一种Fe3O4@Pt复合材料及其制备方法和应用

一种fe3o4@pt复合材料及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于疾病诊断领域，具体涉及一种fe3o4@pt复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.液体活检(liquidbiopsy)是指通过检测患者体液(如血液、尿液)中疾病标志物的丰度来辅助疾病(如癌症)诊断以及疗效评估的技术。与传统的组织活检相比，液体活检具有诸如优势，包括：非入侵式的取样方式，对患者友好；可在不同时间点重复取样，有利于监测疾病发展进程，因此在疾病早期诊断和个性化医疗领域受到广泛关注。然而，患者体液中的疾病标志物含量极低，且体液成分复杂，这给分析检测工作带来极大挑战。例如，肿瘤患者血液中的循环肿瘤dna(ctdna)在所有游离dna中的占比不到1.0％(donaldson j,park bh.circulating tumor dna:measurement and clinical utility.annual review of medicine,2018)。由于几乎所有的生物材料都是抗磁性或只有弱磁性，目前常采用fe3o4磁性颗粒分离和富集体液中的疾病标志物，从而提高检测精准度。
3.通常，在进行上述应用之前，需在fe3o4磁性颗粒表面修饰功能基团(如核酸探针、核酸适配体、抗体、多肽等)，以保证分离的特异性。而实现优异应用性能的关键在于：
①
fe3o4磁性材料本身具有高稳定性，在生物基质中结构和磁性不被破坏；
②
功能基团与fe3o4磁性材料能够稳定、高效交联，前者在生物基质中不易从fe3o4磁性材料表面脱落。研究表明，体液中富含硫醇类物质(如半胱氨酸、谷胱甘肽等)，而该类物质能够还原fe3o4磁性材料，导致fe3o4纳米材料溶解(mishanina a.v.,libiad m.biogenesis ofreactive sulfur species for signalingbyhydrogen sulfide oxidationpathways,nat.chem.biol.,2015)。有报道指出，正常人的尿液中硫醇物质的含量可达250mm/l，癌症患者尿液中的硫醇物更是正常人的2～20倍。功能化fe3o4磁性颗粒对生物硫醇的敏感性限制了其在生物基质中的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决fe3o4磁性材料在生物基质中应用所面临的材料本身稳定性，其与功能基团交联的稳定性问题，进而实现对体液中生物标志物的精准检测。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种fe3o4@pt核壳型复合材料(fe3o4@ptnp)及其制备方法和应用，np为纳米粒子缩写。
5.本发明的第一个目的是提供一种fe3o4@pt核壳型复合材料的制备方法，技术方案如下：
6.(1)采用共沉淀法合成fe3o4纳米颗粒，即在氮气气氛下，将fecl3·
6h2o和fecl2·
4h2o共同溶解在超纯水下，65℃搅拌2.5h。然后加入氨水，在80℃～100℃下继续搅拌30min后，冷却至室温，经分离、洗涤、干燥后得到所述的fe3o4纳米颗粒。
7.(2)利用超声将步骤(1)所述的fe3o4纳米颗粒分散于50vol％的乙醇溶液中，之后往其中前后加入氯铂酸、硼氢化钠，fe3o4np与氯铂酸的摩尔比为(1～4):1，反应温度为80
℃，在机械搅拌下，利用硼氢化钠的还原作用，使fe3o4纳米颗粒表面沉积一层pt单质，经分离、洗涤、干燥后得到所述的fe3o4@pt核壳型复合材料。
8.上述fe3o4@ptnp的制备方法，在步骤(1)中，优选的，fecl3·
6h2o浓度为为19.58g/l。
