一种快速实现多通路免疫荧光成像的DNA标签及其应用

一种快速实现多通路免疫荧光成像的dna标签及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫荧光技术领域，具体涉及一种快速实现多通路免疫荧光成像的dna标签及其应用。


背景技术：

2.免疫荧光成像技术基于抗体对抗原的特异性识别原理，借助荧光分子标记的抗体来识别并成像抗原靶点。对细胞或组织样本实施多靶点的同时分离成像，获取足够多的靶点特征信息，绘制蛋白质相互作用网络来研究细胞活动，对生命机理研究有重要意义。然而，样本所能成像的靶点数量却受限于可使用荧光分子的种类数量。
3.目前，商业化的荧光分子都有较宽的吸收和发射光谱，导致不同种类的荧光分子间易发生光谱重叠，若同时使用多种荧光分子则易发生窜色。受限于光谱重叠，可同时使用的荧光分子为3～5种，这大大限制了同一样本上可成像的靶点数量。因此，使用有限种类的荧光分子，实现多靶点的同时成像是我们所需要的。
4.研究显示，为了实现多靶点的同时成像，往往需要先关闭已有的荧光信号，再加入新的荧光信号，而目前的多通路成像策略在关闭荧光时涉及刺激性化学试剂的处理过程，会对样本造成不可逆转的损伤，尤其对于活细胞或活组织成像。如mxif(multiplexed fluorescence microscopy method)和cycif(cyclic immunofluorescence)，在实施多通路成像时依赖于过氧化氢等强氧化性试剂对荧光分子的淬灭；4i(iterative indirect immunofluorescence imaging)依赖于复杂刺激的抗体移除溶液elution buffer；immuno-saber(immunostaining with signal amplification by exchange reaction)依赖于有毒试剂甲酰胺；codex(co-detection by indexing)依赖于还原试剂tcep；ibex(iterative bleaching extends multiplexity)依赖于有毒试剂libh4。为摆脱对刺激性化学试剂的依赖，又有研究可以在温和的处理条件下完成荧光信号的淬灭，如dei(dna exchange imaging)和scant(single cell analysis for tumor phenotyping)利用去离子水即可完成信号消除；safe(scission-accelerated fluorophore exchange)、cad-hcr(computer-aided design of reversible hybridization chain reaction)和ccfb(color-changing fluorescent barcode)可在pbs缓冲液中关闭荧光信号。然而，在显微镜下的拍摄过程中，目前的多通路成像策略大都涉及冗长的孵育、洗涤、再孵育、再洗涤过程，整个成像周期漫长，甚至需要为显微镜安装微流体装置来提供多次的溶液交换，这不仅会对抗原靶点造成损伤、引发漂移误差，并且微流体等辅助设备的引入也不利于大多数实验室的应用。因此，研发快速、温和、免洗、成像过程简单的多通路成像策略也是我们所需要的。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明第一方面的目的，在于提供一种dna标签。
7.本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的dna标签的制备方法。
8.本发明第三方面的目的，在于提供dna标签组。
9.本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的dna标签或本发明第三方面的dna标签组的应用。
10.本发明第五方面的目的，在于提供一种多通路免疫荧光成像的方法。
11.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
12.本发明第一个方面，在于提供一种dna标签，包括b1和is两条dna单链；所述b1的核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:3或seq id no:6所示，所述is的核苷酸序列如seq id no:2、seq id no:4或seq id no:7所示。
13.优选地，所述dna标签还包括b2和qs两条dna单链。
14.优选地，所述b2的核苷酸序列如seq id no:5或seq id no:8所示。
15.优选地，所述qs的核苷酸序列如seq id no:2或seq id no:4所示。
16.优选地，所述is、b2和qs三条dna单链上含有7～20个碱基的toehold。
17.优选地，所述is的toehold的核苷酸序列为：5'-gggtagggtagtggt-3'(seq id no:15)、5'-gaaatagaatgaacg-3'(seq id no:16)或5'-ggtgaggtgtagtgg-3'(seq id no:17)。
