从三叶青中提取山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法及山奈酚-3-O-芸香糖苷的应用

从三叶青中提取山奈酚-3-o-芸香糖苷的方法及山奈酚-3-o-芸香糖苷的应用
技术领域
1.本发明涉及三叶青提取，具体涉及一种从三叶青中提取山奈酚-3-o-芸香糖苷的方法。


背景技术：

2.发热是临床上最常见的症状，是疾病进展过程中的重要临床表现，可见于多种感染性疾病和非感染性疾病。当机体在致热源作用下或体温中枢的功能障碍时，使产热过程增加，而散热不能相应地随之增加或散热减少，从而导致体温异常升高，称为发热。对人体而言，体温大于37.3℃即为发热。对成人而言，发热后可积极配合医生治疗从而较为快速地减轻发热症状；对于幼儿而言，由于幼儿机体抵抗力差且多数情况不能将自身症状准确告知医生从而获得准确的治疗，因此可能导致发热病程的延长。每年均有一定数量的幼儿因为发热不能得到及时有效的治疗从而导致病情加重，病程延长，甚至导致较为严重的后遗症。长时间的发热可能会导致患儿机体免疫能力出现问题，从而增加罹患脑膜炎、中耳炎、结膜炎等炎症的几率，还会增加病毒感染的风险；不止如此，患儿还可能出现惊厥及脱水，严重者可能出现脑水肿及心衰。近些年由于医疗技术的发展，发展出了多种用于退热的药物，其中绝大多数均为化药类。对于幼儿而言，多种化药均禁止或受限制使用，而且批准用于幼儿退热的药物很多种也存在一定副作用，如抗生素类药物可能会导致耐药，对乙酰氨基酚可能会导致肝脏受损，布洛芬可能会导致可逆性肾损伤，严重者会导致中枢神经抑制及癫痫。因此，当前亟需开发针对发热症状、副作用小、且能够高效快速降低发热患者体温的新药，从而为发热患者的治疗提供帮助。
3.三叶青(tetrastigma hemsleyanum)是珍贵的林下药材，为葡萄科崖爬藤属多年生、常绿草质蔓生藤本植物，主要分布于浙江、湖南、江西、福建、湖北、广东、广西、四川等地区。因产地不同，其形状、药性会略有差异，就药性而言浙江三叶青块状在各类三叶青中属上品。新“浙八味”中药材培育品种名单包括铁皮石斛、衢枳壳、乌药、三叶青、覆盆子、前胡、灵芝、西红花8味中药材，浙江三叶青块茎多卵圆形，个体较小，一般长1.5-3cm，直径0.7-1.5cm；广西三叶青呈圆形、椭圆形或不规则形状，个体较大，一般长2.0-4.5cm，直径1.0-2.5cm。三叶青在民间被广泛应用，具有清热解毒、活血散结、消炎止痛、祛风化痰、理气健脾等功效。现代药理学显示三叶青提取物可在抗肿瘤、消炎、解热、止痛、保肝护肝、抗病毒以及在糖尿病及梗阻性肺病中发挥一定作用。在民间偏方里，三叶青因为其优秀的退热效果且无明显毒副作用，常作为特效的小儿退热药，这为新型安全高效清热药物的开发提供了新的线索。
4.产业化方面，专利号为2005100506495公开了以三叶青为主要原料的中药制剂，并得以量产，另有“三叶青胶囊”“三叶青颗粒”“三叶青粉”等产品。现有技术中也公开了以三叶青块根为原料研发了抗突变、治疗免疫疾病的药物“金丝地甲胶囊”，其对lewis肺肿瘤细胞、smmc-7721肝肿瘤细胞、scg-7901胃肿瘤细胞、hct-116结肠肿瘤细胞、hl-60人淋巴母细
80:1。
21.优选地，所述硅胶柱层析分离采用的硅胶柱的高径比为10-16:1。
22.本发明第二方面提供上述的方法提取得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷在制备清热药物中的应用。
23.通过上述技术方案，本发明的方法通过乙醇-水溶液对三叶青地上部分和/或地下部分的回流提纯，然后依次通过正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，对正丁醇萃取物进行硅胶柱层析分离、纯化，能够提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率。而且上述方法简单方便，通过上述方法得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度较高，减少使用过程中可能存在的过敏反应。
附图说明
24.图1是实施例1提取得到的组分ii-6的ftir谱图；
25.图2是实施例1提取得到的组分ii-6的1h-nmr谱图；
26.图3是实施例1提取得到的组分ii-6的h原子核磁位移归属图；
27.图4是实施例1提取得到的组分ii-6的
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c-nmr谱图；
28.图5是实施例1提取得到的组分ii-6的c原子核磁位移归属图；
29.图6是2,4-二硝基苯酚及细菌脂多糖(lps)对小鼠体温的影响；
30.图7是三叶青回流提取物对小鼠发热模型的清热作用；
31.图8是三叶青回流提取物经不同溶剂提取后所得产物对小鼠发热模型的清热作用，其中，对照组为lps造模组，g-ea为三叶青根部的乙酸乙酯提取物，g-bu为三叶青根部的正丁醇提取物，g-hx为三叶青根部的正己烷提取物；
32.图9是不同浓度山奈酚-3-o-芸香糖苷对小鼠发热模型的清热效果；
33.图10是山奈酚-3-o-芸香糖苷与布洛芬、对乙酰氨基酚的清热活性对比。
具体实施方式
