一种胆管肿瘤靶向的组合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及蛋白人工改造和荧光分子化学偶联的技术领域


背景技术：

2.胆管癌(cholangiocarcinoma,cca)是一种相对少见但非常致命的癌症。流行病学研究表明，cca的发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势。胆管癌对常规放化疗缺乏敏感性，效果不佳，因此手术是目前最为有效的治疗手段，然而胆管癌起病隐匿、临床症状不典型、缺乏理想的早期诊断标志物，导致其很难早期被发现，从而错过最佳的手术时机，晚期胆管癌患者肿瘤常侵袭肝部重要血管结构，并倾向于生长成神经组织，对手术造成更大的困难。据统计，cca的5年生存率低于5％，因此，迫切需要借助新兴手段研发治疗方法，提高对胆管癌的诊断和治疗效果。
3.胆管癌因其发病位置、病理分型和基因变异等差异具有很强异质性。这就造成胆管癌具有很大的遗传变异性，对药物治疗提出了巨大的挑战。


技术实现要素：

4.为了实现胆管肿瘤的荧光标记和靶向光热治疗，本发明提供一种基于人工改造亲和配体蛋白构建的肿瘤靶向荧光探针和光热治疗药物。采用如下的技术方案：
5.一种胆管肿瘤靶向的组合物，包括人工改造的her2亲和配体蛋白affibody以及和affibody偶联的近红外荧光光敏化合物，其中，所述的人工改造的her2亲和配体蛋白affibody为affibody的一端或两端连接串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸，串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸数量为2-20个。串联的方式为三种氨基酸的组合或是单种氨基酸串联或是任意两种氨基酸的串联。
6.优选地，串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸数量为5-15个。
7.优选地，affibody和串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸之间还具有连接序列。
8.优选地，所述的连接序列为3-10个氨基酸。更优选为5-8个氨基酸。
9.优选地，所述人工改造的her2亲和配体蛋白affibody的编码序列为seq id no：2。
10.优选地，所述的近红外荧光光敏化合物种类包括icg(吲哚菁绿)、ir820(新吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯)或cy7(花菁染料)中的至少一种。
11.优选地，所述的偶联为化学偶联。
12.本发明还提供所述的组合物在制备治疗胆管癌药物中的应用。
13.本发明的另一目的，在于提供一种胆管肿瘤靶向的组合物的制备方法，包括如下步骤：
14.1)在affibody编码序列的一端或两端加上串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸编码序列，得到序列一；
15.2)将步骤1)获得的序列一转入质粒；
16.3)将含有序列一的质粒转入工程菌；
17.4)培养该工程菌，获得人工改造的affibody蛋白；
18.5)将近红外荧光光敏化合物和人工改造的affibody蛋白进行偶联，获得胆管肿瘤靶向的组合物。
19.优选地，步骤2)所述的质粒为pet 22b(+)质粒。
20.优选地，步骤3)所述的工程菌为大肠杆菌bl21(de3)。
21.优选地，步骤5)中，所述的偶联方法为：配置5-20mg/ml的碳酸氢钠溶液，然后将目的蛋白溶于配置好的碳酸氢钠水溶液中获得0.5-5mg/ml的目的蛋白碳酸钠溶液，即溶液a；
22.配置0.5-5mg/ml的近红外荧光光敏化合物的二甲基甲酰胺溶液，即溶液b；
23.溶液a和溶液b按照体积比(5：1)-(15：1)混合，于1-4℃条件下搅拌过夜。
24.优选地，步骤5)中，偶联步骤之后还包括蛋白提纯步骤：收集搅拌过夜的液体，放置于400-600倍体积的pbs中，4℃条件下透析24h，重复1遍，收取。
25.本发明构建了一种基于人工改造亲和配体蛋白构建的胆管癌肿瘤靶向荧光探针和光热治疗药物，包括人工改造的her2亲和配体蛋白affibody和近红外荧光光敏化合物，由于人工改造的her2亲和配体蛋白在末端添加了修饰位点，化学偶联的荧光光敏分子更多，位置更固定，有效降低其对蛋白亲和力的影响，同时提升了单位蛋白分子上连接的光敏分子数目。综上所述，本发明包括以下有益效果：
