针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球及其制备方法与应用

1.本发明属于双载药纳米微球技术领域，具体涉及针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球及其制备方法与应用。


背景技术：

2.癌症已成为本世纪危害人类生命健康的重要因素，其中结直肠癌是最常见的癌症种类之一。据全球癌症统计数据显示，结直肠癌(crc)已经是全球第二大致死性癌症，由于其隐匿性和侵袭性高，crc的发病率和复发率较高，并且预后差，严重威胁人类生命财产安全。2020年全球结直肠癌新发病例高达193万，约占所有新发恶性肿瘤的10％，其相关死亡人超过90万。其中共生菌感染是影响结直肠癌治疗的重要因素。
3.肿瘤具有特异性共生菌群。作为消化系统的结直肠部位影响严重，大部分结直肠癌被证实伴随着严重的共生菌感染。
4.共生菌群通过多种手段促进肿瘤增殖，主要有以下三个方面：(1)结直肠癌症会改变患病器官的细菌群落，刺激免疫系统形成炎症环境，促进共生菌增殖。(2)共生菌诱导结直肠微环境炎症反应的细胞增殖和活化，促进肿瘤细胞增殖；(3)肠道共生菌如核梭杆菌通过tlr4/keap1/nrf2信号激活细胞色素p450进而促进结直肠癌的发展。肠道的共生细菌与癌症两者之间互相影响，构成恶性循环。
5.目前的研究发现，癌症中的共生菌问题迟迟得不到解决，主要由以下三个方面影响，首先是缺乏有效的关注，共生菌杀灭复杂，难度大，很多文献都只从抗癌角度进行研究。其次是药物联合应用存在难度，抗菌药物由于缺乏靶向性全身扩散，伤害正常菌群使得治疗产生反效果。最后是缺少实体模型研究，模型构建及检测不成熟，皮下种植瘤模型不具备实际意义。
6.此前结直肠癌治疗难题主要有以下三个，一、传统的结直肠癌治疗方案，比如化疗、放疗等，但是其毒性大，副作用显著，疗效差。二、治疗结直肠癌使用单一的免疫疗法，例如pd-1抗体，其成本极高，个体差异大，并且治疗反应低。三、药物不能靶向释放：造成药物用量大、效果差、细胞毒性大。
7.因此，如何能够杀灭共生菌的同时激活机体的免疫反应抗癌将是一个亟需众多科研工作者解决的问题。


技术实现要素：

8.为了克服现有技术存在的不足，本发明的首要目的是提供一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法。
9.本发明的另一目的在于提供上述制备方法得到的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球。所得温度响应型双载药纳米微球可以温度响应靶向释放药物；具有优异的抗菌性能，可以杀死肿瘤部位的共生细菌；具有良好的激活机体免疫反应的功效，激活cd8+
t细胞杀死癌细胞；还具有良好生物相容性。
10.本发明的再一目的提供上述针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的应用。
11.本发明的目的通过如下技术方案实现：
12.一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，包括如下步骤：
13.(1)将盐酸多巴胺溶解于去离子水中，加入乙醇水溶液1中，加入浓氨水1搅拌，离心清洗，获得聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于乙醇水溶液2中，加入硅基原材料正硅酸乙酯(teos)、1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物(tespts)、聚多巴胺纳米颗粒溶液，混匀，边搅拌边滴加浓氨水2进行反应，得到混合液；
14.(2)将步骤(1)中的混合液离心，去掉杂质，然后沉淀溶解于去离子水中，高温高压反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液；
15.(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液离心，去除杂质，加入浓盐酸刻蚀，获得介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
16.(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将免疫抑制剂apd-1和抗菌剂hhc36共载于步骤(3)得到的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，清除表面杂质，表面包裹温敏聚合物pac，即获得所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球。
17.进一步地，步骤(1)中所述的十六烷基三甲基溴化铵是一种硅烷类活性剂，其结构式如下所示：
[0018][0019]
进一步地，步骤(1)中所述的双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物与正硅酸乙酯的结构式分别为：
[0020][0021]
进一步地，步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的结构式为：
[0022][0023]
进一步地，步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的结构式为：
[0024][0025]
式中，x为5，y为95，m为20。
[0026]
进一步地，步骤(1)中各物质的配比如下：
[0027]
所述的盐酸多巴胺的质量为10-500mg；优选为200-300mg；更优选为250mg；
[0028]
所述的乙醇水溶液1中乙醇和水的配比1：1-10，乙醇水溶液1的体积为10-100ml；优选乙醇和水的配比1：1-5，乙醇水溶液1的体积为40-80ml；更优选乙醇和水的配比1：2.25，乙醇水溶液1的体积为65ml；
[0029]
所述的浓氨水1的浓度为20％-40％，体积为0.1-10ml；优选浓度为20％-30％，体积为1-5ml；更优选浓度为25％-28％，体积为1.608ml；
[0030]
所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量为0.01-100g；优选为0.1-0.2g；更优选为0.16g；
[0031]
所述的乙醇水溶液2中乙醇和水的配比1：1-10，乙醇水溶液2的体积为50-150ml；优选乙醇和水的配比1：1-5，乙醇水溶液1的体积为80-120ml；更优选乙醇和水的配比1：2.5，乙醇水溶液2的体积为105ml；
