一种无血清细胞培养基及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种无血清细胞培养基及采用该无血清细胞培养基进行细胞培养的方法。


背景技术：

2.随着生物技术的飞速发展，单克隆抗体、细胞因子、疫苗和各种生物活性蛋白等生物制品在诊断和治疗中应用日益广泛，其需求量大大增加，因此，通过体外大规模培养动物细胞生产生物制品技术的研究越来越受到青睐。
3.传统血清培养基主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。然而血清的使用也存在诸多弊端，首先，血清是非常复杂的混合物，目前对其明确的成分、含量及作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来很多困难；其次，血清都是批量生产，各批次间差异很大，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制，血清的使用也使得试验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。
4.无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基，与传统培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他动物提取成分，但仍可满足细胞在体外较长时间生长和繁殖，且成分清晰，便于后续试验和生产的标准化。目前市场上的无血清培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质，大多采用葡萄糖作为能量来源，效果参差不齐且价格昂贵，在保存和应用上不如传统培养基方便。本发明经过研究发现，通过d-核糖与葡萄糖联合供能，可在细胞对数生长和快速增殖时，为细胞提供更加持续长久的能量供应，同时添加大豆激素和中药成分可促进细胞快速生长和增殖，从而提升生物制品产量和质量稳定性，获得更大经济效益，且制成的培养基可常温保存，便于运输和储存。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种无血清细胞培养基，化学成分明确，能够显著提高细胞培养效率或生产持续时间，为生物制品的规模化生产提供方便。
6.为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种无血清细胞培养基，包括氨基酸组分、维生素组分、碳水化合物组分、微量元素组分、无机盐组分及其他分子化合物组分，其中，所述氨基酸组分包括以下成分：l-组氨酸
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5~20 mg/ll-亮氨酸
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10~30 mg/ll-异亮氨酸
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15~35 mg/l
l-苯丙氨酸
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5~15 mg/ll-赖氨酸
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20~50 mg/ll-半胱氨酸
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10~20 mg/l甘氨酸
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10~50 mg/ll-天冬酰胺
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10~50 mg/ll-谷氨酸
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1~10 mg/ll-丙氨酰-l-谷氨酰胺
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1~10 mg/ll-色氨酸
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5~20 mg/ll-精氨酸
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10~100 mg/ll-酪氨酸
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5~20 mg/ll-天冬氨酸
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10~30 mg/ll-胱氨酸