34.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
35.如前所述，本发明第一方面提供一种从三叶青中提取山奈酚-3-o-芸香糖苷的方法，包括如下步骤：
36.(1)将三叶青地上部分和/或地下部分和乙醇-水溶液混合进行回流提纯，收集回流提取物；
37.(2)将所述回流提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，脱除溶剂后得到正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物和正丁醇萃取物；
38.(3)将所述正丁醇萃取物经硅胶柱层析分离及高效制备液相色谱分离，得到山奈酚-3-o-芸香糖苷。
39.发明人在研究过程中发现，本发明的方法通过乙醇-水溶液对三叶青地上部分和/或地下部分的回流提纯，然后依次通过正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，对正丁醇萃
取物进行硅胶柱层析及高效制备液相色谱分离，能够提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率，而且通过上述方法得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度较高。
40.根据本发明，三叶青地上部分和/或三叶青地下部分可以为干燥后的三叶青地上部分和/或三叶青地下部分，也可以是未经干燥处理的三叶青地上部分和/或三叶青地下部分。在本发明中，可以将三叶青地上部分和/或三叶青地下部分直接浸泡在乙醇-水溶液中进行回流提纯，也可以将三叶青地上部分和/或地下部分切块后浸泡在乙醇-水溶液中进行回流提纯，或者可以将三叶青地上部分和/或地下部分破碎成粉末后浸泡在乙醇-水溶液中进行回流提纯。优选地，先将三叶青地上部分和/或地下部分破碎成粉末然后浸泡在乙醇-水溶液中进行回流提纯。
41.根据本发明，在步骤(2)中，脱除溶剂的方式可以是现有技术中常用的脱除溶剂的方式，条件也可以是试验人员根据实际情况确定。
42.所述乙醇-水溶液的用量可以是本领域技术人员根据实际情况确定，只需要将三叶青能够完全浸泡在乙醇-水溶液中即可。为了能够进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率，优选地，在步骤(1)中，相当于1g的以干重计的三叶青地上部分和/或地下部分，所述乙醇-水溶液的单次用量为2-6ml。
43.为了能够进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率，优选地，所述乙醇-水溶液中乙醇的含量为50-90(体积)％。
44.优选地，在步骤(1)中，所述回流提纯的条件包括：温度为80-100℃。发明人研究过程中发现，在上述条件下进行回流提纯，能够更进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率。
45.优选地，在步骤(2)中，相当于1ml的回流提取物，所述正己烷的用量为0.5-1.5ml，所述乙酸乙酯的用量为0.5-1.5ml，所述氯仿的用量为0.5-1.5ml，所述正丁醇的用量为0.5-1.5ml。
46.为了能够进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率，优选地，在步骤(3)中，所述硅胶柱层析分离包括：将所述正丁醇萃取物上样至硅胶柱，并用乙醇-水混合液梯度洗脱后并去除溶剂后得到馏分i和馏分ii。
47.在梯度洗脱采用的乙醇-水混合液中乙醇和水的混合体积比为7:3-9:1。
48.优选地，每馏分的体积为层析柱保留体积的1/20-1/40，优选为1/30。
49.优选地，所述高效制备液相色谱分离包括：将馏分ii经反向c
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高效制备液相色谱分离，所述反向c
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高效制备液相色谱分离的洗脱液为乙腈-水混合液，能够有效提高提取得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度。
50.所述反向c
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高效制备液相色谱分离中的反向c
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的粒径可以根据实际情况确定。从更进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率来考虑，优选地，所述反向c
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高效制备液相色谱分离中的反向c
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的粒径为5-15μm。