[0032]
所述的正硅酸乙酯的体积为0.1-10ml；优选为0.1-0.5ml；更优选为0.4ml；
[0033]
所述的1,2-双三甲氧基硅基乙烷的体积为0.05-10ml；优选为0.1-1ml；更优选为0.125ml；
[0034]
所述的双(三乙氧基硅基)乙烯的体积为0.05-10ml；优选为0.05-0.5ml；更优选为0.1ml；
[0035]
所述的双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物的体积为0.05-10ml；优选为0.05-1ml；更优选为0.1ml；
[0036]
所述的浓氨水2的浓度为20％-40％，体积为0.1-10ml；优选浓度为20％-30％，体积为1-5ml；更优选浓度为25％-28％，体积为2ml。
[0037]
所述的聚多巴胺纳米颗粒的浓度为10-100mg/ml，体积为1-100ml；优选浓度为40-60mg/ml，体积为40-60ml；更优选为50mg/ml，体积为10ml。
[0038]
进一步地，步骤(1)中加入乙醇水溶液1后，于25-35℃搅拌10-48h；优选为于30℃搅拌24h。
[0039]
进一步地，步骤(1)中离心的转速为8000-15000rpm，清洗次数为1-5次。
[0040]
进一步地，步骤(1)中将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶解于乙醇水溶液2中后，于30-40℃搅拌10-48h；优选为于35℃搅拌24h。
[0041]
进一步地，步骤(2)中离心的转速为8000-15000rpm，清洗次数为1-5次。
[0042]
进一步地，步骤(2)中沉淀离子水的体积为100-200ml；优选为100-150ml；更优选为130ml。
[0043]
进一步地，步骤(2)中高温高压反应的温度为100-200℃、压强5-40mpa；优选为温度为150℃、压强10mpa。
[0044]
进一步地，步骤(3)中所述的浓盐酸的浓度为30％-50％，体积为0.1-10ml；优选浓度为30％-40％，体积为0.1-1ml更优选浓度为36％，体积为0.24ml。
[0045]
进一步地，步骤(3)中离心的转速为8000-15000rpm，清洗次数为1-5次。
[0046]
进一步地，步骤(4)中所述的免疫抑制剂apd-1的浓度为0.01-10mg/ml；优选为8.95mg/ml。
[0047]
进一步地，步骤(4)中所述的免疫抑制剂apd-1的体积为5-30μl；优选为11.2μl。
[0048]
进一步地，步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的浓度为0.1-10mg/ml；优选为5mg/ml。
[0049]
进一步地，步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的体积为50-300μl；优选为200μl。
[0050]
进一步地，步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的浓度为1-100mg/ml；优选为40mg/ml进一步地，步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的体积为50-200μl；优选为100μl。
[0051]
进一步地，步骤(4)中所述的共载的时间优选为6-48小时，所述的清除表面杂质的具体操作为：反应液15000rpm离心，洗涤，分离。
[0052]
进一步地，步骤(4)中所述的表面包裹温敏聚合物pac具体操作为：将清除表面杂质的共载免疫抑制剂apd-1和抗菌剂hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1-10ml超纯水中，在35-37℃搅拌下加入温敏分子pac，磁搅拌反应6-48小时，离心、洗涤和冷冻干燥。
[0053]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，通过上述制备方法得到。
[0054]
上述针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
[0055]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0056]
本发明提供的一种由上述的制备方法制得的温度响应型双载药纳米微球，其大小为270-280nm，结构为实心-空心-实心-空心的双层结构。
[0057]
本发明提供的双载药纳米微球的温度响应性能，是通过溶解-凝胶法将聚多巴胺
分子载入，利用聚多巴胺分子的光热效应升温，使得温敏分子pac打开实现温度释放药物的。
[0058]
本发明提供的温度响应型双载药纳米微球的抗菌性能，是利用纳米微球里面携带的抗菌多肽的抗菌性能而实现的。
[0059]
本发明提供的双载药纳米微球的免疫性能，是利用负载的免疫抑制剂特性而实现的。
[0060]
本发明提供的制备方法，利用将盐酸多巴胺溶解于去离子水中，加入乙醇混合溶液中，于碱环境下搅拌，离心清洗制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于乙醇水溶液中，然后加入硅基原材料双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物与正硅酸乙酯、聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在一定温度下边搅拌边滴加浓氨水进行反应，得到混合液。将混合液离心，去掉杂质，然后沉淀溶解于去离子水中，于高温高压反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。将聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液离心，去除杂质，加入浓盐酸刻蚀，得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。将介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将免疫抑制剂apd-1和抗菌剂hhc36共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，清除表面杂质，表面包裹温敏聚合物pac，得到温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0061]