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10~30 mg/ll-蛋氨酸
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3~10 mg/l所述维生素组分包括以下成分：维生素a
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1~15 mg/l维生素b1
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0.5~5 mg/l维生素b2
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0.1~1 mg/l维生素b3
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0.1~1 mg/l维生素b6
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0.5~5 mg/l维生素b7
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0.05~2 mg/l维生素b9
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2~20 mg/l维生素b15
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0.3~5 mg/l维生素c
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0.5~5 mg/l维生素e
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1.8~9.4 mg/l肌醇
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5~35 mg/l泛酸钙
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1~10 mg/l所述碳水化合物组分包括以下成分：葡萄糖
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1500~3500 mg/ld-核糖
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1000~3000 mg/l腐胺
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0.05~5 mg/l乙醇胺
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10~20 mg/l亚油酸
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0.05~0.5 mg/l所述微量元素组分包括以下成分：五水合硫酸铜
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0.05~0.5 mg/l七水合硫酸锌
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0.5~5 mg/l七水合硫酸亚铁
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0.5~10 mg/l氯化钴
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0.01~0.1 mg/l亚硒酸钠
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0.01~1 mg/l所述无机盐组分包括以下成分：
碳酸氢钠
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1000~3000 mg/l氯化镁
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20~200 mg/l氯化钠
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500~2000 mg/l氯化钾
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100~250 mg/l所述其他分子化合物组分包括以下成分：豆甾醇
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20~50 mg/l黄酮醇
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20~50 mg/l大豆异黄酮
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10~20 mg/l胰岛素