26.1.光敏分子化学修饰的可定向性和高效性
27.2.更高荧光成像灵敏度和更优治疗效果。
28.3.经本发明实验证明，对小鼠的胆管癌具有良好的光热治疗效果。
附图说明
29.图1是本实施例的蛋白表达验证：wb实验检测affibody蛋白的表达，1：转入affibody质粒的且在诱导培养基中生长的菌上清；2：转入空白对照质粒且在诱导培养基中生长的菌上清；3：转入affibody质粒并在普通培养基中生长的菌上清
30.图2是本实施例的化学偶联验证：a-icg的紫外吸收光谱，a-icg与icg具有相同特征性吸收曲线，证明icg的成功偶联
31.图3-8是本实施例的功能学验证
32.图3：光热性能检测，证明偶联后的a-icg具有确定的光热性能，在激光照射下可升温至50℃以上，以有效杀伤肿瘤。
33.图4：体外靶向实验，相比对照组，a-icg组有明显红色荧光，证明a-icg可以有效结合肿瘤细胞。
34.图5：光热杀伤肿瘤细胞，a-icg可以有效杀伤肿瘤细胞。
35.图6：体内靶向实验，与对照组相比，a-icg可以有效靶向肿瘤区域(箭头所示)
36.图7：光热治疗后小鼠肿瘤的变化，a-icg组的肿瘤逐渐缩小，证明其具有良好的光热治疗效果。
37.图8：光热治疗2周后小鼠肿瘤照片，a-icg组的肿瘤明显小于对照组，证明其具有良好的光热治疗效果.
具体实施方式
38.以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
39.常规靶向治疗常具有肿瘤耐药、副作用多等缺点，成像技术介导肿瘤消融是一个具有很好应用前景的癌症治疗策略，也被称为靶向光热疗法。光热疗法是采用光敏剂，在近红外光(nir)的照射下产生一种致死的温度诱导肿瘤细胞死亡，并且可以实时监测局部肿瘤的荧光成像和温度变化的治疗方法。与化疗、放疗和手术治疗相比，光热疗法具有非常有效的治疗效果，并且具有靶向效果好和创伤小的优点。据报道，吲哚菁绿(indocyanine green,icg)是一种低毒性、可生物降解和生物相容性好的三羰花菁染料icg作为临床用药，以往常规用于肝功能的检测，近年来研究发现，其可对离体组织和活体动物进行荧光成像，同时又可以进行光热治疗，具有很好的应用前景。然而，大多数肿瘤组织对icg无特异性摄取，限制了其肿瘤的富集能力。
40.为了达到增强icg肿瘤区域的富集效率的目的，本发明为其添加了靶向配体。affibody作为近年来发现的一种her2靶向配体蛋白，具有体积小，亲和力高等优点。但其如果直接和icg等进行偶联，非特异性高，而且非特异性的偶联可能会导致其亲和性能的下降。因此，本发明为affibody进行人工改造。
41.本发明实施例公开一种基于人工改造的亲和配体蛋白构建的肿瘤靶向荧光探针和光热治疗药物。
42.实施例1：
43.1.质粒的合成与验证
44.根据实验室保有的affibody的dna编码序列(seq id no 1：
45.gttgacaacaaattcaacaaagaaatgcgtaacgcttattgggaaatcgcgctgctgc
46.cgaacctgaacaaccagcagaagcgcgcgttcatccgcagcctgtatgacgacccatc
47.ccagagcgcaaacctgctggcagaagcgaaaaaactgaacgacgcgcaggcgccgaaa)，于尾端添加连续8个谷氨酸编码序列，并于二者间添加连接序列(氨基酸序列ggggs的编码序列ggcggtggcggctct)，作为目的蛋白基因序列(seq id no 2：gttgacaacaaattcaacaaagaaatgcgtaacgcttattgggaaatcgcgctgctgccgaacctgaacaaccagcagaagcgcgcgttcatccgcagcctgtatgacgacccatcccagagcgcaaacctgctggcagaagcgaaaaaactgaacgacgcgcaggcgccgaaaggcggtggcggctctgaagaggaagaggaagaggaagag)。含有目的蛋白序列的质粒使用常规方法合成，使用pet 22b(+)工程质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，含信号肽序列，his标签和卡那霉素抗性。从-80℃冰箱取50ul bl21(de3)感受态细菌，置于冰上几分钟，待菌液融化，取1ul目的蛋白质粒，加入感受态细菌液中，轻轻吹匀，置于冰上30min，42℃水浴锅中热激90秒，再置于冰上30min。加入不含抗生素的lb培养基1ml，置于37℃，200转速下的摇床摇菌1小时，之后将菌液涂于有卡那霉素抗性的琼脂培养板上均匀涂开，置于37℃培养箱中过夜。第二天挑取生长情况良好的单克隆菌落，加入200ml有卡那霉素抗性的lb培养基，置于37℃，200rpm转速下的摇床摇菌至od值为0.6，取1ml菌液进行质粒测序，取100ml菌液在5000rpm下离心5分钟，取沉淀使用质粒提取试剂盒提取质粒，于-20℃保存，余下菌液在5000rpm下离心5分钟后，使用5mllb培养基重悬，再用5ml 50％的甘油混匀置于-20℃保存。