其抗菌性能和免疫激活抗癌功能均通过温度响应型双载药纳米微球负载的抗菌多肽和免疫抑制剂的抗菌和免疫抗癌性能实现。该方法赋予了双载药纳米微球的免疫抗癌功能、靶向释药和良好抗菌性能，并且具有制备方式简单，生物相容性良好，抗菌性能稳定，靶向释药的优点，有望作为一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球。
[0062]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
[0063]
(1)本发明制备的负载有抗菌多肽和免疫抑制剂的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，能够在有效杀死肿瘤部位的共生菌的同时，解开cd8+t细胞的免疫抑制，激活cd8+t细胞，从而杀死肿瘤细胞，是首次将抗菌和免疫治疗相结合并运用治疗结直肠癌的方法，有望在后续动物实验中不仅能够实现抑制原位癌症，还能够实现抑制转移性癌症和复发性癌症。
[0064]
(2)本发明制备的负载有温敏分子pac和免疫抑制剂以及抗菌多肽的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，具有非常优良的抗菌性的同时具有相当优异的生物相容性，在一定的负载量范围内对正常细胞的影响和对血液中的红细胞的溶解能力完全可以忽略不计。
[0065]
(3)本发明制备的负载有温敏分子pac的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，其中温敏分子pac是第一次运用到纳米微球方面，也是第一次用在治疗癌症方面，与温敏分子patc相比，其制样方法更简单，分子更稳定，而且没有tpe基团的荧光干扰，能够温度响应释放药物，靶向癌症，能够高效抗癌。
[0066]
(4)本发明制备的负载有温敏分子pac的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，将pd-1抗体物理负载于纳米微球形成apd-1纳米制剂，相比于直接注射pd-1抗体与其它治疗方法联合治疗，本发明的纳米微球只要使用很少的pd-1抗体负载就能达到免疫的高反应率，并且能够使药物特异性释放，确保pd-1抗体的生物活性和长期保留，并最大限度地减少pd-1抗体带来的副作用。
[0067]
(5)本发明制备的负载有温敏分子pac的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，温度响应型双载药纳米微球，将温度响应释放药物、抗菌以及免疫治疗相结合具有非常大的创新性，通过两治疗和一释放，有望在后续的动物实验中实现非常有效的抗癌效果。
附图说明
[0068]
图1是实施例所用的活性剂十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的结构式；
[0069]
图2是实施例所用的硅基原材料双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物与正硅酸乙酯的结构式；
[0070]
图3是实施例所用的抗菌多肽hhc36的结构式；
[0071]
图4是实施例所用的ucst聚合物pac的结构式；
[0072]
图5是实施例1所制备的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒在透射电镜下的图片；
[0073]
图6是实施例1所制备的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的扫描电镜图片；
[0074]
图7是实施例1所制备的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的元素扫描图片；
[0075]
图8是实施例1制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒相机拍摄图片。
[0076]
图9是实施例1制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒n2吸附-解附曲线。
[0077]
图10是实施例1制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒介孔全分析。
[0078]
图11是实施例1制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒zeta电位；其中，柱子顺序从左至右依次为msn、pmsn、msn@amp、pmsn@amp、msn@apd-1、pmsn@apd-1、msn@apd-1@amp、pmsn@apd-1@amp。
[0079]
图12是实施例1制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒温度随激光照射时间的变化规律图；其中，曲线1、2、3、4、5、6、7依次为0、0.25mg/ml、0.30mg/ml、0.40mg/ml、0.50mg/ml、1mg/ml、2mg/ml。
[0080]
图13是实施例1免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图片。
[0081]
图14是实施例1免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒在不同温度条件下抗菌多肽的释放速率图；其中，a是分别在37和42℃下通过多功能酶标仪测其荧光值算出抗菌多肽的释放速率，b是先置于37℃让其释放，在24h后升温至42℃并通过多功能酶标仪测其荧光值算出抗菌多肽的释放速率。
[0082]
图15是实施例1免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒在不同温度条件下apd-1的释放速率图；其中，a是分别在37和42℃下通过多功能酶标仪测其荧光值算出抗菌多肽的释放速率，b是先置于37℃让其释放，在24h后升温至42℃并通过多功能酶标仪测其荧光值算出抗菌多肽的释放速率。
[0083]
图16是实施例1所制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒细胞相容性结果图；其中，每组柱子顺序从左至右依次为0、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、250mg/ml。