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0.1~10 mg/l皮质醇
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0.1~20 mg/l表皮生长因子
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0.1~10 mg/ledta二钠
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0.1~10 mg/l转铁蛋白
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10~20 mg/l蜂胶黄酮
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1~10 mg/l淫羊藿黄酮
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1~10 mg/l优选的，所述的一种无血清细胞培养基，包括：氨基酸组分为：l-组氨酸5mg/l，l-亮氨酸10mg/l ，l-异亮氨酸15mg/l，l-苯丙氨酸5mg/l，l-赖氨酸20mg/l，l-半胱氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，l-天冬酰胺10mg/l，l-谷氨酸1mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺1mg/l，l-色氨酸5mg/l，l-精氨酸10mg/l，l-酪氨酸5mg/l，l-天冬氨酸10mg/l，l-胱氨酸10mg/l，l-蛋氨酸3mg/l。
7.维生素组分为：维生素a 1mg/l，维生素b1 0.5mg/l，维生素b2 0.1mg/l，维生素b3 0.1mg/l，维生素b6 0.5mg/l，维生素b7 0.05mg/l，维生素b9 2mg/l，维生素b15 0.3mg/l，维生素c 0.5mg/l，维生素e 1.8mg/l，肌醇5mg/l，泛酸钙1mg/l。
8.碳水化合物组分为：葡萄糖1500mg/l，d-核糖1000mg/l，腐胺0.05mg/l，乙醇胺10mg/l，亚油酸0.05mg/l。
9.微量元素组份为：五水合硫酸铜0.05mg/l，七水合硫酸锌0.5mg/l，七水合硫酸亚铁0.5mg/l，氯化钴0.01mg/l，亚硒酸钠0.01mg/l。
10.无机盐组分为：碳酸氢钠1000mg/l，氯化镁20mg/l，氯化钠500mg/l，氯化钾100mg/l。
11.其他分子化合物组分为：豆甾醇20mg/l，黄酮醇20mg/l，大豆异黄酮10mg/l，胰岛素0.1mg/l，皮质醇0.1mg/l，表皮生长因子0.1mg/l，edta二钠0.1mg/l，转铁蛋白10mg/l，蜂胶黄酮1mg/l，淫羊藿黄酮1mg/l。
12.优选的，所述的一种无血清细胞培养基，包括：氨基酸组分为：l-组氨酸15mg/l，l-亮氨酸20mg/l ，l-异亮氨酸25mg/l，l-苯丙氨酸10mg/l，l-赖氨酸35mg/l，l-半胱氨酸15mg/l，甘氨酸15mg/l，l-天冬酰胺30mg/l，l-谷氨酸5mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺5mg/l，l-色氨酸10mg/l，l-精氨酸50mg/l，l-酪氨酸12mg/l，l-天冬氨酸20mg/l，l-胱氨酸20mg/l，l-蛋氨酸6mg/l。
13.维生素组分为：维生素a 8mg/l，维生素b1 2.5mg/l，维生素b2 0.5mg/l，维生素b3 0.5mg/l，维生素b6 2.5mg/l，维生素b7 1mg/l，维生素b9 10mg/l，维生素b15 2.5mg/l，维
生素c 2.5mg/l，维生素e 5.6mg/l，肌醇20mg/l，泛酸钙5mg/l。
14.碳水化合物组分为：葡萄糖2500mg/l，d-核糖2000mg/l，腐胺2.5mg/l，乙醇胺15mg/l，亚油酸0.25mg/l。
15.微量元素组份为：五水合硫酸铜0.25mg/l，七水合硫酸锌2.5mg/l，七水合硫酸亚铁5mg/l，氯化钴0.05mg/l，亚硒酸钠0.5mg/l。
16.无机盐组分为：碳酸氢钠2000mg/l，氯化镁100mg/l，氯化钠1200mg/l，氯化钾175mg/l。
17.其他分子化合物组分为：豆甾醇35mg/l，黄酮醇35mg/l，大豆异黄酮15mg/l，胰岛素5mg/l，皮质醇10mg/l，表皮生长因子5mg/l，edta二钠5mg/l，转铁蛋白15mg/l，蜂胶黄酮5mg/l，淫羊藿黄酮5mg/l。