48.2.人工改造affibody蛋白(m-affibody)的制备与验证
49.待测序结果验证质粒正确后，从-20℃冰箱中取出200ul保种菌液，加入有卡那霉
素抗性的自诱导培养基，置于37℃，200rpm转速下的摇床摇菌16小时，将摇好的菌液离心，在5000rpm下离心5分钟，弃沉淀，保留上清，使用0.22微米的滤芯过滤得到的上清，将上清依次流经镍柱，使用咪唑溶液洗脱，将洗脱液置于透析袋中，放置于500倍体积的pbs中，4℃条件下透析24h，重复1遍，使用冻干机进行冻干，得到目的蛋白粉末。
50.称取2mg蛋白粉末溶于1mlpbs溶液，加入loading buffer，100℃金属浴10分钟，进行western blot实验，使用抗his标签抗体验证目的蛋白的表达。通过wb结果可以看到，未转质粒的菌上清和转质粒但未诱导的菌上清均检测不到蛋白的存在，而转了质粒并诱导表达的菌上清有明显的条带，表明affibody蛋白成功表达(图1)。
51.3.affibody-icg(a-icg)的偶联与纯化
52.称取84mg的碳酸氢钠溶于10ml的超纯水，称取10毫克的icg-nhs溶于10ml的二甲基甲酰胺(dmf)，称取10毫克的目的蛋白溶于10ml配置好的碳酸氢钠水溶液，取1ml的icg-nhs的dmf溶液和9ml的溶于碳酸氢钠水溶液的目的蛋白，置于4℃条件下搅拌过夜。第二天收集搅拌过夜的液体，放置于500倍体积的pbs中，4℃条件下透析24h，重复1遍，仔细收取。
53.4.a-icg的体外功能验证
54.配制icg溶液，使用酶标仪测定得到icg在特征峰最高吸收处(780nm)光吸收标准曲线，使用酶标仪检测a-icg在600nm-900nm波长范围内的紫外吸收曲线，该光谱与对照icg的波形基本相同，证明icg有效的偶联到了蛋白上(图2)。
55.取200ul pbs、icg、a-icg置于酶标条中，分别使用808nm激光器以1w/cm2的强度照射，并记录温度变化。结果显示a-icg的光热性能与icg相近，在照射5min后达到50℃以上，可对肿瘤细胞产生有效的杀伤作用(图3)。
56.传代培养sk-cha-1细胞(人胆管癌细胞)，至汇合度达80％-90％。取24孔板用细胞爬片置于24孔板中，消化sk-cha-1细胞，用1640培养基稀释后加入孔中，置二氧化碳细胞培养箱中培养过夜，第二天分别加入等体积pbs，1ug icg-nhs，1uga-icg于细胞上清中，放回培养箱孵育2h，吸去上清并用pbs清洗，使用4％多聚甲醛常温固定细胞15min，吸去上清并用pbs清洗后，加入hoechst染液常温孵育10min，吸去上清并用pbs清洗，取出爬片倒扣于载玻片上，封片后使用共聚焦显微镜观察。从结果中可以看到，a-icg组细胞中有明显的icg荧光信号，而对照组没有荧光，证明a-icg可有效靶向胆管癌细胞(图4)。
57.传代培养sk-cha-1细胞，至汇合度达80％-90％。以每孔1
×
104个细胞种96孔细胞板，置二氧化碳细胞培养箱中培养过夜，第二天分别加入不同浓度的icg和a-icg，放回培养箱孵育2h，吸去上清并用pbs清洗三遍，使用808nm激光器以1w/cm2的强度照射5min，更换新培养基并放回二氧化碳细胞培养箱中孵育1h，加入cck-8试剂，继续孵育1h后使用酶标仪检测。结果表明，a-icg可以有效结合肿瘤细胞，并在激光照射下产生光热效果有效杀伤肿瘤(图5)。
58.5.a-icg的体内荧光成像和光热治疗功能验证
59.传代培养sk-cha-1细胞，至汇合度达80％-90％。消化细胞制备细胞悬液，按每盘细胞对应4只小鼠的量注射于裸小鼠背部皮下，每日观察小鼠状态和肿瘤生长情况。按1mg/kg剂量分别尾静脉注射icg和a-icg，通过小动物活体成像观察到a-icg组在注射6h后在肿瘤区域有明显特异性荧光信号，而icg的荧光信号弥散于全身，证明偶联了m-affibody的a-icg可以在体内有效的靶向富集到肿瘤区域，可用于对肿瘤的活体成像以及后续的光热治
