者放置于-80℃保存。
[0055]
(4)加入rnase-free h2o将cdna稀释10倍，用于定量检测；
[0056]
(5)按如下的体系(总体积20μl)进行配制并加入定量板中：
[0057][0058]
(6)上机检测，程序设定为45个循环；运行结束后，拷贝数据后以actb作为参考，运用相对定量方法2
—
△△
ct
对数据进行分析。
[0059]
结果如图2所示，rt-qpcr实验结果显示，用含有20μm的桑根皮醇处理结直肠癌细胞系hct116和hct15细胞48h后，与dmso对照组相比，结直肠癌细胞srebf2的mrna表达水平降低。结果表明，桑根皮醇抑制结直肠癌细胞srebf2的mrna表达水平。
[0060]
实施例3、桑根皮醇对结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径多种酶表达的影响
[0061]
(1)引物设计
[0062]
在ncbi上查找actb、hmgcs1、hmgcr、mvk、idi1、fdps、ggpps、sqle、lss、dhcr24和dhcr7的基因序列，直接在ncbi上查找或设计引物。引物由华大基因合成，主要引物详细信息如下。
[0063][0064]
rt-qpcr实验同实施例2，结果如图3所示。rt-qpcr实验结果表明，20μm的桑根皮醇处理结直肠癌hct116和hct15细胞48h后，桑根皮醇显著抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径多种酶(hmgcs1、hmgcr、mvk、idi1、fdps、ggpps、sqle、lss、dhcr24和dhcr7)的mrna表达水平。
[0065]
实施例4、桑根皮醇对结直肠癌细胞srebf2和胆固醇生物合成途径多种酶蛋白水平表达的影响
[0066]
进一步在蛋白水平证明桑根皮醇干扰结直肠癌细胞胆固醇生物合成，具体如下：
[0067]
(1)蛋白样品制备
[0068]
①
当hct116和hct15细胞在培养皿中生长密度达到40-50％，对细胞进行加药处理，将10、20、30μm桑根皮醇加到培养基中，充分摇匀；吸除以前的培养基，换液即可完成加药处理；
[0069]
②
处理48h后，使用细胞刮刀将细胞刮下，收集细胞悬液。在4℃1200rpm/5min离心后弃掉上清。之后加入2mlpbs再次离心弃掉上清；
[0070]
③
配制细胞裂解液，按照100：1：1的比例加入ripa、pmsf和磷酸酶抑制剂，混匀后加入细胞沉淀中，用移液枪吹打均匀，置于冰上裂解1小时；
[0071]
④
用bca蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白的浓度，加入适量的sds-page上样缓冲液和蒸馏水，于100℃水浴锅中进行蛋白变性，分装蛋白样品，保存于-80℃；
[0072]
(2)蛋白样品上样和电泳
[0073]
①
按实验计划向不同密度的sds-page胶中加入蛋白样品，10μl/孔，同时加入3.5μl彩色预染蛋白质分子量标准液；
[0074]
②
将制备好的蛋白胶的梳子拔掉，放于电泳槽中，在样孔中加入蛋白marker和蛋白样品。倒入sds-page电泳液，插上电极进行蛋白分离；
[0075]
③
转膜：在转膜盒中按照滤纸-pvdf膜-蛋白胶-滤纸从下至上放置，加入适量的转膜缓冲液，转膜程序：25v，1.0ma，30min；
[0076]
④
封闭：转膜完成后用5％ bsa于摇床上室温孵育2h；
[0077]
⑤
切膜：将pvdf膜用1
×
tbst洗膜缓冲液洗涤3
×
5min，以清除pvdf膜上残留的bsa，根据检测的目的蛋白分子量进行切膜；
[0078]
⑥
一抗孵育：用待检测的多种目的抗体包括抗人hmgcr重组兔单克隆抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司，货号：bsm-52822r)、抗人sqle兔多克隆抗体(购自武汉三鹰生物技术有限公司，货号：12544-1-ap)、抗人srebf2兔多克隆抗体(购自武汉三鹰生物技术有限公司，货号：28212-1-ap)分别于4℃过夜孵育pvdf膜；次日回收一抗用1
×
tbst洗膜缓冲液洗涤3
×
5min；
[0079]
⑦
二抗孵育：按照一抗属性加入二抗工作液，室温孵育2h；
[0080]
⑧
清除二抗工作液，用1
×
tbst洗膜缓冲液洗涤3
×
10min；
[0081]
⑨
曝光检测：运用上海勤翔曝光仪检测蛋白样品的表达情况，并拍照取证，结果如图4所示。
[0082]
我们检测不同浓度的桑根皮醇处理后结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径主要转录调控因子srebf2以及胆固醇生物合成的主要限速酶hmgcr和sqle的蛋白表达水平。免疫印迹结果显示，桑根皮醇处理结直肠癌细胞hct116和hct15细胞48h后，dmso作为对照，srebf2、hmgcr和sqle的蛋白表达均以浓度依赖性的方式下降。综上所述，桑根皮醇显著下调结直肠癌细胞srebf2、hmgcr和sqle的蛋白表达水平。