18.优选的，所述的一种无血清细胞培养基，包括：氨基酸组分为：l-组氨酸20mg/l，l-亮氨酸30mg/l ，l-异亮氨酸35mg/l，l-苯丙氨酸15mg/l，l-赖氨酸50mg/l，l-半胱氨酸20mg/l，甘氨酸50mg/l，l-天冬酰胺50mg/l，l-谷氨酸10mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺10mg/l，l-色氨酸20mg/l，l-精氨酸100mg/l，l-酪氨酸20mg/l，l-天冬氨酸30mg/l，l-胱氨酸30mg/l，l-蛋氨酸10mg/l。
19.维生素组分为：维生素a 15mg/l，维生素b1 5mg/l，维生素b2 1mg/l，维生素b3 1mg/l，维生素b6 5mg/l，维生素b7 2mg/l，维生素b9 20mg/l，维生素b15 5mg/l，维生素c 5mg/l，维生素e 9.4mg/l，肌醇35mg/l，泛酸钙10mg/l。
20.碳水化合物组分为：葡萄糖3500mg/l，d-核糖3000mg/l，腐胺5mg/l，乙醇胺20mg/l，亚油酸0.5mg/l。
21.微量元素组份为：五水合硫酸铜0.5mg/l，七水合硫酸锌5mg/l，七水合硫酸亚铁10mg/l，氯化钴0.1mg/l，亚硒酸钠1mg/l。
22.无机盐组分为：碳酸氢钠3000mg/l，氯化镁200mg/l，氯化钠2000mg/l，氯化钾250mg/l。
23.其他分子化合物组分为：豆甾醇50mg/l，黄酮醇50mg/l，大豆异黄酮20mg/l，胰岛素10mg/l，皮质醇20mg/l，表皮生长因子10mg/l，edta二钠10mg/l，转铁蛋白20mg/l，蜂胶黄酮10mg/l，淫羊藿黄酮10mg/l。
24.优选的，上述任一所述无血清细胞培养基在细胞培养中的应用，包括：在装有细胞的培养容器内加入上述任一所述培养基，于37℃条件下培养即可。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的无血清细胞培养基与传统培养基相比，不含血清、成分清晰、成本低廉，避免了因使用血清带来的生物安全风险和批次差异；其次，本发明的培养基通过d-核糖与葡萄糖联合供能，可在细胞对数生长和快速增殖时，为细胞提供更加持续长久的能量供应，细胞生长速度更快，代谢旺盛，细胞活力强。与传统培养基相比，本发明培养基中的细胞蛋白表达量更高，且细胞内毒素较低，可实现更大经济效益。此外，本发明提供的培养基可室温保存，便于运输和储存。
附图说明
26.图1是cho细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基1、2进行批次补料培
养的活细胞密度对比图；图2是cho细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基1、2进行批次补料培养的细胞活率对比图；
实施方式实施例
27.本实施例提供一种无血清细胞培养基，该培养基包括氨基酸组分、维生素组分、碳水化合物组分、微量元素组分、无机盐组分及其他分子化合物组分，其中，氨基酸组分为：l-组氨酸5mg/l，l-亮氨酸10mg/l ，l-异亮氨酸15mg/l，l-苯丙氨酸5mg/l，l-赖氨酸20mg/l，l-半胱氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，l-天冬酰胺10mg/l，l-谷氨酸1mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺1mg/l，l-色氨酸5mg/l，l-精氨酸10mg/l，l-酪氨酸5mg/l，l-天冬氨酸10mg/l，l-胱氨酸10mg/l，l-蛋氨酸3mg/l。
28.维生素组分为：维生素a 1mg/l，维生素b1 0.5mg/l，维生素b2 0.1mg/l，维生素b3 0.1mg/l，维生素b6 0.5mg/l，维生素b7 0.05mg/l，维生素b9 2mg/l，维生素b15 0.3mg/l，维生素c 0.5mg/l，维生素e 1.8mg/l，肌醇5mg/l，泛酸钙1mg/l。
29.碳水化合物组分为：葡萄糖1500mg/l，d-核糖1000mg/l，腐胺0.05mg/l，乙醇胺10mg/l，亚油酸0.05mg/l。
30.微量元素组份为：五水合硫酸铜0.05mg/l，七水合硫酸锌0.5mg/l，七水合硫酸亚铁0.5mg/l，氯化钴0.01mg/l，亚硒酸钠0.01mg/l。
31.无机盐组分为：碳酸氢钠1000mg/l，氯化镁20mg/l，氯化钠500mg/l，氯化钾100mg/l。
32.其他分子化合物组分为：豆甾醇20mg/l，黄酮醇20mg/l，大豆异黄酮10mg/l，胰岛素0.1mg/l，皮质醇0.1mg/l，表皮生长因子0.1mg/l，edta二钠0.1mg/l，转铁蛋白10mg/l，蜂胶黄酮1mg/l，淫羊藿黄酮1mg/l。
实施例