疗(图6)。
60.按2mg/kg剂量分别尾静脉注射icg和a-icg，使用808nm激光器以1w/cm2的强度照射肿瘤部位5min，继续饲养小鼠，每两天测定小鼠肿瘤大小。2周后，处死小鼠，取出肿瘤，观察肿瘤大小并拍照记录。实验结果表明，a-icg组的小鼠肿瘤明显得到控制，并逐渐缩小，而对照组小鼠肿瘤仍在生长，2周后处死小鼠取出肿瘤后观察发现，a-icg组的小鼠肿瘤已明显小于治疗前，而pbs对照组小鼠的肿瘤非常大，并有一只小鼠已死亡，icg对照组肿瘤也有明显增生，结果说明a-icg的光热治疗具有显著的治疗效果(图7、图8)。
61.以上均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种胆管肿瘤靶向的组合物，其特征在于，包括人工改造的her2亲和配体蛋白affibody以及和affibody偶联的近红外荧光光敏化合物，其中，所述的人工改造的her2亲和配体蛋白affibody为affibody的一端或两端连接串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸，串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸数量为2-20个。2.如权利要求1所述的一种胆管肿瘤靶向的组合物，其特征在于，串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸数量为5-15个。3.如权利要求1所述的一种胆管肿瘤靶向的组合物，其特征在于，所述的近红外荧光光敏化合物种类包括icg、ir820或cy7中的至少一种。4.如权利要求1所述的一种胆管肿瘤靶向的组合物，其特征在于，所述人工改造的her2亲和配体蛋白affibody的编码序列为seq id no：2。5.如权利要求1至4任一项所述的组合物在制备治疗胆管肿瘤药物中的应用。6.一种胆管肿瘤靶向的组合物的制备方法，包括如下步骤：1)在affibody编码序列的一端或两端加上串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸编码序列，得到序列一；2)将步骤1)获得的序列一转入质粒；3)将含有序列一的质粒转入工程菌；4)培养该工程菌，获得人工改造的affibody蛋白；5)将近红外荧光光敏化合物和人工改造的affibody蛋白进行偶联，获得胆管肿瘤靶向的组合物。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的质粒为pet 22b(+)质粒。8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的工程菌为大肠杆菌bl21(de3)。9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中，所述的偶联方法为：配置5-20mg/ml的碳酸氢钠溶液，然后将目的蛋白溶于配置好的碳酸氢钠水溶液中获得0.5-5mg/ml的目的蛋白碳酸钠溶液，即溶液a；配置0.5-5mg/ml的近红外荧光光敏化合物的二甲基甲酰胺溶液，即溶液b；溶液a和溶液b按照体积比(5：1)-(15：1)混合，于1-4℃条件下搅拌过夜。10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：偶联步骤之后还包括蛋白提纯步骤：收集搅拌过夜的液体，放置于400-600倍体积的pbs中，4℃条件下透析24h，重复1遍，收取。

技术总结
本发明公开了一种胆管癌靶向的组合物及其制备方法和应用，涉及人工蛋白改造和荧光偶联物的制备和应用的技术领域，组合物包括人工改造的Her2亲和配体蛋白Affibody以及和Affibody偶联的近红外荧光光敏化合物，其中，所述的人工改造的Her2亲和配体蛋白Affibody为Affibody的一端或两端连接串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸，串联的谷氨酸/半胱氨酸/赖氨酸数量为2-20个。本发明能够为配体蛋白增加定向的化学修饰位点，有效提升荧光分子的偶联效率，进一步靶向肿瘤区域，实现更高灵敏度荧光成像和更优光热治疗功能。成像和更优光热治疗功能。


技术研发人员：李文岗 苗逢霖 郑家梁 王昭
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/9/11