9.上述fe3o4@ptnp的制备方法，在步骤(1)中，优选的，fecl2·
4h2o浓度为7.17g/l。
10.上述fe3o4@ptnp的制备方法，在步骤(1)中，优选的，氨水浓度为1.23mm。
11.上述fe3o4@ptnp的制备方法，在步骤(2)中，优选的，在机械搅拌条件下进行，搅拌速度为500rpm～600rpm。
12.上述fe3o4@ptnp的制备方法，在步骤(2)中，优选的，fe3o4np与氯铂酸的摩尔比为2:1。
13.上述fe3o4@ptnp的制备方法，在步骤(2)中，优选的，硼氢化钠浓度为1mm。
14.上述fe3o4@ptnp的制备方法，优选的，所述fe3o
4 np的粒径在10～15nm。
15.上述fe3o4@pt np的制备方法，优选的，所述fe3o4@pt np的粒径不大于30nm。优选为15-20nm。
16.本发明的第二个目的在于提供一种功能基团与fe3o4@pt核壳型复合材料稳定、高效交联的方法。
17.在本发明中的一个实施案例中，制备了一种核酸探针功能化的fe3o4@pt纳米颗粒，修饰过程如下：
18.将fe3o4@ptnp重悬于含0.1～60mm na
+
的溶液中，继而往体系中加入末端修饰了巯基的核酸探针，混匀后，-20℃～-80℃冷冻，取出后解冻，此时核酸探针可通过pt-s键共价锚定于fe3o4@pt np表面，经分离、洗涤后，即可获得所述的核酸探针功能化的fe3o4@pt纳米颗粒。
19.进一步的，上述制备方法，优选的，反应溶液中na
+
离子浓度为10mm。
20.进一步的，上述制备方法，核酸的浓度为3μm，fe3o4@pt np的质量浓度为1μg/ml～10mg/ml，优选的，fe3o4@ptnp的质量浓度为100μg/ml。
21.进一步的，上述制备方法，低温冷冻时间为20min～120min。
22.本发明的第三个目的在于提供一种fe3o4@pt核壳型复合材料在液体活检中的应用。
23.进一步的，方法如下:将修饰了核酸探针的fe3o4@pt np(fe3o4@pt-h1)加入至含肿瘤标志物mirna-200c的尿液样品中，室温反应1h后，磁分离，去除上清。随后，加入含发卡核酸链h2、h3的缓冲溶液，室温下进行hcr扩增。反应2h后，接着加入gelred染料孵育15min，再度磁性分离，去除上清。将富集产物溶解在缓冲溶液中，检测荧光信号。
24.上述fe3o4@pt核壳型复合材料用于尿液mirna检测应用，优选的，hcr扩增时间为2h。
25.上述fe3o4@pt核壳型复合材料用于尿液mirna检测应用，优选的，h2、h3的比例为1:1，浓度分别为0.2～5.0μm。更为优选的，浓度为2μm。
26.上述fe3o4@pt核壳型复合材料用于尿液mirna检测应用，染料为super gelred(购买的母液浓度为10000
×
)，优选的，gelred浓度为0.1
×
～0.8
×
。更为优选的，浓度为0.5
×
。
27.与现有技术相比，本发明的优势在于：
28.1、本发明制备的fe3o4@pt核壳型复合材料，利用惰性金属pt保护fe3o4，克服其易被生物基质的还原性、氧化性物质破坏的问题，进而提高fe3o4在生物基质中的稳定性，以保证检测应用时的精准性。
29.2、本发明制备的fe3o4@pt核壳型复合材料，由于表面pt层的存在，为进行核酸、蛋白等基团的功能化提供了简便、高效的修饰方式。仅需在-80℃下冷冻20min，即可在形成pt-s键，进而将功能基团共价锚定于fe3o4@pt核壳型复合材料表面。相比传统的酰胺键连接、链霉亲和素-生物素特异性作用具有明显优势。
30.3、本发明制备的fe3o4@pt核壳型复合材料，基于pt-s键的低配体交换率，保证了在富含硫醇类物质的生物基质中，功能基团能够与fe3o4@pt核壳型复合材料稳定交联，进一步保证了fe3o4@pt核壳型复合材料在检测应用中的精准性，拓宽了fe3o4磁性材料的应用范围。