51.优选地，所述乙腈-水混合液包括乙腈含量逐渐增大的乙腈-水第一洗脱液、乙腈-水第二洗脱液和乙腈-水第三洗脱液，所述乙腈-水第一洗脱液中乙腈的含量为5-15(体积)％，所述乙腈-水第二洗脱液中乙腈的含量为15-85(体积)％，所述乙腈-水第三洗脱液中乙腈的含量为85-95(体积)％。采用上述乙腈含量的乙腈-水混合液依次进行洗脱，能够更进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率和纯度。
52.为了能够进一步提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率和纯度，优选地，所述乙腈-水
第一洗脱液的洗脱时间为5-10min，所述乙腈-水第二洗脱液的洗脱时间为10-40min，所述乙腈-水第三洗脱液的洗脱时间为40-50min。
53.为了进一步提高提取过程中山奈酚-3-o-芸香糖苷的分离效果，进而提高其得率和纯度，优选地，在步骤(3)中，所述硅胶柱层析分离采用200-300目的硅胶。从进一步提高提取过程中山奈酚-3-o-芸香糖苷的分离效果，进而提高其得率和纯度来考虑，进一步优选地，所述硅胶柱中的硅胶和所述正丁醇提取物的质量比为30-100:1，具体可以为30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或者前述两个值之间的任意值。更优选地，所述硅胶柱中的硅胶和所述正丁醇提取的质量比为50-80:1，进一步优选为60-70:1。
54.优选地，所述硅胶柱层析分离采用的硅胶柱的高径比为10-16:1。其中，所述高径比为硅胶柱的高和直径的比值。在上述高径比的条件下，提取产物中山奈酚-3-o-芸香糖苷具有更高的分离效果，进而能够进一步提高山奈酚-3-o芸香糖苷的得率。
55.优选地，去除溶剂的方式为旋转蒸发，所述旋转蒸发的条件包括：温度为20-40℃，压力为-0.08至-0.1mpa。
56.本发明第二发明提供上述的方法提取得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷在制备清热药物中的应用。
57.该方法提取得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷纯度较高，具有较高的清热活性，减少使用过程中可能存在的过敏反应。
58.根据本发明一种特别优选的实施方式，提供一种从三叶青中提取山奈酚-3-o-芸香糖苷的方法，包括如下步骤：
59.(1)将三叶青破碎成粉末，然后将三叶青粉末和乙醇含量为90-98(体积)％乙醇-水溶液混合，然后在温度为95-105℃的条件下提取0.5-2h，重复2-4次，再使用乙醇含量为40-60(体积)％乙醇-水溶液在温度为95-105℃的条件下提取0.5-2h，重复2-3次，合并提取液，脱溶剂后得到提取物浓缩液；相当于1g的以干重计的三叶青，所述乙醇含量为90-98(体积)％乙醇-水溶液的单次用量为2-6ml，所述乙醇含量为40-60(体积)％乙醇-水溶液的单次用量为2-6ml；
60.(2)将所述回流提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，脱除溶剂后得到正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物和正丁醇萃取物；
61.(3)将所述正丁醇萃取物上样至硅胶柱(200-300目的硅胶，硅胶和正丁醇萃取相的质量比为60-70:1，硅胶柱的高径比为10-16:1)，并用乙醇-水混合液(乙醇和水的体积比为2-9:1)梯度洗脱后并在温度为20-40℃、压力为-0.08至-0.1mpa条件下旋转蒸发去除溶剂后得到馏分i和馏分ii，将馏分ii经反向c
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高效制备液相色谱分离，并用乙腈的含量为5-15(体积)％的乙腈-水混合液i洗脱5-10min、乙腈的含量为15-85(体积)％的乙腈-水混合液ii洗脱10-40min、乙腈的含量为85-95(体积)％的乙腈-水混合液iii洗脱40-50min，得到组分ii-1至组分ii-10，其中，组分ii-6为山奈酚-3-o-芸香糖苷。
62.上述提取方法能够有效提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率，且提取得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷具有较高的纯度。
63.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
64.以下实施例中，山奈酚-3-o-芸香糖苷的化学位移参数通过nmr方法(bruker avance iii hd 400)测得方法测得；山奈酚-3-o-芸香糖苷的基团红外吸收信息参数通过
红外吸收光谱(美国热电nicolet 5700)测得。本发明采用的三叶青取自台州，经60℃烘干后，打粉，粉末室温避光保存，其余试剂均通过商购得到。
65.实施例1
66.(1)将三叶青破碎成粉末，然后将50g三叶青粉末和200ml的乙醇含量为95(体积)％乙醇-水溶液混合，然后在温度为100℃的条件下提取1h，重复3次，再使用200ml的乙醇含量为50(体积)％乙醇-水溶液，在温度为100℃的条件下提取1h，重复3次，合并提取液，脱溶剂后得到200ml的提取物浓缩液；