18.优选地，所述b2的toehold的核苷酸序列为：5'-ccttaaccgacctat-3'(seq id no:18)或5'-atcctattcctctcc-3'(seq id no:19)。
19.优选地，所述qs的toehold的核苷酸序列为：5'-gggtagggtagtggt-3'(seq id no:15)、5'-gaaatagaatgaacg-3'(seq id no:16)。
20.优选地，所述is携带荧光分子，所述qs携带荧光淬灭分子。
21.优选地，所述荧光分子为fam、alexa 488、cy3或cy5中其中一种。
22.优选地，所述荧光淬灭分子能淬灭所选荧光分子。
23.本发明第二个方面，在于提供本发明第一方面的dna标签的制备方法，包括以下步骤：将dna单链按摩尔比1:(1～2)或1:(1～2):(1～2):(1～2)混合，于缓冲溶液中反应得到。
24.优选地，所述缓冲溶液为包括nacl的pbs溶液。
25.优选地，所述反应的条件为75～85℃反应5～10分钟后程序降温至20～24℃，程序降温为每分钟降低0.5～1℃。
26.本发明第三个方面，在于提供包括本发明第一方面的dna标签的dna标签组。
27.优选地，所述dna标签组还包括置换链。
28.优选地，所述置换链包括seq id no:9～seq id no:11所示的核苷酸序列。
29.本发明第四个方面，在于提供本发明第一方面的dna标签或本发明第三方面的dna标签组在(1)～(2)中任一项中的应用：
30.(1)制备用于检测多个目标蛋白靶点的产品；
31.(2)多通路免疫成像。
32.本发明第五个方面，在于提供一种多通路免疫荧光成像的方法，所述方法包括a)或b)：
33.a)使用本发明第四方面的dna标签组结合一抗对多个待检测靶标蛋白分离成像；
34.b)使用本发明第四方面的dna标签组结合二抗对多个待检测靶标蛋白分离成像。
35.优选地，所述分离成像包括以下步骤：
36.c1)使用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，得到第一个待测靶标蛋白的成像结果；
37.c2)加入置换链，反应，调节电压与激光强度，得到第二个待测靶标蛋白的成像结果；
38.c3)重复步骤c2)，依次得到相应待检测靶标蛋白的成像结果。
39.优选地，c2)中所述置换链的反应浓度为0.5～1μm；进一步为0.5～0.8μm。
40.优选地，c2)中所述置换链的反应时间为5～10分钟；进一步为5～7分钟。
41.优选地，所述a)包括a1)、a2)或a3)：
42.a1)细胞样本或组织样本进行预处理后，与多个由dna标签标记的一抗混合孵育，洗涤，分离成像；
43.a2)细胞样本或组织样本的预处理；将预处理后的细胞样本或组织样本进行内源性生物素封闭，然后再与生物素标记的一抗、链霉亲和素、生物素修饰的dna标签依次进行孵育，重复该操作，得到dna标签标记多个靶标蛋白的细胞样本或组织样本；分离成像；
44.a3)细胞样本或组织样本进行预处理后，与由dna单链标记的一抗、dna标签多聚体依次进行孵育，分离成像；
45.所述dna标签多聚体具有10～30个dna标签单体，由具有10～30个重复单元的单模板链与dna标签碱基互补反应得到；所述一抗标记的dna单链可与dna标签多聚体的碱基互补组装。
46.优选地，所述dna单链如seq id no:12所示。
47.使用生物素-链霉亲和素系统以及dna标签多聚体可提高使用一抗成像时蛋白靶点的荧光强度，也可以结合其他信号放大技术来进行一抗的标记成像。
48.优选地，a3)中所述单模板链与dna标签反应的条件为升温至75～80℃，5～8分钟后程序降温至20～24℃。
49.优选地，a3)中所述单模板链与dna标签的反应摩尔比为1:10～30。
50.优选地，a1)中所述由dna标签标记的一抗的制备方法包括以下步骤：一抗与交联剂按摩尔比1:20～60混合，第一次反应，第一次纯化；与二苯并环辛炔修饰的b1链按摩尔比1:10～20混合，第二次反应，第二次纯化；与is或is、b2和qs混合，第三次反应，第三次纯化，得到由dna标签标记的一抗。
51.进一步优选地，所述交联剂包括nhs(peg)4n3。
52.进一步优选地，所述第一次反应的条件为550～650rpm金属浴4～7℃反应2～3小时。
53.进一步优选地，所述第二次反应的条件为550～650rpm金属浴4～7℃反应8～13小时。
54.进一步优选地，所述第三次反应的条件为600～700rpm金属浴20～24℃反应2～3小时。
55.进一步优选地，采用超滤管进行纯化处理。
56.优选地，a1)中所述孵育的条件为室温孵育1～3小时或4℃孵育过夜。
57.优选地，a1)中使用封闭破膜液进行洗涤。
58.进一步优选地，所述封闭破膜液为含牛血清白蛋白、triton x-100的pbs溶液；更进一步为含2％牛血清白蛋白、0.1％triton x-100的pbs溶液。
59.a1)若多靶点同时成像，则通过链置换反应更替靶点信号，使各个蛋白靶点单独分离成像。