[0084]
图17是实施例1所制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺
二氧化硅纳米颗粒的生物相容性结果图。
[0085]
图18是实施例1所制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒杀死共生细菌结果图。
[0086]
图19是实施例1所制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒和cd8+t细胞表面的pd-1结合，从而激活免疫反应抗癌的共聚焦图片；其中，a是空白对照组，b是温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0087]
图20是实施例1所制备的免疫反应抗癌和抗共生菌群的温度响应型介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒抗癌结果图片。
[0088]
图21是实施例2所制备的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的tem形貌。
[0089]
图22是实施例3所制备的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒杀死共生细菌结果图。
[0090]
图23是实施例4所制备的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒生物相容性结果图；其中，每组柱状子顺序从左至右依次为0、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、250mg/ml。
[0091]
图24是实施例5所制备的纳米颗粒的透射电镜图片。
[0092]
图25是实施例5所制备的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒抗菌结果图。
[0093]
图26是对比例1所制备的纳米颗粒的透射电镜图片。
[0094]
图27是对比例2所制备的纳米颗粒的透射电镜图片。
[0095]
图28是对比例3所制备的纳米颗粒的透射电镜图片。
[0096]
图29是对比例4所制备的纳米颗粒的透射电镜图片。
具体实施方式
[0097]
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。以下实施例所使用的温敏分子pac的制备方法为：
[0098]
(1)将胆酸甲酯came(3g，7.1mmol)溶于25ml干乙二胺中并回流5小时。然后冷却反应溶液，并向溶液中加入20ml冰水。将混合物在室温下搅拌2小时。产物在室温下缓慢沉淀。将白色沉淀物过滤并用水彻底洗涤。在烘箱中干燥后，获得ca二胺(2.8g，90％)。随后，将ca二胺(2.0g，4.44mmol)、正丙醇npa(1.72g，8.88mmol)、三乙胺(0.902g，88.8mmol)和甲醇(10ml)加入25ml圆底烧瓶中。将该混合物在室温下搅拌24小时。在旋转蒸发器上除去甲醇后，通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇，20:1(v/v)和乙酸乙酯/乙醇，10:1(v/v))纯化产物，得到白色固体胆酸衍生丙烯酰胺caa(350mg，15.6％)。
[0099]
(2)向10ml schlenk管中加入丙烯酰胺am(268.7mg，3.78mmol)、胆酸衍生丙烯酰胺caa(101mg，0.2mmol)、十二烷基三硫代碳酸氰甲基酯cmdt(分子量为317.57，4.23mg，0.0133mmol)和偶氮二异丁腈aibn(0.44mg，0.0027mmol)以及1.2ml二甲基亚砜。通n260分钟除去混合物中的空气，然后将混合物置于70℃油浴锅搅拌24h后迅速放置于冰水中降温，再加入2.4ml dmso稀释，将混合物逐滴滴入100ml乙醇中，经8000rpm离心，真空干燥72h获得温敏聚合物pac，分子量为4000。
[0100]
实施例1
[0101]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，包括如下步骤：
[0102]
(1)将250mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml水混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0103]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0104]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0105]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为200μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0106]
通过透射电镜观察了介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图5所示，由于聚多巴胺分子的引入，透射电镜下可以观察到纳米微球呈现双层结构。其中聚多巴胺含有n元素，所以可以看到图6的元素扫描中，纳米微球也是含有n元素的，说明成功引入了聚多巴胺分子，从而可以光热升温使温敏分子pac达到溶解温度而打开释药。
[0107]
分别在37和42℃下，将温度响应型双载药纳米微球配成1mg/ml溶液释放，在0、2、4、6、8、10、12、24、48、72h取样稀释，并通过多功能酶标仪测其荧光值算出抗菌多肽的释放速率。结果如图14中a所示，37℃下抗菌多肽只被释放了很少一部分，说明在体内温度时其可以保护大部分抗菌多肽不被释放；在42℃时由于温敏分子pac打开，纳米微球里的药物释放量在24h达到65％。先将温度响应型双载药纳米微球置于37℃让其释放，在24h后升温至42℃，并通过多功能酶标仪测其荧光值算出抗菌多肽的释放速率。结果如图14中b的曲线2所示，药物突然释放了很多，说明纳米微球可以在升温后突释药物，从而有望达到在肿瘤部位利用外在热源升温，使温敏分子打开释放抗菌多肽达到抗菌的效果，打破癌-菌共生环境，从而抑制肿瘤的形成和恶化。
[0108]