附图说明
31.图1为实施例1中制备的fe3o
4 np的透射电子显微镜图和fe3o
4 np、fe3o4@ptnp的xrd谱图，a：fe3o4np；b：fe3o4@ptnp。
32.图2为实施例2中fe3o4@pt np在gsh中稳定性考察的图片和光谱图，(a)fe3o
4 np、fe3o
4-cooh np、fe3o
4-sanp、fe3o4@pt np在gsh中的稳定性；(b)通过荧光光谱验证各纳米颗粒的稳定性。
33.图3为实施例3中fe3o4@pt np-dna的紫外吸收光谱图；
34.图4为实施例3中fe3o4@pt np-dna和fe3o4@pt np的xps谱图；(a)fe3o4@ptnp-dna的xps部分谱图(结合能0～400ev)；(b)fe3o4@ptnp-dna的xps全谱图；(c)fe3o4@ptnp中pt的4f轨道精细谱；(d)fe3o4@ptnp-dna中pt的4f轨道精细谱。图5为实施例4中fe3o4@ptnp-g-quadruplex、fe3o4@pt np与tmb发生显色反应的光谱图；
35.图6为实施例5中fe3o4@ptnp-g-quadruplex与fe3o4@au np-g-quadruplex在gsh环境下的考察稳定性的光谱图，(a)fe3o4@au np-g-quadruplex和(b)fe3o4@pt np-g-quadruplex分别与不同浓度gsh共孵育后，磁分离的沉淀物与硫黄素t结合后的荧光光谱；(c)fe3o4@au np-g-quadruplex，fe3o4@pt np-g-quadruplex荧光信号与浓度之间的关系图。f：与不同浓度gsh共孵育后的荧光；f0：未与gsh共孵育后的荧光。图7为实施例6中fe3o4@pt np-h1和fe3o4@au np-h1分别在含、不含gsh的缓冲液中检测mirna-200c所得hcr产物的光谱图(a)和柱状荧光强度对比图(b)。
具体实施方式
36.以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在易于理解本发明的技术方案特征，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
37.实施例1fe3o
4 np、fe3o4@pt np的透射电子显微镜图
38.(1)合成fe3o4np。采用共沉淀法合成fe3o
4 np(tem粒径在10-15nm)。将fecl3·
6h2o
(2.35g)和fecl2·
4h2o(0.86g)溶于100ml超纯水中，在65℃的氮气气氛下磁力搅拌加热2.5h。随后，将10ml的25wt％氨水加入到混合溶液中，在80℃的氮气气氛下剧烈搅拌30min，冷却至室温。通过磁铁将黑色纳米颗粒从溶液中分离出来。然后将纳米颗粒用超纯水和乙醇,洗涤三次洗涤的ph值接近中性，并在70℃下真空干燥过夜。干燥后密封置于4℃保存。
39.(2)合成材料fe3o4@pt np。通过化学沉淀法合成fe3o4@ptnp。首先，量取21l的水加入100ml圆底烧瓶中，再加入250μl的h2ptcl6(20mmol/l)，80℃加热20min后，在机械搅拌下加入已超声分散fe3o4(0.8mg/ml)溶液3ml，搅拌加热6min。最后加入125ml的nabh4(200mm)，加热24min。搅拌冷却至室温后，通过磁铁将分离洗涤后置于4℃冰箱保存。
40.将本实施例制备的fe3o4np和fe3o4@pt np分散于超纯水中，取少量分别滴加到铜网上，进行透射电子显微镜表征实验。
41.结果分析：图1(a)为本实施例制备的fe3o4np的透射电子显微镜图。如图所示，本实施例制备的中fe3o4np大小均一，分散性好。fe3o
