工程化巨噬细胞RAW-IL10及其在肺纤维化治疗中的应用的制作方法

工程化巨噬细胞raw-il10及其在肺纤维化治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种工程化巨噬细胞raw-il10及其在肺纤维化治疗中的应用。


背景技术：

2.肺纤维化是一种由多种病因引起的，以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞在肺泡的堆积，以及纤维结缔组织的发展为主要特点，并最终导致患者正常肺组织结构改变的一种慢性进行性肺间质疾病。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。
3.白细胞介素10(il-10)主要来源于单核巨噬细胞、t淋巴细胞和b淋巴细胞等，在机体中发挥抑制炎症或免疫反应的作用，作为抑制性细胞因子，il-10在多种动物模型中表现出抑制纤维化的作用,这使其成为肺纤维化极具吸引力的治疗候选药物,但是il-10非常短暂的半衰期(外周血中仅1-2分钟)限制了其作用的发挥。因此提高肺组织中il-10等治疗性蛋白的浓度和持续时间，成为治疗肺纤维化急需解决的关键问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种工程化巨噬细胞raw-il10及其在肺纤维化治疗中的应用。
5.第一方面，本发明要求保护一种制备表达il-10蛋白的巨噬细胞的方法。
6.本发明所要求保护的制备表达il-10蛋白的巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：使巨噬细胞表达il-10蛋白，得到表达il-10蛋白的巨噬细胞。
7.在所述方法中，使巨噬细胞表达il-10蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有编码il-10蛋白的基因的重组载体实现的。
8.其中，所述il-10蛋白为鼠源il-10,记为mil-10蛋白。
9.进一步地，所述mil-10蛋白可为如下任一：
10.(a1)氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.2的第1-178位所示的蛋白质；
11.(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
12.(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
13.(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
14.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
15.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性
检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
16.上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
17.在上述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。
18.相应地，所述方法可包括如下步骤：
19.(b1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得重组慢病毒；
20.(b2)将步骤(b1)得到的重组慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达il-10蛋白的巨噬细胞。
21.在本发明的具体实施方式中，所述重组慢病毒载体为将il-10蛋白的编码基因插入到载体pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro的多克隆位点(bamh1和not1)之间后得到的重组质粒。
22.在本发明的具体实施方式中，所述慢病毒包装质粒为pmd2g和pspax2。所述慢病毒包装细胞为293ft细胞。
23.在本发明的具体实施方式中，所述巨噬细胞为raw264.7细胞。
24.在上述方法中，所述il-10蛋白的编码基因可为如下任一：
25.(c1)seq id no.1或seq id no.1的第1-534位所示的dna分子；
26.(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码所述mil-10蛋白的dna分子；
27.(c3)与(c1)-(c2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述mil-10蛋白的dna分子。
28.上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％ sds和1
×
ssc，0.1％ sds各洗膜一次。
29.上述编码基因，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可
获得同一性的值(％)。
30.上述编码基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
31.第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述的方法制备得到的表达il-10蛋白的巨噬细胞。
32.第三方面，本发明要求保护前文第二方面中所述表达il-10蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗肺纤维化的产品中的应用。