60.优选地，a2)中所述孵育的条件依次为室温孵育1～3小时、室温孵育0.5～1小时、室温孵育1～3小时。
61.优选地，a2)中所述的生物素标记的一抗的制备方法包括以下步骤：一抗与交联剂按摩尔比1：10～20混合，500rpm金属浴室温反应1～2小时，超滤管纯化即可。
62.进一步优选地，所述交联剂为nhs(peg)4biotin。
63.a2)若多靶点同时成像，则抗体、亲和素与dna标签应分别孵育并在之后添加生物素封闭步骤，避免生物素与链霉亲和素反应带来的信号交叉。成像时通过链置换反应更替靶点信号，使各个蛋白靶点单独分离成像。
64.优选地，所述b)具体包括如下步骤：
65.b1)细胞样本或组织样本的预处理；
66.b2)将多个待检测靶标的一抗混合物、多个修饰dna标签的二抗混合物依次作用预处理后的细胞样本，洗涤，后固定；
67.b3)分离成像。
68.优选地，b2)中所述修饰dna标签的二抗制备方法包括以下步骤：二抗与交联剂按摩尔比1:20～60混合，第一次反应，第一次纯化；与二苯并环辛炔修饰的b1链按摩尔比1:10～20混合，第二次反应，第二次纯化；与is或is、b2和qs混合，第三次反应，第三次纯化，得到修饰dna标签的二抗。
69.进一步优选地，所述交联剂包括nhs(peg)4n3。
70.进一步优选地，所述第一次反应的条件为550～650rpm金属浴4～7℃反应2～3小时。
71.进一步优选地，所述第二次反应的条件为550～650rpm金属浴4～7℃反应8～13小时。
72.进一步优选地，所述第三次反应的条件为600～700rpm金属浴20～24℃反应2～3小时。
73.进一步优选地，采用超滤管进行纯化处理。
74.优选地，b2)中将多个待检测靶标的一抗混合物、多个修饰dna标签的二抗混合物依次作用预处理后的细胞样本，作用条件为室温孵育2～3h，每次孵育完成后用封闭破膜液洗涤2～3次，然后pbs缓冲液洗涤1～2次。
75.本发明结合不同dna标签的多种抗体对细胞样本或组织切片进行多通路染色成像的原理如下：如图2，在样本上标记所有蛋白靶点后，最初状态下仅标签打开的部分蛋白靶点显示图像，对其拍摄成像后通过一步快速的链置换反应，关闭其荧光信号，同时打开另一部分蛋白的荧光信号，完成靶点间的信号交替，即可对另一部分蛋白靶点拍摄成像。置换下来、游离的is链被淬灭，不会对成像过程造成干扰，因此无需额外的洗涤步骤，且该过程仅需数分钟即可完成。基于同样的原理，经多次链置换反应，可以完成多个蛋白靶点的快速分离成像。
76.本发明的有益效果是：
77.本发明提供了可快速实现多通路免疫荧光成像的dna标签，将dna标签与抗体结合
进行蛋白靶点的标记成像，可以从时间和颜色上分离各个靶点并单独成像。经过几次快速的链置换反应，可在数分钟内完成多个蛋白靶点的分离成像。
78.利用本发明提供的dna标签标记的抗体，在数分钟内完成两次链置换反应，实现了3个(单荧光通道)或9个(三荧光通道)蛋白靶点的分离成像。理论上，设计更多的dna标签序列，借助多次的链置换反应，可以实现更多蛋白靶点的同时成像。
79.本发明提供的成像方法实现了温和、简单、免洗的多通路免疫荧光成像，无需安装复杂的辅助成像设备，整个成像过程在温和的生理条件下完成，且进行蛋白靶点信号的交替时，无需冗杂的孵育和洗涤步骤，仅需一步温和、快速的链置换反应，反应后也无需洗涤，即可在数分钟内完成不同靶点间的信号交替与拍摄成像，节省了大量的成像时间并有利于维持抗原完整性。
80.本发明中dna标签结合抗体的过程涉及两种成像方法。第一种利用dna标签标记一抗直接成像，并包含多种标记及信号增强手段；第二种则为dna标签标记二抗间接成像，相较于一抗的标记成像，该方法可以获得更强的靶点信号，但在使用时受限于抗体的种属类型。在具体实验过程中，可结合成像蛋白的靶点丰度与靶点数量选择合适的成像方法。
附图说明
81.图1为dna标签实现信号交替的原理示意图。
82.图2为dna标签结合抗体的快速多通路免疫荧光成像流程图。
83.图3为dna标签的合成结果图。
84.图4为实施例2中dna标签结合一抗对hela细胞样本上三个蛋白靶点的成像结果图，标尺均为20μm。
85.图5为实施例3中dna标签结合二抗对hela细胞样本上三个蛋白靶点的成像结果图，标尺均为20μm。
具体实施方式
86.现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
87.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
88.实施例1dna标签的设计与合成
89.发明人分别设计了label 1、label 2、label 3三种dna标签与其相应的置换链d1、d2、d3，具体序列如表1所示，其中除b1链外，其余每条链均有7～20个碱基的toehold(表1中划线部分)，dna标签可基于toehold被相应的置换链d1、d2
…
dn通过链置换反应一步步剥离，实现各标签荧光信号的打开与关闭。