4 np粒径大小在13nm左右与文献报道一致。图1(b)为本实施例制备的fe3o4np、fe3o4@pt np的xrd谱图。由图可知，出现了fe3o4面心立方的晶体结构(220)、(311)、(400)、(422)、(440)和(511)晶面的衍射峰，与jcpds(no.75-0033)文件高度匹配，表明fe3o4纳米颗粒成功合成。与fe3o4np相比，fe3o4@pt np的xrd谱图中出现了与pt(jcpds no.87-0640)一样(111)、(200)和(220)的特征衍射峰，同时也出现fe3o4的面心立方的特征衍射峰。由于检测粉末是磁分离后干燥得到，不肯存在单独的pt颗粒。因此，上述结果表明在fe3o
4 np的表面沉积了一层pt单质，且在fe3o4@pt np合成过程中，内核fe3o4的晶体结构未发生改变。
42.实施例2fe3o4@pt np在生物硫醇环境中的稳定性考察
43.取相同质量浓度的fe3o4np、fe3o
4-sanp、fe3o4@aunp、fe3o4@ptnp，加入至含gsh(终浓度5mm)的溶液中，共孵育3小时后，通过拍照对比反应前后的磁吸附量。之后，分别取150μl上述反应溶液，加入tamer修饰的dna(终浓度3μm)，混合均匀后，37℃下震动摇晃孵育30min。用稳态-瞬态荧光光谱仪(pti)测定其荧光光谱。激发波长为545nm，收集565～665nm发射波段的荧光信号，激发与发射狭缝的宽度均为5nm，扫描速度为2nm/s。
44.结果分析:如图2(a)所示，我们可以看到在经过gsh处理后，通过磁力架吸附后可以明显可观察到不管是自己合成的fe3o
4 np还是商业化的fe3o
4-cooh np、fe3o
4-sanp吸附出来的颗粒明显减少了，而fe3o4@pt np颗粒吸出的量基本不变。猜测可能是由于裸露的fe3o
4 np被gsh还原，因而结构遭到破。对于fe3o4@pt np来说，pt层则可保护fe3o4免受gsh影响。图2(b)进一步验证了我们的猜测。如图所示，由于gsh可破坏裸露的fe3o4，释放出fe
3+
和fe
2+
淬灭tamer荧光，因此除了fe3o4@ptnp组，其余组反应溶液处理后tamer荧光显著下降。该实施案例充分证明fe3o4@pt np能在生物硫醇环境下保持结构稳定。
45.实施例3冷冻法制备dna功能化fe3o4@pt np的可行性探究
46.将30ul dna-hs(100μm)加入到970μl的含有na
+
离子(10mm)的fe3o4@ptnp溶液(100μg/ml)中，涡流混合均匀。将上述混合液置于-20℃冷冻2～3h或-80℃冻20min之后，取出于室温下融解。然后，在磁场下将功能化纳米颗粒从溶液中分离出来，并用超纯水洗涤分离物2-3次以完全除去游离dna。将所得分离物重新分散在超纯水缓冲液中，进行紫外分光光度计和x射线光电子能谱仪表征。
47.结果分析：图3为本实施例制备的fe3o4@ptnp-dna的紫外吸收光谱图。以fe3o4@
ptnp为参比，进行背景扣除，之后再测定fe3o4@ptnp-dna的紫外吸收光谱。由图可见，在260nm处存在明显的dna特征吸收峰，初步证明dna与fe3o4@ptnp发生交联。图4为本实施例制备的fe3o4@pt np和fe3o4@ptnp-dna的x射线光电子能谱图。结果如图所示，fe3o4@ptnp-dna样品中出现pt4f、s2p、n1s以及fe2p轨道的峰，而s和n特征峰的出现可以证明dna负载于颗粒表面。进一步对fe3o4@ptnp和fe3o4@ptnp-dna的pt4f轨道进行精细谱分析(图4b、4c)，pt的结合能整体都向大的方向偏移，说明pt的电子云密度变得更低了。这是因为dna上s与n元素的电负性都比pt大，共价连接后对电子吸引，造成pt电子密度的下降。n的电负性强于s，对pt4f
7/2
和pt4f
5/2
的单峰分裂成一前一后的两个峰。xps谱图证明了dna与fe3o4@ptnp通过p-s键连接，同时也证明了polya碱基对pt也是具有作用力的。上述结果均证明fe3o4@pt np可与dna通过pt-s共价连接。