67.(2)将提取物依次用200ml的正己烷、200ml的乙酸乙酯、200ml的氯仿和200ml的正丁醇萃取，得到200ml正己烷萃取相、200ml乙酸乙酯萃取相、200ml氯仿萃取相和200ml正丁醇萃取相；
68.(3)将正丁醇萃取相脱溶剂后，使用乙醇复溶，加入硅胶柱(200-300目硅胶，硅胶和正丁醇萃取物的质量比为65:1，硅胶柱的高径比为12:1)中进行柱层析分离，并用乙醇-水混合液(乙醇和水的体积比为7:3-9:1)梯度洗脱后并在温度为30℃、压力为-0.09mpa条件下旋转蒸发1.5h后得到0.52g浅黄色膏状物i和0.81g浅黄色膏状物ii，将浅黄色膏状物ii经反向c
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(粒径10μm)高效制备液相色谱分离，用乙腈的含量为10(体积)％的乙腈-水混合液i洗脱10min、乙腈的含量为50(体积)％的乙腈-水混合液ii洗脱30min、乙腈的含量为90(体积)％的乙腈-水混合液iii洗脱45min，得到组分ii-1至组分ii-10，其中，组分ii-6为山奈酚-3-o-芸香糖苷。
69.对组分ii-6进行红外检测、核磁氢谱检测以核磁碳谱检测，其谱图如图1-图5所示，主要存在的基团为＝ch伸缩振动(3012cm-1
)，—ch2和—ch3的变形振动(2963，2932与2874cm-1
)，c＝o伸缩振动(1708cm-1
)，—c＝c—伸缩振动(1655cm-1
)及苯环结构(1608-1452cm-1
)，从这些数据分析ii-6可能为具有芳香结构的多元酚或者多元醇类物质，通过分析1h-nmr(dmso-d6)及
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c-nmr结果，推测组分ii-6为山奈酚-3-o-芸香糖苷。
70.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
71.实施例2
72.(1)将三叶青破碎成粉末，然后将25g三叶青粉末和200ml的乙醇含量为95(体积)％乙醇-水溶液混合，然后在温度为100℃的条件下提取1h，重复3次，再使用200ml的乙醇含量为50(体积)％乙醇-水溶液，在温度为100℃的条件下提取1h，重复3次，合并提取液，脱溶剂后得到150ml的提取物浓缩液；
73.(2)将提取物依次用100ml的正己烷、100ml的乙酸乙酯、100ml的氯仿和100ml的正丁醇萃取，得到100ml正己烷萃取相、100ml乙酸乙酯萃取相、100ml氯仿萃取相和100ml正丁醇萃取相；
74.(3)将正丁醇萃取相脱溶剂后，使用乙醇复溶，加入硅胶柱(200-300目硅胶，硅胶和正丁醇萃取物的质量比为60:1，硅胶柱的高径比为10:1)中进行柱层析分离，并用乙醇-水混合液(乙醇和水的体积比为7:3-9:1)梯度洗脱后并在温度为25℃、压力为-0.1mpa条件下旋转蒸发1.5h后得到0.30g浅黄色膏状物i和0.42g浅黄色膏状物ii，将浅黄色膏状物ii经反向c
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(粒径15μm)高效制备液相色谱分离，并用乙腈的含量为15(体积)％的乙腈-水混合液i洗脱5min、乙腈的含量为85(体积)％的乙腈-水混合液ii洗脱30min、乙腈的含量为95
(体积)％的乙腈-水混合液iii洗脱40min，得到组分ii-1至组分ii-10，其中，组分ii-6为山奈酚-3-o-芸香糖苷。
75.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
76.实施例3
77.(1)将三叶青破碎成粉末，然后将50g三叶青粉末和200ml的乙醇含量为95(体积)％乙醇-水溶液混合，然后在温度为100℃的条件下提取1h，重复3次，再使用200ml的乙醇含量为50(体积)％乙醇-水溶液，在温度为100℃的条件下提取1h，重复3次，合并提取液，脱溶剂后得到190ml的提取物浓缩液；
78.(2)将提取物依次用200ml的正己烷、200ml的乙酸乙酯、200ml的氯仿和200ml的正丁醇萃取，得到200ml正己烷萃取相、200ml乙酸乙酯萃取相、200ml氯仿萃取相和200ml正丁醇萃取相；
79.(3)将正丁醇萃取相脱溶剂后，使用乙醇复溶，加入硅胶柱(200-300目硅胶，硅胶和正丁醇萃取相的质量比为70:1，硅胶柱的高径比为16:1)中进行柱层析分离，并用乙醇-水混合液(乙醇和水的体积比为7:3-9:1)梯度洗脱后并在温度为20℃、压力为-0.1mpa条件下旋转蒸发1.5h后得到0.45g浅黄色膏状物i和0.75g浅黄色膏状物ii，将浅黄色膏状物ii经反向c
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(粒径5μm)高效制备液相色谱分离，然后用乙腈的含量为5(体积)％的乙腈-水混合液i洗脱15min、乙腈的含量为15(体积)％的乙腈-水混合液ii洗脱40min、乙腈的含量为85(体积)％的乙腈-水混合液iii洗脱50min，得到组分ii-1至组分ii-10，其中，组分ii-6为山奈酚-3-o-芸香糖苷。