90.label 1由b1和is两条dna单链组成，label 2、label 3两种dna标签由b1、is、b2、qs四条dna单链组成，is链携带荧光分子alexa 488、cy3或cy5，qs链携带淬灭分子bhq2。label 1由于其缺少qs链，不会发生荧光淬灭，因此，在标签混合物中，两条链的dna标签(label 1)可以作为起始发光物，直接用于检测。
91.信号交替原理如图1所示，label 1不含b2与qs链，因此起初仅label 1荧光打开，检测后加入置换链d1，关闭label 1并打开label 2，此时仅label 2荧光打开，检测后加入
置换链d2、d3，关闭label 2并打开label 3，此时仅label 3荧光打开。
92.dna标签的具体合成步骤如下：
93.1)将表1中所用到的dna单链粉末溶解在无酶水中，使用nanodrop定量至100μm，用于后续实验，所有dna单链均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
94.2)根据设计的dna标签结构，各dna链按摩尔比1:1(label 1)或1:1:1:1(label2和label 3)投料，各链反应浓度为1μm，反应溶剂为高盐pbs缓冲液(40ml高盐pbs缓冲液配方为：氯化钠0.234g，10
×
pbs 4ml，加水至40ml)；
95.3)上述体系升温至80℃，5分钟后程序降温至24℃，程序降温为每分钟降低0.5℃。
96.为验证dna标签是否能合成成功，发明人选用label 2相关序列设计了如下四组实验(b1；b1+is；b1+is+b2；b1+is+b2+qs)，通过上述合成步骤合成后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证，电泳测试条件为：15％分离胶，1
×
tbe电泳液，电压95v，时间55分钟。
97.结果如图3所示，4组实验合成的dna标签的分子量呈现逐级递增的趋势，表明该dna标签组装成功。label 1和label 3的验证结果同label 2，此处不在重复赘述。
98.表1各dna标签与其相应的置换链序列
[0099][0100]
实施例2
[0101]
本实施例提供一种利用生物素修饰的dna标签、链霉亲和素以及生物素修饰的一抗，借助生物素-链霉亲和素反应体系，为一抗标记dna标签的成像策略，以hela细胞为样本，单荧光通道实现三个蛋白靶点(α-tubulin、cd44和pcna)(即1种荧光分子cy3和1个成像通道，即可标记成像3个不同的蛋白靶点)的分离成像，具体如下：
[0102]
1)细胞预处理
[0103]
1.1)30 000的hela细胞在300μl dmem完全培养基中培养24小时，吸除培养基并用pbs缓冲液清洗样本，然后用4％多聚甲醛固定样本15分钟，之后用pbs缓冲液清洗样本两
次，每次3分钟，上述处理在ibidi八孔腔室载玻片中进行；
[0104]
1.2)用含100mm氯化铵的pbs溶液处理样本7分钟，之后用pbs缓冲液清洗样本两次，每次3分钟；
[0105]
1.3)用封闭破膜液(含2％牛血清白蛋白、0.1％triton x-100的pbs溶液)处理样本3次，每次10分钟；
[0106]
1.4)使用内源性生物素阻断试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号e674001)封闭细胞样本(试剂盒中的试剂a与试剂b分别室温封闭30分钟)；其中，内源性生物素阻断试剂盒中试剂主要为链霉亲和素和生物素。
[0107]
2)荧光标记
[0108]
2.1)将生物素标记的小鼠来源的抗α-tubulin抗体(购自proteintech，货号66031-1-ig)稀释在封闭破膜液(终浓度为10μg/ml)，室温孵育细胞样本1小时；
[0109]
其中，生物素标记的小鼠来源的抗α-tubulin抗体、大鼠来源的抗cd44蛋白抗体(购自thermofisher，货号ma4405)或兔子来源的抗pcna蛋白抗体(购自thermofisher，货号pa5-12448)的制备过程具体如下：分别取100μg抗α-tubulin抗体、抗cd44蛋白抗体或抗pcna蛋白抗体，用50kd的超滤管和1
×
pbs浓缩纯化抗体，离心力5000g，时间6分钟，温度15℃，重复2～3次；将抗体浓缩定量至约2mg/ml，然后与2nmol/μl的交联剂nhs(peg)4biotin按摩尔比1:10混合，在500rpm转速的金属浴室温反应1小时；反应后再用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余小分子交联剂，离心力5000g，时间6分钟，温度15℃，重复2～3次；将抗体定量至约1mg/ml，即得到生物素标记的抗α-tubulin抗体、cd44抗体或pcna抗体，4℃储存备用；
[0110]
2.2)孵育后用含0.1％ triton x-100的pbs溶液洗涤样本三次，每次5分钟；
[0111]
2.3)取200μl链霉亲和素稀释液(用封闭破膜液稀释为5μg/ml)加入到细胞样本中，室温孵育细胞样本30分钟；
[0112]
2.4)0.5μm的生物素标记的dna标签(label 1，携带cy3荧光分子，由实施例1合成制得，记为label 1-cy3)在标签缓冲液(2