分别在37和42℃下，将温度响应型双载药纳米微球配成1mg/ml溶液释放，在0、2、4、6、8、10、12、24、48、72h取样稀释，用小鼠pd-1抗体elisa试剂盒测apd-1释放速率。结果如图15中a所示，37℃下apd-1只被释放了很少一部分，说明在体内温度时其可以保护大部分抗菌多肽不被释放；在42℃时由于温敏分子pac打开，纳米微球里的药物释放量在24h达到55％左右。先将温度响应型双载药纳米微球置于37℃让其释放，在24h后升温至42℃，并通
过小鼠pd-1抗体elisa试剂盒测apd-1释放速率。结果如图15中b的曲线2所示，药物突然释放了很多，说明纳米微球可以在升温后突释药物，从而有望达到在肿瘤部位利用外在热源升温，使温敏分子打开释放apd-1达到和cd8+t细胞表面上的pd-1结合，使cd8+t细胞被激活，从而杀死肿瘤细胞。
[0109]
将灭菌的纳米颗粒与小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)孵育1d，3d，5d，用cck8试剂共孵育2h，在450nm测其od值，如图16所示，得到具有优良的细胞相容性。
[0110]
在37℃下，通过将抗凝兔血与温度响应型双载药纳米微球1：4共混，在抗凝兔血中37℃恒温培养2h，取出1ml兔血，用高速离心机进行离心(12000rpm，2min)，取上清液100μl，在541nm处测量吸光度，并计算溶血率。如图17所示，不同浓度的温度响应型双载药纳米微球溶血率均低于5％，表明其具有优异的生物相容性。
[0111]
利用温度响应型双载药纳米微球对金黄色葡萄球菌(atcc 6538p)进行了抗菌实验：将不同浓度的温度响应型双载药纳米微球与100μl，2
×
106cfu/ml的菌液混合均匀，110rpm于37和42℃孵育2h，取出稀释，涂板。抗菌结果如图18所示，由于在37℃下温敏分子pac没被激活，因此抗菌多肽没有被释放出来，所以细菌存活率很高，而在42℃下温敏分子pac被激活，从而使多肽释放，抗菌性能提升，其中纳米微球250mg/ml时抗菌率达到97.66％。
[0112]
将用cy-5标记温度响应型双载药纳米微球，然后和cd8+t细胞共孵育6h，用pbs轻轻清洗去除残余的纳米微球，使用4％多聚甲醛置于4℃固定30min，pbs清洗，添加0.1％的triton溶液没过细胞，室温孵育13min，吸出triton溶液，pbs清洗，加入dapi溶液没过细胞，室温孵育6min，吸出dapi溶液，清洗，利用leica clsm进行定性拍照。如图19所示，双载药纳米微球处于cd8+t细胞表面，和t细胞表面的pd-1结合，从而可以解开免疫抑制，激活cd8+t细胞，激活免疫反应，使cd8+t细胞能够识别并杀死癌细胞。
[0113]
将温度响应型双载药纳米微球与未活化的cd8+t细胞和ct26结直肠癌细胞共培养，使用红外线治疗仪升温30min，然后培养2h，用pbs清洗，离心，除去cd8+t细胞，用cck8试剂共孵育2h，在450nm测其od值，计算癌细胞存活率。如图20所示，ct26结直肠癌细胞随着纳米微球浓度的增加存活率降低，250μg/ml时癌细胞存活率为0％，说明温度响应型双载药纳米微球成功释放pd-1抗体，使未活化的cd8+t细胞被激活，从而激活免疫反应，杀死癌细胞。
[0114]
实施例2
[0115]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，包括如下步骤：
[0116]
(1)将500mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0117]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0118]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂
质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0119]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为200μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0120]
通过透射电镜观察了聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图21所示，由于聚多巴胺分子的引入，透射电镜下可以观察到纳米微球呈现双层结构。但是其中由于聚多巴胺分子过量，而使tem图片中可以看到很多聚多巴胺纳米颗粒。
[0121]
实施例3
[0122]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，包括如下步骤：
[0123]
(1)将250mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0124]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0125]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0126]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为100μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0127]
利用温度响应型双载药纳米微球对金黄色葡萄球菌(atcc 6538p)进行了抗菌实验：将不同浓度的温度响应型双载药纳米微球与100μl，2
×
106cfu/ml的菌液混合均匀，
110rpm于37和42℃孵育2h，取出稀释，涂板。抗菌结果如图22所示，由于在37℃下温敏分子pac没被激活，因此抗菌多肽没有被释放出来，所以细菌存活率很高，而在42℃下温敏分子pac被激活，从而使多肽释放，抗菌性能提升，其中纳米微球250mg/ml时抗菌率只有39％。抗菌率低可能是因为负载的抗菌剂含量太少，释放的抗菌剂不足以杀死高浓度细菌，后续载药时应该增加抗菌剂的含量。
[0128]
实施例4
[0129]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，包括如下步骤：
[0130]