48.实施例4功能化修饰对dna原始功能的影响探究
49.在此实施案例中，在fe3o4@pt np表面修饰g-quadruplex进行功能验证。按照实施例3的方法把dna换成带巯基的g-四聚体(g-quadruplex)，合成fe3o4@pt-g-quadruplex复合材料。调节fe3o4@pt-g-quadruplex溶液至ph 5.0，之后加入氯化血红素(2μm)、tmb(2.5mm)、h2o2(5mm)，于室温下反应后，测定300～800nm紫外吸收，并用同浓度的fe3o4@pt纳米颗粒做对比。
50.结果分析：g-quadruplex与氯化血红素结合后，可以催化h2o2氧化tmb产生显色反应，并在620-650nm出现紫外吸收。由图5可知，由于本身fe3o4@pt np也具有过氧化物酶的作用，所以在620-650nm有明显紫外吸收。但是与fe3o4@pt np-g-quadruplex样品对比，后者在620-650nm处的紫外吸收更强，为前者的1.75倍。上述结果可证明g-quadruplex修饰于fe3o4@ptnp表面后，依然具备催化功能。
51.实施例5fe3o4@pt np-g-quadruplex在生物硫醇环境中的稳定性探究
52.将fe3o4@pt np-g-quadruplex和fe3o4@au np-g-quadruplex与不同浓度的gsh(0、50、100、250、500、1000μm)于37℃混合温育6h。结束后磁分离，收集沉淀物并加入缓冲溶液重悬。之后分别加入硫黄素t，继续孵育15min，测定荧光。在437nm激发并在450-600nm处收集。
53.结果分析：g-四聚体与硫黄素t结合后能在485nm出发出荧光。用这个性质来考察g-quadruplex从颗粒表面脱落的情况。如图6(a)、(c)所示，我们通过荧光稳态测量系统(pti)观察到fe3o4@au-g-quadruplex溶液中的荧光信号随着gsh的浓度增大而发生明显减小，说明g-quadruplex的释放增加。如图6(b)所示，fe3o4@pt np-g-quadruplex溶液的荧光强度基本上没有变化。可以推测，gsh能够破坏au-s键，但是对pt-s键的影响微弱，因而在富含硫醇的环境中，功能基团能与fe3o4@pt np稳定交联，保证检测应用的精准性。
54.实施例6fe3o4@pt np-h1探针用于尿液中mirna-200c的检测
55.按照实施例3的方法把dna换成带h1,制备了探针fe3o4@pt-h1和fe3o4@au np-h1。取4个离心管，编号1、2、3、4。将探针fe3o4@pt-h1和fe3o4@au-h1分别加入1、2和3、4。随后在2和4中加入gsh溶液(1mm)，1和3中加入等量的超纯水，最后加入mirna-200c、h2、h3、gelred染料。混合均匀，放在25℃恒温混合仪中反应2h。反应结束进行磁分离去除溶液，用杂交缓冲液清洗沉淀1～2次，除去游离dna和染料，分离物用dna杂交缓冲液进行重悬分散。用稳态-瞬态荧光光谱仪(pti)测定其荧光光谱。激发波长为518nm，收集550～750nm发射波段的
荧光信号，激发与发射狭缝的宽度均为5nm,扫描速度为2nm/s。
56.结果分析：通过hcr扩增技术与磁分离技术对mirna-200c进行检测。可以看到在加入gsh的实验组中fe3o4@aunp-h1组的荧光强度大幅降低，加入gsh的荧光信号是未加入gsh的荧光信号的0.44倍，而fe3o4@pt np组的信号依旧稳定，几乎不变。上述结果说明fe3o4@ptnp-h1在含有生物硫醇的环境下，能抵抗干扰，不会影响检测灵敏度。
57.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种fe3o4@pt 核壳型复合材料的制备方法，其特征在于：采用共沉淀法合成fe3o4纳米颗粒，即在氮气气氛下，将fecl3·