80.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
81.实施例4
82.按照实施例2的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，所述硅胶柱中的硅胶和所述正丁醇提取物的质量比为50:1。
83.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
84.实施例5
85.按照实施例3的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，所述硅胶柱中的硅胶和所述正丁醇提取物的质量比为70:1。
86.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
87.实施例6
88.按照实施例2的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，所述硅胶柱中的硅胶和所述正丁醇提取物的质量比为30:1。
89.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
90.实施例7
91.按照实施例3的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，所述硅胶柱中的硅胶
和所述正丁醇提取物的质量比为100:1。
92.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
93.对比例1
94.按照实施例1的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，步骤(1)包括：将三叶青破碎成粉末，然后将50g三叶青粉末和200ml的乙醇混合后浸泡10h，得到190ml的提取物。
95.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
96.对比例2
97.按照实施例1的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，步骤(2)包括：将提取物依次用200ml的正丁醇、200ml的氯仿、200ml的正己烷和200ml的乙酸乙酯萃取，得到200ml正己烷萃取相、200ml乙酸乙酯萃取相、200ml氯仿萃取相和200ml正丁醇萃取相。
98.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
99.对比例3
100.按照实施例1的方法提取山奈酚-3-o-芸香糖苷，不同的是，步骤(2)包括：将提取物依次用200ml石油醚、200ml乙酸乙酯、200ml二氯甲烷及200ml异丙醇进行萃取，得到190ml异丙醇萃取相。
101.经计算可知，山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率如表1所示；通过hplc方法对得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷的纯度进行检测，其结果如表1所示。
102.测试例1
103.选择直肠初始温度为37
±
0.3℃的小鼠进行研究，经30mg/kg 2,4-二硝基苯酚及20μg/kg lps分别造模后，每隔15min检测小鼠体温，直至小鼠体温降至37.0℃左右，绘制小鼠体温的变化曲线，结果如图6所示。从图6可得，20μg/kg lps构建的发热模型持续时间长，2,4-二硝基苯酚持续时间短，因此后续实验使用20μg/kg lps作为造模药物。
104.同时选择符合上述条件的小鼠，分为两组，一组作为实验组(灌胃实施例1步骤(1)中的提取物，用量200mg/kg，溶剂为生理盐水)，另一组作为对照组(只灌胃生理盐水，与实验组所用生理盐水体积相同)，每隔15min检测小鼠体温，直至小鼠体温降至37.0℃左右，绘制小鼠体温的变化曲线，结果如图7所示。由图7可得，与对照组相比，经过200mg/kg提取物灌胃处理后的小鼠，其体温下降速度更快，这表示三叶青提取物对小鼠发热具有一定清热效果。
105.测试例2
106.对实施例1步骤(2)中得到的正丁醇萃取相、乙酸乙酯萃取相、氯仿萃取相及正丁醇萃取相在温度为30℃、压力为-0.09mpa条件下旋转蒸发1.5h后得到正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物及正丁醇提取物。将四种不同提取物以0.2g/kg经灌胃方式作用于小鼠发热模型后，其体温变化曲线如图8所示。由图8可得，由三叶青根提取所得的三种不同极性提取物作用于小鼠发热模型后，均体现出不同程度的清热活性，但正丁醇提取物的清热活性最好，其中氯仿提取物较少，未进行相应动物实验。
107.测试例3
108.将实施例1提取到的山奈酚-3-o-芸香糖苷以1、2、4及6μmol/l的浓度灌胃发热小鼠(小鼠筛选、发热造模及对照组操作均与测试例1及测试例2一致)，结果如图9所示，随着作用于小鼠的山奈酚-3-o-芸香糖苷的浓度增加，小鼠体温下降的速度也随之变快。
109.测试例4