33.第四方面，本发明要求保护一种用于预防和/或治疗肺纤维化的产品。
34.本发明要求保护的用于预防和/或治疗肺纤维化的产品，含有前文第二方面中所述表达il-10蛋白的巨噬细胞。
35.其中，所述产品可为药物。
36.在本发明中的具体实施方式中，所述肺纤维化为博莱霉素(blm)诱导的小鼠肺纤维化。
37.本发明制备了表达mil10蛋白的巨噬细胞，即实施例中的慢病毒pcdh-mil10-myc感染的raw264.7细胞。实验证明，通过向博莱霉素染毒的肺纤维化小鼠肺内滴注工程化巨噬细胞raw-il10，可以有效减轻小鼠肺纤维化程度。由此可见，慢病毒pcdh-mil10-myc感染的raw264.7细胞可以减轻纤维化程度，同时实验证明，慢病毒pcdh-mil10-myc感染的raw264.7细胞可以长效释放抗炎因子白细胞介素-10，解决了蛋白药物il-10在体内半衰期极短的问题。
38.本发明将有助于肺纤维化治疗技术的发展，并推进以巨噬细胞为基础的细胞治疗方法在肺部疾病治疗中的应用。
附图说明
39.图1为实施例1中步骤三的实验结果。
40.图2为elisa方法检测raw-il10细胞培养上清中mil10蛋白的表达。
41.图3为为blm诱导的小鼠肺纤维化(以21天为实验终点，通过对纤维化肺组织大体形态观察及肺组织he染色评估肺纤维化程度)。
42.图4为通过检测肺组织羟脯氨酸水平比较raw-il10细胞治疗组与对照组纤维化水平。其中blank为正常对照组(nt组)。
43.图5为利用elisa方法检测纤维化小鼠肺组织中il10蛋白的表达水平。
具体实施方式
44.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
45.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊
说明，均可从商业途径得到。
46.pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro载体：sbi公司产品，cat.#cd713b-1。
47.实施例1、稳定表达mil-10蛋白的巨噬细胞株(即慢病毒pcdh-mil10-myc感染的raw264.7细胞)的获得和其分泌的mil-10蛋白的检测
48.一、重组质粒pcdh-mil10-myc的构建
49.从国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)网站上获得mil-10的基因序列，在其基因序列上连接myc标签，使目标载体携带myc标签蛋白，便于利用western blot进行检测。将该目的基因插入经bamh1和not1双酶切后的pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro，经测序验证正确后获得pcdh-mil10-myc重组质粒。
50.重组质粒pcdh-mil10-myc的结构描述：将pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro载体的酶切位点bamh1和not1之间的小片段替换为seq id no.1所示dna片段的重组质粒。
51.seq id no.1的第1-534位为mil10的编码基因，第535-564位为myc的编码基因。
52.seq id no.1编码seq id no.2所示氨基酸序列。seq id no.2的第1-178位为编码mil10蛋白的氨基酸序列，第179-188位为编码标签蛋白myc的氨基酸序列。
53.二、包装重组慢病毒
54.取对数期状态良好的293ft细胞，接种于60mm
×
15mm培养皿中，37℃，5％ co2培养箱内培养，当细胞汇合度达到60％至70％时用慢病毒三质粒共转染体系进行转染。将包装质粒1μg pmd2.g、2μg pspax2(该两个质粒为通用生物有限公司的产品)，与4μg目标质粒(步骤一构建的pcdh-mil10-myc或pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro(阴性对照))用100μl opti-mem混合均匀。然后用100μl opti-mem稀释16μl lipofectaminetm2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和质粒dna稀释液，混匀，室温下静置20min。最后将转染复合物加入到细胞培养皿中，前后轻摇培养皿混合均匀。转染4-6h后可换新鲜培养基。转染后48h或72h收集富含慢病毒包装颗粒的细胞上清液，将收集的上清液3000g离心5min，去除细胞残余，上清用0.22μm的滤器过滤，随后4000g离心20min得到约200μl的病毒浓缩液，立即感染细胞或放-20℃保存备用。
55.三、重组慢病毒感染raw264.7细胞
56.将raw264.7细胞接种于60mm直径的培养皿中，37℃，5％ co2培养箱内培养，当细胞生长至对数期且状态良好时，取少量细胞接种于12孔培养板中，分别加入20μl浓缩后的pcdh-mil10-myc/pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro病毒液(病毒滴度约为10 8
pfu/ml)，感染约72h后，利用倒置荧光显微镜，在450至490nm的激发光照射下，观察raw264.7细胞的感染情况。加入10mg
·
l-1
的嘌呤霉素进行抗性筛选，24h后更换新鲜培养基，此时未感染成功的细胞被嘌呤霉素杀死，感染成功地细胞继续生长，分别命名为raw-il10和raw-con细胞，待细胞长满后将其接种至新的培养皿中扩大培养。