33.本实施例提供一种无血清细胞培养基，该培养基包括氨基酸组分、维生素组分、碳水化合物组分、微量元素组分、无机盐组分及其他分子化合物组分，其中，氨基酸组分为：l-组氨酸15mg/l，l-亮氨酸20mg/l ，l-异亮氨酸25mg/l，l-苯丙氨酸10mg/l，l-赖氨酸35mg/l，l-半胱氨酸15mg/l，甘氨酸15mg/l，l-天冬酰胺30mg/l，l-谷氨酸5mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺5mg/l，l-色氨酸10mg/l，l-精氨酸50mg/l，l-酪氨酸12mg/l，l-天冬氨酸20mg/l，l-胱氨酸20mg/l，l-蛋氨酸6mg/l。
34.维生素组分为：维生素a 8mg/l，维生素b1 2.5mg/l，维生素b2 0.5mg/l，维生素b3 0.5mg/l，维生素b6 2.5mg/l，维生素b7 1mg/l，维生素b9 10mg/l，维生素b15 2.5mg/l，维生素c 2.5mg/l，维生素e 5.6mg/l，肌醇20mg/l，泛酸钙5mg/l。
35.碳水化合物组分为：葡萄糖2500mg/l，d-核糖2000mg/l，腐胺2.5mg/l，乙醇胺15mg/l，亚油酸0.25mg/l。
36.微量元素组份为：五水合硫酸铜0.25mg/l，七水合硫酸锌2.5mg/l，七水合硫酸亚
铁5mg/l，氯化钴0.05mg/l，亚硒酸钠0.5mg/l。
37.无机盐组分为：碳酸氢钠2000mg/l，氯化镁100mg/l，氯化钠1200mg/l，氯化钾175mg/l。
38.其他分子化合物组分为：豆甾醇35mg/l，黄酮醇35mg/l，大豆异黄酮15mg/l，胰岛素5mg/l，皮质醇10mg/l，表皮生长因子5mg/l，edta二钠5mg/l，转铁蛋白15mg/l，蜂胶黄酮5mg/l，淫羊藿黄酮5mg/l。
实施例
39.本实施例提供一种无血清细胞培养基，该培养基包括氨基酸组分、维生素组分、碳水化合物组分、微量元素组分、无机盐组分及其他分子化合物组分，其中，氨基酸组分为：l-组氨酸20mg/l，l-亮氨酸30mg/l，l-异亮氨酸35mg/l，l-苯丙氨酸15mg/l，l-赖氨酸50mg/l，l-半胱氨酸20mg/l，甘氨酸50mg/l，l-天冬酰胺50mg/l，l-谷氨酸10mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺10mg/l，l-色氨酸20mg/l，l-精氨酸100mg/l，l-酪氨酸20mg/l，l-天冬氨酸30mg/l，l-胱氨酸30mg/l，l-蛋氨酸10mg/l。
40.维生素组分为：维生素a15mg/l，维生素b15mg/l，维生素b21mg/l，维生素b31mg/l，维生素b65mg/l，维生素b72mg/l，维生素b920mg/l，维生素b155mg/l，维生素c5mg/l，维生素e9.4mg/l，肌醇35mg/l，泛酸钙10mg/l。
41.碳水化合物组分为：葡萄糖3500mg/l，d-核糖3000mg/l，腐胺5mg/l，乙醇胺20mg/l，亚油酸0.5mg/l。
42.微量元素组份为：五水合硫酸铜0.5mg/l，七水合硫酸锌5mg/l，七水合硫酸亚铁10mg/l，氯化钴0.1mg/l，亚硒酸钠1mg/l。
43.无机盐组分为：碳酸氢钠3000mg/l，氯化镁200mg/l，氯化钠2000mg/l，氯化钾250mg/l。
44.其他分子化合物组分为：豆甾醇50mg/l，黄酮醇50mg/l，大豆异黄酮20mg/l，胰岛素10mg/l，皮质醇20mg/l，表皮生长因子10mg/l，edta二钠10mg/l，转铁蛋白20mg/l，蜂胶黄酮10mg/l，淫羊藿黄酮10mg/l。
45.实施例4实验用培养基的配制将1l用量的培养基各组分加入800ml超纯水中，室温搅拌30min，至各组分全部溶解，用新鲜配制的1m盐酸或氢氧化钠溶液调节ph值到7.0~7.3，然后用0.22μm无菌滤膜正压过滤除菌，室温保存备用。
46.具体实验用培养基的配制为：将1l用量的实施例1的培养基各组分加入800ml超纯水中，室温搅拌30min，至各组分全部溶解，用新鲜配制的1m盐酸或氢氧化钠溶液调节ph值到7.1，然后用0.22μm无菌滤膜正压过滤除菌，室温保存备用，标记为培养基1。
47.按同样的配制方法，配制实施例2的培养基，标记为培养基2。
48.按同样的配制方法，配制实施例3的培养基，标记为培养基3。
49.商品化培养基dmem（购自gibco）添加10%胎牛血清作为对照培养基1。
50.商品化培养基sfm（购自gibco）作为对照培养基2。
实施例
51.取5个t75flask细胞培养瓶，分别加入培养基1、2、3和对照培养基1、2；将复苏的vero细胞株分别接种上述5个培养瓶中，接种密度为1
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104个/cm2，37℃，5%co2，培养4天后，将细胞消化，1ml胰酶终止液终止消化并收集细胞。观察细胞形态，用cedexas-20细胞密度和活力自动分析仪计数每种培养基下平均细胞密度和活力，并采用细胞内毒素检测仪检测细胞内毒素含量。
52.结果显示：培养基1、2、3的细胞密度和细胞活力明显优于对照培养基1、2，细胞的扩增能力可达到对照培养基1、2的3倍，细胞生长状态更好，活力更高；培养基1、2、3中细胞内毒素含量与对照培养基1、2相比降低3/5~4/5。见表1。