[0083]
实施例5、外源补充胆固醇对桑根皮醇处理后结直肠癌细胞活力的影响
[0084]
(1)当hct116和hct15细胞在培养皿中生长密度达到80-90％，进行细胞消化；
[0085]
(2)离心后，轻轻吸掉上清，加入3ml完全培养基重悬细胞。接下来，使用血球计数板计算每微升细胞悬液的细胞数；
[0086]
(3)将细胞悬液按照每孔10000个细胞的比例加入到24孔板中，每孔加入500μl完全培养基。然后将板置于37℃co2恒温培养箱进行培养，在细胞完全附着于孔壁后，进行下一步的药物处理；
[0087]
(4)待细胞贴壁后，分别加入桑根皮醇(终浓度为20μm)、法尼基焦磷酸(fpp,终浓度为20μm)、香叶基香叶基焦磷酸(ggpp,终浓度为20μm)、胆固醇(cholesterol,终浓度为20μm)，以及桑根皮醇与法尼基焦磷酸、香叶基香叶基焦磷酸和胆固醇联合处理。对照组为dmso，每组重复三个孔。之后置于37℃co2恒温培养箱孵育48h；
[0088]
(5)桑根皮醇处理48h后，每孔加入50μl mtt，之后在37℃co2恒温培养箱孵育3h；
[0089]
(6)小心地弃除培养基，每孔加入500μl dmso，轻轻吹打溶液，使甲瓒结晶充分溶解，560nm检测od值；
[0090]
(7)使用microsoft excel和graph pad prism 8.0软件对数据进行处理，计算细胞活力。结果如图5所示。
[0091]
本实施例中，我们添加了胆固醇生物合成途径中间产物法尼基焦磷酸(fpp)和香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)以及终产物胆固醇(cholesterol)。结果表明，添加胆固醇，而不是fpp和ggpp，恢复了桑根皮醇处理后结直肠癌的细胞活力。结果表明，在hct116和hct15细胞中由桑根皮醇处理后结直肠癌细胞活力下降是由胆固醇耗竭引起的。
[0092]
针对以上数据显示，桑根皮醇抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成，从而降低细胞总胆固醇水平。因此，桑根皮醇可靶向肿瘤胆固醇生物合成，作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用，为桑根皮醇提供了新的医药用途，也为桑根皮醇临床治疗应用提供了新的理论支持。
[0093]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用。2.桑根皮醇在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，桑根皮醇在制备降低结直肠癌细胞中总胆固醇水平的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，桑根皮醇在制备抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径的主要转录调控因子srebf2表达的药物中的应用。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，桑根皮醇在制备抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径中hmgcs1、hmgcr、mvk、idi1、fdps、ggpps、sqle、lss、dhcr24和dhcr7的mrna表达的药物中的应用。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，桑根皮醇在制备抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成途径中hmgcr、sqle的蛋白的表达的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了桑根皮醇作为一种降胆固醇小分子抑制剂的应用，经实验发现桑根皮醇能够抑制结直肠癌细胞胆固醇生物合成能力、显著降低结直肠癌细胞的总胆固醇水平，显著下调控制胆固醇生物合成基因转录的主要转录因子SREBF2的mRNA表达，以及显著下调胆固醇生物合成途径多种酶的表达，如HMGCS1、HMGCR、MVK、IDI1、FDPS、GGPPS、SQLE、LSS、DHCR24和DHCR7，并为结直肠癌治疗提供了新的药物，对临床治疗具有重要意义。有重要意义。有重要意义。


技术研发人员：董振 崔红娟 张晓琳 杨元苗
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/9/12