×
ssc缓冲液，含0.1％的tween-20，0.2mg/ml sperm dna，10％的硫酸葡聚糖)中室温孵育样本1小时；
[0113]
其中，生物素标记的dna标签委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成得到。
[0114]
2.5)使用不同的一抗与相应的dna标签重复以上染色步骤，最终标记三个蛋白靶点：α-tubulin(label 1-cy3)，cd44(用label 2标记，携带cy3荧光分子，记为label2-cy3)，pcna(用label 3标记，携带cy3荧光分子，记为label 3-cy3)。
[0115]
3)荧光显微镜拍摄成像
[0116]
以上述过程制得的细胞样本作为观察对象，用激光共聚焦显微镜(zeiss lsm 880)进行拍摄成像，具体操作方法如下：
[0117]
3.1)全程仅需使用543nm的激光进行扫描成像；
[0118]
3.2)针孔大小调节为1au；
[0119]
3.3)根据dna标签的成像原理，此时仅label 1打开，仅α-tubulin一个蛋白靶点显示图像，调节电压与激光强度，对其拍摄成像；
[0120]
3.4)加入置换链d1(反应终浓度为0.5μm)，经5分钟的链置换反应后，α-tubulin图像消失，label 2标记的cd44图像显示，调节电压与激光强度，拍摄成像；
[0121]
3.5)加入置换链d2、d3(反应终浓度分别为0.5μm)，经5分钟的链置换反应后，cd44图像消失，label 3标记的pcna图像显示，调节电压与激光强度，拍摄成像。
[0122]
结果如图4所示，在10分钟内，无需额外的孵育和洗涤，仅使用一种荧光分子即可实现3个蛋白靶点(α-tubulin、cd44、pcna)的分离成像。
[0123]
实施例3
[0124]
本实施例提供一种利用dna标签标记二抗，以hela细胞为样本，单荧光通道实现三个蛋白靶点(α-tubulin、cd44和pcna)(即1种荧光分子cy3和1个成像通道，即可标记成像3个不同的蛋白靶点)的分离成像，具体如下：
[0125]
1)细胞预处理
[0126]
1.1)30 000的hela细胞在300μl dmem完全培养基中培养24小时，吸除培养基并用pbs缓冲液清洗样本，然后用4％多聚甲醛固定样本15分钟，之后用pbs缓冲液清洗样本两次，每次3分钟，上述处理在ibidi八孔腔室载玻片中进行；
[0127]
1.2)用含100mm氯化铵的pbs溶液处理样本7分钟，之后用pbs缓冲液清洗样本两次，每次3分钟；
[0128]
1.3)用封闭破膜液(含2％牛血清白蛋白、0.1％triton x-100的pbs溶液)处理样本3次，每次10分钟；
[0129]
2)荧光标记
[0130]
2.1)将小鼠来源的抗α-tubulin蛋白抗体(购自proteintech，货号66031-1-ig)、兔子来源的抗pcna蛋白抗体(购自thermofisher，货号pa5-12448)和大鼠来源的抗cd44蛋白抗体(购自thermofisher，货号ma4405)稀释在封闭破膜液中，各抗体的终浓度均为10μg/ml，室温孵育细胞样本3小时；
[0131]
2.2)抗体孵育后用封闭破膜液洗涤样本三次，每次10分钟，之后再用pbs缓冲液洗涤样本两次，每次5分钟；
[0132]
2.3)将修饰label 1-cy3的山羊抗大鼠二抗(购自thermofisher，货号sa5-10278)，修饰label 2-cy3的山羊抗小鼠二抗(购自thermofisher，货号31164)，修饰label 3-cy3的山羊抗兔子二抗(购自thermofisher，货号31212)稀释在孵育缓冲液(含2％牛血清白蛋白、0.1％triton x-100，0.2mg/ml sperm dna，0.05％的硫酸葡聚糖以及4mm的edta的pbs溶液)中，各抗体的终浓度均为10μg/ml，室温孵育细胞样本3小时；
[0133]
其中，修饰label 1-cy3的山羊抗大鼠二抗、修饰label 2-cy3的山羊抗小鼠二抗或修饰label 3-cy3的山羊抗兔子二抗的制备过程如下：
[0134]
取100μg抗体(山羊抗大鼠二抗、山羊抗小鼠二抗或山羊抗兔子二抗)，用50kd的超滤管和1
×
pbs浓缩纯化抗体，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复2～3次；将抗体浓缩定量至约2mg/ml，然后与2nmol/μl的交联剂nhs(peg)4n3按摩尔比1:30混合，在600rpm转速的金属浴4℃反应2小时；反应后再用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余小分子交联剂，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复2～3次；将抗体定量至约0.7mg/ml，再与二苯并环辛炔(dbco)修饰的100μm标签b1链(委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成得到)按摩尔比1:10投料，在600rpm转速的金属浴4℃反应过夜；反应后用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余的b1链，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复4～6次；最后，将修饰了b1链的抗体与3.5nmol的剩余标签组成链(is或is、b2和qs，label 1为is，label 2和