53.表1培养基细胞密度（
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106个/ml）细胞活力（%）内毒素含量（eu/ml）培养基13.87991.17培养基23.94991.05培养基33.85991.21对照培养基11.23875.24对照培养基21.04854.96
实施例
54.本实施例以表达t-pa的cho细胞为研究对象，通过检测活细胞密度、细胞活率以及表达t-pa蛋白含量的方式，对本发明提供培养基与对照培养基进行效果评价，具体培养方式如下：6.1将表达t-pa的cho细胞株以1
×
106个/ml的密度分别接种至含30ml培养基1、2、3的三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5%co2的摇床中37℃培养，转速120rpm，然后每天取培养体积30%，即9ml的细胞培养液，300g离心5min，丢弃上清，分别用9ml新的培养基1、2、3重悬细胞，然后各自添加到原培养瓶中继续培养至32天。
55.6.2将表达t-pa的cho细胞株以1
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106个/ml的密度分别接种至含30ml对照培养基1、2的三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5%co2的摇床中37℃培养，转速120rpm，培养的第3、5、7、9、11、13和15天，分别添加初始培养体积5%的celsourcecho细胞补料培养基。
56.6.3结果6.3.1图1是cho细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基1、2进行批次补料培养的活细胞密度对比，结果表明，培养基1、2、3相较于对照培养基批次补料培养，能够使cho细胞持续更长时间的高密度生长（32天），其中培养基2的效果最优。
57.6.3.2图2是cho细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基1、2进行批次补料培养的细胞活率对比，结果表明，培养基1、2、3相较于对照培养基批次补料培养，能够使cho细胞维持更长时间的高活率生长，第32天细胞活率大于90%，其中培养基2的效果最优。
58.6.3.3表2是cho细胞使用培养基1、2、3进行灌流培养与对照培养基1、2进行批次补料培养的t-pa蛋白表达量对比，结果表明，培养基1、2、3相较于对照培养基批次补料培养，细胞t-pa蛋白表达量更高（3倍），且产量更稳定，其中培养基2的效果最优。
59.表2以上通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

技术特征：
1.一种无血清细胞培养基，包括氨基酸组分、维生素组分、碳水化合物组分、微量元素组分、无机盐组分及其他分子化合物组分，其特征在于，所述氨基酸组分包括以下成分：所述维生素组分包括以下成分：
所述碳水化合物组分包括以下成分：所述微量元素组分包括以下成分：所述无机盐组分包括以下成分：所述其他分子化合物组分包括以下成分：
2.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述培养基配方如下：氨基酸组分为：l-组氨酸5mg/l，l-亮氨酸10mg/l ，l-异亮氨酸15mg/l，l-苯丙氨酸5mg/l，l-赖氨酸20mg/l，l-半胱氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，l-天冬酰胺10mg/l，l-谷氨酸1mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺1mg/l，l-色氨酸5mg/l，l-精氨酸10mg/l，l-酪氨酸5mg/l，l-天冬氨酸10mg/l，l-胱氨酸10mg/l，l-蛋氨酸3mg/l。维生素组分为：维生素a 1mg/l，维生素b1 0.5mg/l，维生素b2 0.1mg/l，维生素b3 0.1mg/l，维生素b6 0.5mg/l，维生素b7 0.05mg/l，维生素b9 2mg/l，维生素b15 0.3mg/l，维生素c 0.5mg/l，维生素e 1.8mg/l，肌醇5mg/l，泛酸钙1mg/l。碳水化合物组分为：葡萄糖1500mg/l，d-核糖1000mg/l，腐胺0.05mg/l，乙醇胺10mg/l，亚油酸0.05mg/l。微量元素组份为：五水合硫酸铜0.05mg/l，七水合硫酸锌0.5mg/l，七水合硫酸亚铁0.5mg/l，氯化钴0.01mg/l，亚硒酸钠0.01mg/l。无机盐组分为：碳酸氢钠1000mg/l，氯化镁20mg/l，氯化钠500mg/l，氯化钾100mg/l。