57.用浓缩的pcdh-mil10-myc和pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro病毒液感染raw264.7细胞，约72h后，在倒置荧光显微镜下观察到成功感染pcdh-mil10-myc和pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro的raw264.7细胞在488nm激发光照射下表达绿色荧光蛋白(gfp)。如图1所示。
58.四、elisa法检测raw-il-10中il-10的分泌水平
59.取六孔板，先加入1
×
105个待测细胞，然后加入2ml常规培养基，37℃、5％co2培养，
分别于培养第6、12、18、24h，收集raw-il-10上清液，用rd mouse il-10elisa试剂盒(试剂盒为thermo fisher公司的产品)检测上清液中il-10的分泌水平，具体如下：
60.板子准备：下述实验中所提到的抗体或试剂均为试剂盒中所包含。
61.⑴
抗体包被：用pbs稀释抗体包被液至工作浓度，加入96孔板中，每孔100μl，用pe手套盖住防止液体挥发，室温孵育过夜。
62.⑵
洗板：每孔加入400μl的wash buffer洗掉抗体包被液，放入洗板机中洗3次，每次一次尽量拍干孔中残余的液体，动作要快，避免板子干掉。
63.⑶
封闭：每孔加入300μl reagent diluent，室温孵育1h。
64.⑷
弃掉封闭液，重复步骤(2)。
65.样品准备：
66.⑸
每孔加入100μl稀释后的标准品或样品工作液，室温孵育2h。
67.⑹
吸出液体，重复步骤(2)。
68.⑺
每孔加入100μl检测抗体(detection antibody),室温孵育2h。
69.⑻
吸出检测液体，重复步骤(2)。
70.⑼
每孔加入100μl的streptavidin-hrp,室温避光20min。
71.⑽
吸出检测液，重复步骤(2)。
72.⑾
每孔加入100μl的substrate solution，室温避光20min。
73.⑿
每孔加入50μl的stop solution,立即在tecan f50酶标仪中检测450nm波长处od值。然后根据利用标准品绘制的标准曲线计算得到待测样本中il-10含量。
74.分别收集raw-il10在培养6、12、18、24h时的上清液，利用rd mouse il-10elisa试剂盒检测上清液中il-10的分泌水平。结果显示：在设置的6h、12h、18h、24h等不同时间点均细胞培养上清液中均可检测到mil-10的表达，且随着时间的延长，il-10的分泌水平逐渐升高，而在raw-con细胞中不能检测到mil-10的分泌。如图2所示(巨噬细胞自身分泌的il-10量很少，利用elisa的方法测得的od值很小，因此利用标准曲线得到的浓度基本为0或负数)。
75.实施例2、工程化巨噬细胞raw-il10对blm诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用
76.健康6-8周龄雄性balb/c小鼠，体重18-20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[动物合格证：scxk(京)2019-0008]。硫酸博莱霉素(blm)母液的配制：将10mg blm溶解于500μl dmso(使用前放入水浴锅中加热至50℃)中，配成20g
·
l-1
的blm母液，使用时稀释成所需浓度。
[0077]
1、健康雄性balb/c小鼠随机分成4组，每组6只，分别为正常对照组(nt组)、pbs组及raw-con组、raw-il10细胞治疗组。各组小鼠均饲养于spf级动物实验室内，实验前一周予以适应性饲养，喂养条件相同。nt组不做任何处理。其余组别采用重复给药法，于实验第1天和第3天重复给予5mg/kg的blm滴鼻，每只50μl，诱导小鼠肺纤维化(见图3)。pbs组于第1天(以blm第一次滴鼻作为第1天)、第7天给予pbs溶液滴鼻，每只50μl。raw-con组和raw-il10细胞治疗组，每组分别于第1天(以blm第一次滴鼻作为第1天)、第7天采用滴鼻的方式给予1
×
106个raw-con和raw-il10细胞。具体给药方案为：将各组准备滴鼻的细胞消化各传代至两个大皿中，用dmem完全培养基，放至37℃，5％ co2培养箱中培养，待细胞状态良好，汇合度达到约90％-95％左右时收集细胞，pbs冲洗两遍，收集至15ml离心管中，4ml pbs重悬，利
用细胞计数板进行计数，根据所需细胞数量，计算出需加pbs的体积进行实验，以21天(以blm第一次滴鼻作为第1天)为实验终点。
[0078]
2、完成上述步骤后，于实验第21天检测小鼠肺组织羟脯氨酸含量，评估细胞治疗效果。
[0079]
羟脯氨酸在胶原蛋白中占1.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨、血管等处，因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。羟脯氨酸为胶原纤维所特有，通过对羟脯氨酸含量的检测，不但可以评估纤维化严重程度，同时为纤维化治疗研究提供参考。羟脯氨酸(hyp)检测试剂盒(碱水解法)为南京建成生物工程研究所的产品，货号a030-2-1。具体检测方法参见试剂盒说明书进行。
[0080]
结果显示：与pbs组相比，raw-il10细胞治疗组羟脯氨酸含量均明显下降，差异有统计学意义(p《0.05)。如图4所示。
[0081]
实施例3、工程化巨噬细胞raw-il10的体内功能验证
[0082]
组织样品的制备：取少量剪碎的实施例2中不同组小鼠右肺组织用滤纸吸干表面水分进行称重，按照小鼠肺组织重量的10倍加入pbs溶液，置于5ml离心管中，使用电动匀浆器制成肺组织匀浆，12000rpm/min，离心15min，取上清用于检测。