label3为is、b2和qs)反应，剩余链的反应浓度约17μm，反应溶液为含100mm氯化钠的1
×
pbs溶液，在660rpm转速的金属浴24℃反应3小时；反应后用50kd或100kd超滤管和高盐pbs缓冲液(40ml高盐pbs缓冲液配方为：氯化钠0.234g，10
×
pbs 4ml，加水至40ml)纯化抗体，除去多余dna链，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复5～6次；最终得到修饰了dna标签的二抗，即修饰label 1-cy3的山羊抗大鼠二抗、修饰label 2-cy3的山羊抗小鼠二抗或修饰label 3-cy3的山羊抗兔子二抗，4℃储存备用。经过sds-page电泳验证表明dna标签成功修饰到二抗上。
[0135]
2.4)抗体孵育后用封闭破膜液洗涤样本三次，每次10分钟，之后再用pbs缓冲液洗涤样本两次，每次5分钟；
[0136]
2.5)用1％多聚甲醛后固定细胞样本，室温孵育10分钟，之后用pbs缓冲液洗涤样本3次，每次5分钟；最终得到标记三个蛋白靶点cd44(label 1-cy3)、α-tubulin(label 2-cy3)和pcna(label 3-cy3)的细胞样本。
[0137]
3)荧光显微镜拍摄成像
[0138]
以上述过程制得的样本作为观察对象，用激光共聚焦显微镜(zeiss lsm 880)进行拍摄成像，具体操作方法如下：
[0139]
3.1)全程仅需使用543nm的激光进行扫描成像；
[0140]
3.2)针孔大小调节为1au；
[0141]
3.3)根据dna标签的成像原理，此时仅label 1打开，仅cd44一个蛋白靶点显示图像，调节电压与激光强度，对其拍摄成像；
[0142]
3.4)加入置换链d1，反应浓度为0.5μm，经5分钟的链置换反应后，cd44图像消失，label 2标记的α-tubulin图像显示，调节电压与激光强度，拍摄成像；
[0143]
3.5)加入置换链d2、d3，反应浓度为0.5μm，经5分钟的链置换反应后，α-tubulin图像消失，label 3标记的pcna图像显示，调节电压与激光强度，拍摄成像；
[0144]
如图5所示，在10分钟内，无需额外的孵育和洗涤，仅使用一种荧光分子即可实现3个蛋白靶点(cd44、α-tubulin、pcna)的分离成像。
[0145]
实施例4
[0146]
本实施例提供一种利用点击化学反应直接为一抗标记dna标签的成像策略，以hela细胞为样本，单荧光通道实现三个蛋白靶点(α-tubulin、cd44和pcna)(即1种荧光分子cy3和1个成像通道，即可标记成像3个不同的蛋白靶点)的分离成像，具体如下：
[0147]
1)细胞预处理：同实施例3；
[0148]
2)荧光标记
[0149]
2.1)将label 1-cy3标记的α-tubulin、label 2-cy3标记的cd44和label 3-cy3标记的pcna稀释在孵育缓冲液中，终浓度为10μg/ml，室温孵育细胞3小时或4℃孵育过夜；
[0150]
其中，dna标签标记一抗的具体过程如下：
[0151]
取100μg抗体(cd44、α-tubulin、pcna)，用50kd的超滤管和1
×
pbs浓缩纯化抗体，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复2～3次；将抗体浓缩定量至约2mg/ml，然后与2nmol/μl的交联剂nhs(peg)4n3按摩尔比1:30投料，在600rpm转速的金属浴4℃反应2小时；反应后再用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余小分子交联剂，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复2～3次；将抗体定量至约0.7mg/ml，再与dbco修饰的100μm标签b1链按
摩尔比1:10投料，在600rpm转速的金属浴4℃反应过夜；反应后用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余的b1链，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复4～6次；最后，将修饰了b1链的抗体与3.5nmol的剩余标签组成链(is或is、b2和qs，label 1为is，label 2和label 3为is、b2和qs)反应，剩余链的反应浓度约17μm，反应溶液为含100mm氯化钠的1