(1)将250mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.3ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.3ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0131]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0132]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0133]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为200μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0134]
将灭菌的纳米颗粒与小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)孵育1d，3d，5d，用cck8试剂共孵育2h，在450nm测其od值，如图23所示得到细胞相容性只有40％。细胞相容性低可能是因为双(三乙氧基硅基)乙烯和双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物加的太多，导致材料表面带有大量正电荷，使得正常细胞的细胞膜被戳破，使得细胞存活率低，导致纳米微球毒性较大，相容性较低。
[0135]
实施例5
[0136]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，包括如下步骤：
[0137]
(1)将250mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙
烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0138]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0139]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0140]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为50μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0141]
通过透射电镜观察了聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图24所示，纳米颗粒形状不稳定。可能是制纳米微球的时候转速太大或者原料受潮了，导致制得的纳米颗粒形状不稳定。
[0142]
利用温度响应型双载药纳米微球对金黄色葡萄球菌(atcc 6538p)进行了抗菌实验：将不同浓度的温度响应型双载药纳米微球与100μl，2
×
106cfu/ml的菌液混合均匀，110rpm于37和42℃孵育2h，取出稀释，涂板。抗菌结果如图25所示，由于在37℃下温敏分子pac没被激活，因此抗菌多肽没有被释放出来，所以细菌存活率很高，而在42℃下温敏分子pac被激活，从而使多肽释放，抗菌性能提升，其中纳米微球250mg/ml时抗菌率只有50％，抗菌率低可能时抗菌剂载得太少了。
[0143]
对比例1
[0144]
一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，包括如下步骤：
[0145]
(1)将250mg盐酸多巴胺和0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0146]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0147]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0148]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的
8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为200μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0149]
通过透射电镜观察了聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图26所示，纳米颗粒是实心的，载药量很低。可能是接枝多巴胺的方式不对，直接将盐酸多巴胺和ctab溶解搅拌，使多巴胺是包在纳米颗粒外面，形成实心的结构，不能形成介孔二氧化硅纳米微球，从而导致载药量很低。
[0150]
对比例2
[0151]
(1)将250mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0152]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于50ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0153]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0154]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为150μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0155]
通过透射电镜观察了聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图27所示，纳米颗粒大小不均。纳米颗粒大小不均可能是因为步骤(2)中高温高压反应时去离子水加的太少，导致刻蚀的不均匀。
[0156]
对比例3
[0157]
(1)将300mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，
加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、0.1ml双(3-(三乙氧基硅)丙基)四硫化物(tespts)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0158]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0159]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.36ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0160]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为120μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0161]