110.分别将4μmol/l山奈酚-3-o-芸香糖苷、布洛芬与对乙酰氨基酚作用于小鼠发热模型，结果如图10所示，其结果显示：山奈酚-3-o-芸香糖苷可快速降低小鼠体温至正常水平，布洛芬与对乙酰氨基酚发挥清热活性所需时间更久。
111.表1
[0112][0113][0114]
通过表1的结果可以看出，采用本发明实施例1-7的山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率明显高于对比例，说明本发明提供的方法能够有效提高山奈酚-3-o-芸香糖苷的得率。
[0115]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种从三叶青中提取山奈酚-3-o-芸香糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将三叶青地上部分和/或地下部分和乙醇-水溶液混合进行回流提纯，收集回流提取物；(2)将所述回流提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，脱除溶剂后得到正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物和正丁醇萃取物；(3)将所述正丁醇萃取物经硅胶柱层析分离及高效制备液相色谱分离，得到山奈酚-3-o-芸香糖苷。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，相当于1g的以干重计的三叶青地上部分和/或地下部分，所述乙醇-水溶液的单次用量为2-6ml；优选地，所述乙醇-水溶液中乙醇的含量为50-90(体积)％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述回流提纯的条件包括：温度为80-100℃。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述硅胶柱层析分离包括：将所述正丁醇萃取物上样至硅胶柱，并用乙醇-水混合液梯度洗脱后并去除溶剂后得到馏分i和馏分ii。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高效制备液相色谱分离包括：将所述馏分ii经反向c
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高效制备液相色谱分离，所述反向c
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高效制备液相色谱分离的洗脱相为乙腈-水混合液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反向c
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高效制备液相色谱分离中的反向c
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的粒径为5-15μm。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乙腈-水混合液包括乙腈含量逐渐增大的乙腈-水第一洗脱液、乙腈-水第二洗脱液和乙腈-水第三洗脱液，所述乙腈-水第一洗脱液中乙腈的含量为5-15(体积)％，所述乙腈-水第二洗脱液中乙腈的含量为15-85(体积)％，所述乙腈-水第三洗脱液中乙腈的含量为85-95(体积)％；优选地，所述乙腈-水第一洗脱液的洗脱时间为5-10min，所述乙腈-水第二洗脱液的洗脱时间为10-40min，所述乙腈-水第三洗脱液的洗脱时间为40-50min。8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述硅胶柱层析分离采用200-300目的硅胶；优选地，所述硅胶和所述正丁醇提取物的质量比为30-100:1，优选为50-80:1。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述硅胶柱层析分离采用的硅胶柱的高径比为10-16:1。10.权利要求1至9中任一项所述的方法提取得到的山奈酚-3-o-芸香糖苷在制备清热药物中的应用。

技术总结
本发明涉及三叶青提取领域，公开了一种从三叶青中提取山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法，包括如下步骤：(1)将三叶青地上部分和/或地下部分和乙醇-水溶液混合进行回流提纯，收集回流提取物；(2)将所述回流提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，脱除溶剂后得到正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物；(3)将所述正丁醇萃取物经硅胶柱层析分离及高效制备液相色谱分离，得到山奈酚-3-O-芸香糖苷。该方法能够有效提高山奈酚-3-O-芸香糖苷的提取效率，且得到的山奈酚-3-O-芸香糖苷纯度较高。芸香糖苷纯度较高。芸香糖苷纯度较高。


技术研发人员：郑伟龙 付永前 武承林 王雪
受保护的技术使用者：台州学院
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/9/12