×
pbs溶液，在660rpm转速的金属浴24℃反应3小时；反应后用50kd或100kd超滤管和高盐pbs缓冲液纯化抗体，除去多余dna链，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复5～6次；最终得到修饰了dna标签的一抗，即label 1-cy3标记的α-tubulin、label 2-cy3标记的cd44和label 3-cy3标记的pcna，4℃储存备用。
[0152]
2.2)抗体孵育后用封闭破膜液洗涤样本三次，每次10分钟，之后再用pbs缓冲液洗涤样本两次，每次5分钟；
[0153]
3)荧光显微镜拍摄成像
[0154]
同实施例2。
[0155]
结果显示，在10分钟内，无需额外的孵育和洗涤，仅使用一种荧光分子即可实现3个蛋白靶点(α-tubulin、cd44、pcna)的分离成像。
[0156]
实施例5
[0157]
本实施例提供利用引物交换反应(per)合成具有多个重复单元的dna标签多聚体，并通过点击化学反应为一抗修饰特定序列的dna单链，经碱基互补配对，为一抗标记dna标签的成像策略，以hela细胞为样本，单荧光通道实现三个蛋白靶点(α-tubulin、cd44和pcna)(即1种荧光分子cy3和1个成像通道，即可标记成像3个不同的蛋白靶点)的分离成像，具体如下：
[0158]
1)细胞预处理：同实施例3；
[0159]
2)荧光标记
[0160]
2.1)将特定序列dna单链标记的一抗稀释在孵育缓冲液中，终浓度为10μg/ml，室温孵育细胞3小时或4℃孵育过夜；
[0161]
其中，特定序列dna单链标记一抗的具体过程如下：
[0162]
取100μg抗体(α-tubulin、cd44或pcna)，用50kd的超滤管和1
×
pbs浓缩纯化抗体，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复2～3次；将抗体浓缩定量至约2mg/ml，然后与2nmol/μl的交联剂nhs(peg)4n3按摩尔比1:30投料，在600rpm转速的金属浴4℃反应2小时；反应后再用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余小分子交联剂，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复2～3次；将抗体定量至约0.7mg/ml，再与dbco修饰的100μm特定序列的dna单链(5
’‑
gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag-dbco-3’(seq id no:12))按摩尔比1:10投料，在600rpm转速的金属浴4℃反应过夜；反应后用50kd的超滤管和1
×
pbs纯化抗体，除去多余的dna单链，离心力5000g，时间6分钟，温度4℃，重复4～6次，得到特定序列dna单链标记的一抗，4℃储存备用。
[0163]
2.4)抗体孵育完成后，将dna标签多聚体稀释在标签缓冲液(终浓度为0.1μm)中，室温孵育细胞1～3小时；
[0164]
其中，dna标签多聚体的合成过程具体如下：
[0165]
引物交换反应合成具有10～30个重复单元的单模板链，反应体系为：0.15μm的发夹模板hairpin，100nm的clean.g，600μm的dntp，1000u/ml的dna聚合酶，10mm的硫酸镁，1μm
的引物链，1
×
pbs，共100μl。反应条件为：37℃反应3小时，之后升温至80℃反应20分钟，最后降至室温，得到单模板链。将单模板链与dna标签链(由实施例1合成制得)按摩尔比1:10～30投料，反应条件为：升温至80℃，5分钟后程序降温至24℃，降温时间约1小时，得到dna标签多聚体，4℃储存备用。
[0166]
发夹模板hairpin的核苷酸序列如下：
[0167]
5'-accaataatagggccttttggccctattattggttattattgg-invdt-3'(seq id no:13)；
[0168]
引物链的核苷酸序列如下：5'-ccaataata-3'；
[0169]
clean.g的核苷酸序列如下：
[0170]
5'-ccccgaaagtggcctcgggccttttggcccgaggccactttcg-3'(seq id no:14)。
[0171]
3)荧光显微镜拍摄成像
[0172]
同实施例2。
[0173]
结果显示，在10分钟内，无需额外的孵育和洗涤，仅使用一种荧光分子即可实现3个蛋白靶点(α-tubulin、cd44、pcna)的分离成像。