通过透射电镜观察了聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图28所示，透射电镜下的结构为纯空心结构，结构很不稳定，容易破损。可能是盐酸刻蚀过程中加的盐酸太多，导致刻蚀得比较厉害，核里全被刻蚀，并且有些壳也被刻蚀，没有核心支持，内核与外壳之间没有交联的介孔网络，使得内核的空间位置处于随机状态，所以其会受到外界条件的影响进行不规则运动，导致结构不稳定，容易破损。
[0162]
对比例4
[0163]
(1)将250mg盐酸多巴胺溶解于5ml去离子水中，加入20ml乙醇与45ml混合溶液中，加入1.608ml 25％-28％浓氨水于30℃搅拌反应24h，12000rpm离心5min清洗三次制备聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将0.16g溴代十六烷基三甲胺(ctab)溶解于30ml乙醇75ml水溶液中于35℃搅拌反应24h，然后加入0.4ml正硅酸乙酯(teos)、0.125ml1,2-双三甲氧基硅基乙烷(btse)、0.1ml双(三乙氧基硅基)乙烯(bteee)、10ml 50mg/ml聚多巴胺纳米颗粒溶液中混匀，在35℃下边搅拌边滴加1ml浓氨水进行反应，得到混合液；
[0164]
(2)将步骤(1)中的混合液12000rpm离心三次，去掉杂质，然后沉淀溶解于130ml去离子水中，于高温高压反应釜在150℃、10mpa下反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0165]
(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液12000rpm离心三次，去除杂质，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀，每隔3h离心，去掉上清液，加入0.24ml浓度为36％的浓盐酸刻蚀三次得到介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；
[0166]
(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将体积为11.2μl的8.95mg/ml免疫抑制剂apd-1和体积为140μl的5mg/ml抗菌剂hhc36与介孔聚多巴胺二氧化
硅纳米颗粒混匀，使得抗菌剂和免疫抑制剂apd-1共载于介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，共载时间为24h，反应液15000rpm离心，洗涤，分离，清除表面杂质，得到共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；将清洗后的共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1ml超纯水中，在37℃搅拌下加入体积为100μl的40mg/ml温敏分子pac，磁搅拌反应24小时，离心、洗涤和冷冻干燥，得到表面包裹温敏材料pac共载apd-1和hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，即为所述的温度响应型免疫治疗和抗共生菌群相结合的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒。
[0167]
通过透射电镜观察了聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒的表面形貌。结果如图29所示，纳米微球形貌很丑，并且分散性很差。可能是因为其没有同时包含bteee和tespts，而由于此对比例中的材料仅含有bteee单一组分，在溶胶-凝胶法的水热条件下，teos与btse络合形成的si-o-si骨架仅能单一的吸收乙烯基或二硫键，从而无法形成完整的卵黄壳结构。
[0168]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将盐酸多巴胺溶解于去离子水中，加入乙醇水溶液1中，加入浓氨水1搅拌，离心清洗，获得聚多巴胺纳米颗粒溶液；然后将十六烷基三甲基溴化铵溶解于乙醇水溶液2中，加入硅基原材料正硅酸乙酯、1,2-双三甲氧基硅基乙烷、双(三乙氧基硅基)乙烯、双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物、聚多巴胺纳米颗粒溶液，混匀，边搅拌边滴加浓氨水2进行反应，得到混合液；(2)将步骤(1)中的混合液离心，去掉杂质，然后沉淀溶解于去离子水中，高温高压反应，获得聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液；(3)将步骤(2)中的聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒混合液离心，去除杂质，加入浓盐酸刻蚀，获得介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒；(4)将步骤(3)中的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒干燥，将免疫抑制剂apd-1和抗菌剂hhc36共载于步骤(3)得到的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒，清除表面杂质，表面包裹温敏聚合物pac，即获得所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球。2.根据权利要求1所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的十六烷基三甲基溴化铵的结构式如下所示：步骤(1)中所述的双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物与正硅酸乙酯的结构式分别为：步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的结构式为：步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的结构式为：