6h2o和fecl2·
4h2o共同溶解在超纯水下，65℃搅拌2h。然后加入氨水，80℃~100℃下剧烈搅拌30 min，冷却至室温，经分离、洗涤、干燥后得到所述的fe3o
4 纳米颗粒；利用超声将步骤（1）所述的fe3o
4 纳米颗粒分散于50 vol%的乙醇溶液中，之后往其中前后加入氯铂酸、硼氢化钠，fe3o
4 np与氯铂酸的摩尔比为(1~4):1，反应温度为80 ℃，在机械搅拌下，利用硼氢化钠的还原作用，使fe3o
4 纳米颗粒表面沉积一层pt单质，经分离、洗涤、干燥后得到所述的fe3o4@pt 核壳型复合材料。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述fe3o
4 np的粒径在10~15 nm。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述fe3o4@pt np的粒径不大于30 nm。4.一种核酸探针功能化的fe3o4@pt纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将末端修饰了巯基的核酸探针加入按权利要求1所述方法制备的含fe3o4@pt np的溶液中，混匀后，-20℃~
ꢀ‑
80℃冷冻，取出后解冻，此时核酸探针通过pt-s键共价锚定于fe3o4@pt np表面，经分离、洗涤后，即可获得所述的核酸探针功能化的fe3o4@pt纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，核酸的浓度为3 μm，fe3o4@pt np的质量浓度为1 μg/ml~10 mg/ml。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，低温冷冻时间为20 min~120 min。7.fe3o4@pt核壳型复合材料在液体活检中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将末端修饰了巯基的核酸探针加入按权利要求1所述方法制备的含fe3o4@pt np的溶液中，混匀后，-20℃~
ꢀ‑
80℃冷冻，取出后解冻，经分离、洗涤后，即可获得核酸探针功能化的fe3o4@pt纳米颗粒；将修饰了核酸探针的fe3o4@pt np加入至含肿瘤标志物mirna-200c的尿液样品中，室温反应1 h后，磁分离，去除上清，随后，加入含发卡核酸链h2、h3的缓冲溶液，室温下进行hcr扩增；反应2 h后，接着加入gelred染料孵育15 min，再度磁性分离，去除上清；将富集产物溶解在缓冲溶液中，检测荧光信号。

技术总结
本发明属于疾病诊断技术领域，具体涉及一种Fe3O4@Pt复合材料及其制备方法和应用。采用共沉淀法合成Fe3O4纳米颗粒，之后利用硼氢化钠的还原作用，在Fe3O4纳米颗粒表面沉积一层Pt单质，经分离、洗涤、干燥后得到Fe3O4@Pt核壳型复合材料。将末端修饰了巯基的核酸探针加入至含Fe3O4@Pt NP的溶液中，混匀后，低温冷冻，取出后解冻，即可获得所述的核酸探针功能化的Fe3O4@Pt纳米颗粒，用于液体活检。本发明利用惰性金属Pt保护Fe3O4，一方面，克服其易被生物基质中还原性、氧化性物质等破坏的问题，进而提高Fe3O4在生物基质中的稳定性。另一方面，利用Pt层与核酸、蛋白等功能基团形成Pt-S键，将后者稳定锚定于Fe3O4@Pt表面，共同保证了Fe3O4@Pt核壳型复合材料在生物体系应用中的精准性。精准性。精准性。


技术研发人员：卿志和 雷艳丽 付光为
受保护的技术使用者：长沙理工大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/12