[0083]
用rd mouse il-10elisa试剂盒(试剂盒为thermo fisher公司的产品)检测上清液中mil-10的分泌水平，步骤如下：
[0084]
板子准备：下述实验中所提到的抗体或试剂均为试剂盒中所包含。
[0085]
⑴
抗体包被：用pbs稀释抗体包被液至工作浓度，加入96孔板中，每孔100μl，用pe手套盖住防止液体挥发，室温孵育过夜。
[0086]
⑵
洗板：每孔加入400μl的wash buffer洗掉抗体包被液，放入洗板机中洗3次，每次一次尽量拍干孔中残余的液体，动作要快，避免板子干掉。
[0087]
⑶
封闭：每孔加入300μl reagent diluent，室温孵育1h。
[0088]
⑷
弃掉封闭液，重复步骤(2)。
[0089]
样品准备：
[0090]
⑸
每孔加入100μl稀释后的标准品或样品工作液，室温孵育2h。
[0091]
⑹
吸出液体，重复步骤(2)。
[0092]
⑺
每孔加入100μl检测抗体(detection antibody),室温孵育2h。
[0093]
⑻
吸出检测液体，重复步骤(2)。
[0094]
⑼
每孔加入100μl的streptavidin-hrp,室温避光20min。
[0095]
⑽
吸出检测液，重复步骤(2)。
[0096]
⑾
每孔加入100μl的substrate solution，室温避光20min。
[0097]
⑿
每孔加入50μl的stop solution,立即在tecan f50酶标仪中检测450nm波长处od值。然后根据利用标准品绘制的标准曲线计算得到待测样本中il-10含量。
[0098]
结果：与对照组相比，移植raw-il10的小鼠肺组织中il10的含量与对照组相比明显升高(p《0.05)，表明工程化巨噬细胞raw-il10可持续而缓慢的释放il-10，从而发挥抗纤维化的作用。如图5所示。
[0099]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.一种制备表达il-10蛋白的巨噬细胞的方法，包括如下步骤：使巨噬细胞表达il-10蛋白，得到表达il-10蛋白的巨噬细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，使巨噬细胞表达il-10蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有il-10蛋白的编码基因的重组载体实现的。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述il-10蛋白为鼠源il-10,记为mil-10蛋白；进一步地，所述mil-10蛋白为如下任一：(a1)氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.2的第1-178位所示的蛋白质；(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组慢病毒载体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(b1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得重组慢病毒；(b2)将步骤(b1)得到的重组慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达il-10蛋白的巨噬细胞。6.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述巨噬细胞为raw264.7细胞。7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述mil-10蛋白的编码基因为如下任一：(c1)seq id no.1或seq id no.1的第1-534位所示的dna分子；(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码所述mil-10蛋白的dna分子；(c3)与(c1)-(c2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述mil-10蛋白的dna分子。8.权利要求1-7中任一所述的方法制备得到的表达il-10蛋白的巨噬细胞。9.权利要求8所述表达il-10蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗肺纤维化的产品中的应用。10.一种用于预防和/或治疗肺纤维化的产品，含有权利要求8所述表达il-10蛋白的巨噬细胞。

技术总结
本发明公开了工程化巨噬细胞RAW-IL10及其在肺纤维化治疗中的应用。本发明公开了一种制备表达IL-10蛋白的巨噬细胞的方法，包括如下步骤：使巨噬细胞表达IL-10蛋白，得到表达IL-10蛋白的巨噬细胞。本发明利用基因工程的方法构建表达IL-10的重组质粒，包装慢病毒，感染RAW264.7巨噬细胞，使其能持续稳定表达IL-10，将表达IL-10的工程化巨噬细胞通过滴鼻的方式注入纤维化小鼠肺内，使其达到减轻纤维化的作用。本发明将有助于肺纤维化治疗技术的发展，并推进以巨噬细胞为基础的细胞治疗方法在肺部疾病治疗中的应用。肺部疾病治疗中的应用。


技术研发人员：刘慧莹 杨翠平 张硌 柏长青
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第八医学中心
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/12