其他分子化合物组分为：豆甾醇20mg/l，黄酮醇20mg/l，大豆异黄酮10mg/l，胰岛素0.1mg/l，皮质醇0.1mg/l，表皮生长因子0.1mg/l，edta二钠0.1mg/l，转铁蛋白10mg/l，蜂胶黄酮1mg/l，淫羊藿黄酮1mg/l。其他分子化合物组分为：豆甾醇20mg/l，黄酮醇20mg/l，大豆异黄酮10mg/l，胰岛素0.1mg/l，皮质醇0.1mg/l，表皮生长因子0.1mg/l，edta二钠0.1mg/l，转铁蛋白10mg/l，蜂胶黄酮1mg/l，淫羊藿黄酮1mg/l。3.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述培养基配方如下：氨基酸组分为：l-组氨酸15mg/l，l-亮氨酸20mg/l ，l-异亮氨酸25mg/l，l-苯丙氨酸10mg/l，l-赖氨酸35mg/l，l-半胱氨酸15mg/l，甘氨酸15mg/l，l-天冬酰胺30mg/l，l-谷氨酸5mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺5mg/l，l-色氨酸10mg/l，l-精氨酸50mg/l，l-酪氨酸12mg/l，l-天冬氨酸20mg/l，l-胱氨酸20mg/l，l-蛋氨酸6mg/l。维生素组分为：维生素a 8mg/l，维生素b1 2.5mg/l，维生素b2 0.5mg/l，维生素b3 0.5mg/l，维生素b6 2.5mg/l，维生素b7 1mg/l，维生素b9 10mg/l，维生素b15 2.5mg/l，维生素c 2.5mg/l，维生素e 5.6mg/l，肌醇20mg/l，泛酸钙5mg/l。碳水化合物组分为：葡萄糖2500mg/l，d-核糖2000mg/l，腐胺2.5mg/l，乙醇胺15mg/l，亚油酸0.25mg/l。微量元素组份为：五水合硫酸铜0.25mg/l，七水合硫酸锌2.5mg/l，七水合硫酸亚铁5mg/l，氯化钴0.05mg/l，亚硒酸钠0.5mg/l。无机盐组分为：碳酸氢钠2000mg/l，氯化镁100mg/l，氯化钠1200mg/l，氯化钾175mg/l。其他分子化合物组分为：豆甾醇35mg/l，黄酮醇35mg/l，大豆异黄酮15mg/l，胰岛素5mg/l，皮质醇10mg/l，表皮生长因子5mg/l，edta二钠5mg/l，转铁蛋白15mg/l，蜂胶黄酮5mg/l，淫羊藿黄酮5mg/l。4.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述培养基配方如下：
氨基酸组分为：l-组氨酸20mg/l，l-亮氨酸30mg/l ，l-异亮氨酸35mg/l，l-苯丙氨酸15mg/l，l-赖氨酸50mg/l，l-半胱氨酸20mg/l，甘氨酸50mg/l，l-天冬酰胺50mg/l，l-谷氨酸10mg/l，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺10mg/l，l-色氨酸20mg/l，l-精氨酸100mg/l，l-酪氨酸20mg/l，l-天冬氨酸30mg/l，l-胱氨酸30mg/l，l-蛋氨酸10mg/l。维生素组分为：维生素a 15mg/l，维生素b1 5mg/l，维生素b2 1mg/l，维生素b3 1mg/l，维生素b6 5mg/l，维生素b7 2mg/l，维生素b9 20mg/l，维生素b15 5mg/l，维生素c 5mg/l，维生素e 9.4mg/l，肌醇35mg/l，泛酸钙10mg/l。碳水化合物组分为：葡萄糖3500mg/l，d-核糖3000mg/l，腐胺5mg/l，乙醇胺20mg/l，亚油酸0.5mg/l。微量元素组份为：五水合硫酸铜0.5mg/l，七水合硫酸锌5mg/l，七水合硫酸亚铁10mg/l，氯化钴0.1mg/l，亚硒酸钠1mg/l。无机盐组分为：碳酸氢钠3000mg/l，氯化镁200mg/l，氯化钠2000mg/l，氯化钾250mg/l。其他分子化合物组分为：豆甾醇50mg/l，黄酮醇50mg/l，大豆异黄酮20mg/l，胰岛素10mg/l，皮质醇20mg/l，表皮生长因子10mg/l，edta二钠10mg/l，转铁蛋白20mg/l，蜂胶黄酮10mg/l，淫羊藿黄酮10mg/l。5.一种细胞培养方法，其特征在于，包括：在装有细胞的培养容器内加入权利要求1~4任一所述培养基，于37℃条件下培养即可。

技术总结
本发明涉及一种无血清细胞培养基及其应用，包括氨基酸组分、维生素组分、碳水化合物组分、微量元素组分、无机盐组分及其他分子化合物组分。本发明的培养基不含血清、成分清晰，避免了因使用血清带来的生物安全风险和批次差异，采用葡萄糖和D-核糖联合供能，结合蜂胶黄酮和淫羊藿黄酮的促生长调控，在维持细胞正常生长的基础上，具有提高细胞存活率及增殖的作用，从而提升生物制品产量和质量稳定性，获得更大经济效益。更大经济效益。


技术研发人员：张晓丹 李殿明 田春辉 齐春梅 刘甜甜 张导春 任百亮 党将将
受保护的技术使用者：青岛明勤生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/9/11