[0174]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.一种dna标签，包括b1和is两条dna单链；所述b1的核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:3或seq id no:6所示，所述is的核苷酸序列如seq id no:2、seq id no:4或seq id no:7所示。2.根据权利要求1所述的dna标签，其特征在于，所述dna标签还包括b2和qs两条dna单链；优选地，所述b2的核苷酸序列如seq id no:5或seq id no:8所示；优选地，所述qs的核苷酸序列如seq id no:2或seq id no:4所示；优选地，所述is携带荧光分子，所述qs携带荧光淬灭分子。3.权利要求1或2所述的dna标签的制备方法，包括以下步骤：将dna单链按摩尔比1:(1～2)或1:(1～2):(1～2):(1～2)混合，于缓冲溶液中反应得到；优选地，所述缓冲溶液为包括nacl的pbs溶液；优选地，所述反应的条件为75～85℃反应5～10分钟后程序降温至20～24℃，程序降温为每分钟降低0.5～1℃。4.dna标签组，包括权利要求1或2所述的dna标签；优选地，所述dna标签组还包括置换链；优选地，所述置换链包括seq id no:9～seq id no:11所示的核苷酸序列。5.权利要求1或2所述的dna标签或权利要求4所述的dna标签组在(1)～(2)中任一项中的应用：(1)制备用于检测多个目标蛋白靶点的产品；(2)多通路免疫成像。6.一种多通路免疫荧光成像的方法，其特征在于，所述方法包括a)或b)：a)使用权利要求4所述的dna标签组结合一抗对多个待检测靶标蛋白分离成像；b)使用权利要求4所述的dna标签组结合二抗对多个待检测靶标蛋白分离成像；优选地，所述分离成像包括以下步骤：c1)使用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，得到第一个待测靶标蛋白的成像结果；c2)加入置换链，反应，调节电压与激光强度，得到第二个待测靶标蛋白的成像结果；c3)重复步骤c2)，依次得到相应待检测靶标蛋白的成像结果。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述a)包括a1)、a2)或a3)：a1)细胞样本或组织样本进行预处理后，与多个由dna标签标记的一抗混合孵育，洗涤，分离成像；a2)细胞样本或组织样本的预处理；将预处理后的细胞样本或组织样本进行内源性生物素封闭，然后再与生物素标记的一抗、链霉亲和素、生物素修饰的dna标签依次进行孵育，重复该操作，得到dna标签标记多个靶标蛋白的细胞样本或组织样本；分离成像；a3)细胞样本或组织样本进行预处理后，与由dna单链标记的一抗、dna标签多聚体依次进行孵育，分离成像；所述dna标签多聚体具有10～30个dna标签单体，由具有10～30个重复单元的单模板链与dna标签碱基互补反应得到；所述一抗标记的dna单链可与dna标签多聚体的碱基互补组装；优选地，所述单模板链与dna标签反应的条件为升温至75～80℃，5～8分钟后程序降温
至20～24℃；优选地，所述单模板链与dna标签的反应摩尔比为1:10～30。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述b)具体包括如下步骤：b1)细胞样本或组织样本的预处理；b2)将多个待检测靶标的一抗混合物、多个修饰dna标签的二抗混合物依次作用预处理后的细胞样本，洗涤，后固定；b3)分离成像。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，b2)中所述修饰dna标签的二抗制备方法包括以下步骤：抗体蛋白与交联剂按摩尔比1:20～60混合，第一次反应，第一次纯化；与二苯并环辛炔修饰的b1链按摩尔比1:10～20混合，第二次反应，第二次纯化；与is或is、b2和qs混合，第三次反应，第三次纯化，得到修饰dna标签的二抗；优选地，所述交联剂包括nhs(peg)4n3；优选地，所述第一次反应的条件为550～650rpm金属浴4～7℃反应2～3小时。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，c2)中所述置换链的反应浓度为0.5～1μm；优选地，细胞样品的预处理方法包括以下步骤：用多聚甲醛、含有氯化铵的pbs溶液、含有牛血清白蛋白和triton x-100的pbs溶液依次处理细胞样品；优选地，所述分离成像的过程亦可结合多色通道，再从颜色加以区分，提高整体成像效率。

技术总结
本发明属于免疫荧光技术领域，公开了一种快速实现多通路免疫荧光成像的DNA标签及其应用，具体公开了一种DNA标签，包括B1和IS两条DNA单链；所述B1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示，所述IS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7所示。本发明提供了可快速实现多通路免疫荧光成像的DNA标签，将DNA标签与抗体结合进行蛋白靶点的标记成像，可以从时间和颜色上分离各个靶点并单独成像。经过几次快速的链置换反应，可在数分钟内完成多个蛋白靶点的分离成像。像。


技术研发人员：石鹏 吕宇恒
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/9/12