式中，x为5，y为95，m为20。3.根据权利要求1所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中各物质的配比如下：所述的盐酸多巴胺的的质量为10-500mg；所述的乙醇水溶液1中乙醇和水的配比1：1-10，乙醇水溶液1的体积为10-100ml；所述的浓氨水1的浓度为20％-40％，体积为0.1-10ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量为0.01-100g；所述的乙醇水溶液2中乙醇和水的配比1：1-10，乙醇水溶液2的体积为50-150ml；所述的正硅酸乙酯的体积为0.1-10ml；所述的1,2-双三甲氧基硅基乙烷的体积为0.05-10ml；所述的双(三乙氧基硅基)乙烯的体积为0.05-10ml；所述的双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物的体积为0.05-10ml；所述的浓氨水2的浓度为20％-40％，体积为0.1-10ml；所述的聚多巴胺纳米颗粒的浓度为10-100mg/ml，体积为1-100ml。4.根据权利要求3所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)中各物质的配比如下：所述的盐酸多巴胺的的质量为200-300mg；所述的乙醇水溶液1中乙醇和水的配比1：1-5，乙醇水溶液1的体积为40-80ml；所述的浓氨水1的浓度为20％-30％，体积为1-5ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量为0.1-0.2g；所述的乙醇水溶液2中乙醇和水的配比1：1-5，乙醇水溶液1的体积为80-120ml；所述的正硅酸乙酯的体积为0.1-0.5ml；所述的1,2-双三甲氧基硅基乙烷的体积为0.1-1ml；所述的双(三乙氧基硅基)乙烯的体积为0.05-0.5ml；所述的双(三乙氧基硅基)-烷基四硫化物的体积为0.05-1ml；
所述的浓氨水2的浓度为20％-30％，体积为1-5ml；所述的聚多巴胺纳米颗粒的浓度为40-60mg/ml，体积为40-60ml；步骤(1)中加入乙醇水溶液1后，于25-35℃搅拌10-48h；步骤(1)中离心的转速为8000-15000rpm，清洗次数为1-5次；步骤(1)中将十六烷基三甲基溴化铵溶解于乙醇水溶液2中后，于30-40℃搅拌10-48h。5.根据权利要求1-4任一项所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中沉淀离子水的体积为100-200ml；步骤(2)中高温高压反应的温度为100-200℃、压强5-40mpa；步骤(3)中所述的浓盐酸的浓度为30％-50％，体积为0.1-10ml。6.根据权利要求5所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)中离心的转速为8000-15000rpm，清洗次数为1-5次；步骤(2)中沉淀离子水的体积为100-150ml；步骤(2)中高温高压反应的温度为150℃、压强10mpa；步骤(3)中所述的浓盐酸的浓度为30％-40％，体积为0.1-1ml；步骤(3)中离心的转速为8000-15000rpm，清洗次数为1-5次。7.根据权利要求6所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的免疫抑制剂apd-1的浓度为0.01-10mg/ml；步骤(4)中所述的免疫抑制剂apd-1的体积为5-30μl；步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的浓度为0.1-10mg/ml；步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的体积为50-300μl；步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的浓度为1-100mg/ml；步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的体积为50-200μl。8.根据权利要求7所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的免疫抑制剂apd-1的浓度为0.1mg/ml；步骤(4)中所述的免疫抑制剂apd-1的体积为为11.2μl；步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的浓度为1mg/ml；步骤(4)中所述的抗菌剂hhc36的体积为200μl；步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的浓度为40mg/ml；步骤(4)中所述的温敏聚合物pac的体积为100μl；步骤(4)中所述的共载的时间为6-48小时；步骤(4)中所述的表面包裹温敏聚合物pac具体操作为：将清除表面杂质的共载免疫抑制剂apd-1和抗菌剂hhc36的介孔聚多巴胺二氧化硅纳米颗粒溶于1-10ml超纯水中，在35-37℃搅拌下加入温敏聚合物pac，磁搅拌反应6-48小时，离心、洗涤和冷冻干燥。9.一种针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球，其特征在于：通过权利要求1-8任一项中所述的制备方法得到。
10.权利要求9中所述的针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了针对癌-菌体系的温度响应型双载药纳米微球及其制备方法与应用。利用一种全新的UCST聚合物PAC分子，制备了将免疫治疗和抗菌治疗相结合治疗结直肠癌的温度响应型双载药纳米微球的制备方法和应用。该方法包括：利用硅烷前体材料和硅酸盐，采用改良的溶解-凝胶法，引入具有光热效应的聚多巴胺分子，制备可升温并且内部具有卵黄壳结构的介孔二氧化硅纳米颗粒，并物理负载免疫抑制剂和抗菌多肽，最后采用UCST聚合物PAC分子包裹载药后的纳米颗粒。该方法将PAC分子应用于纳米颗粒上，赋予纳米颗粒温度响应释放的性能，抗菌的同时负载的免疫抑制剂能够和PD-1结合，激活免疫系统杀死癌细胞从而能够治疗结直肠癌。疫系统杀死癌细胞从而能够治疗结直肠癌。疫系统杀死癌细胞从而能够治疗结直肠癌。


技术研发人员：王琳 严凤英
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/9/12