鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合及其应用

idno:3所示，spegte的核苷酸序列如seq id no:5所示。
11.上述鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的相关生物材料，为下述生物材料中的任意一种：
12.1)所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合编码的蛋白；
13.2)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的表达盒；
14.3)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的重组载体，或含有2)中所述的表达盒的重组载体；
15.4)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的重组微生物，或含有2)中所述的表达盒的重组微生物，或含有3)所述的重组载体的重组微生物。
16.优选地，1)中所述的蛋白为下述任一蛋白或蛋白组合：(1)spegtb；(2)spegtd；(3)spegte；(4)spegtb+spegtd；(5)spegtd+spegte；(6)spegtb+spegtd+spegte；其中，spegtb的氨基酸序列如seq id no:2所示，spegtd的氨基酸序列如seq id no:4所示，spegte的氨基酸序列如seq id no:6所示。
17.优选地，3)中所述的重组载体为将所述的基因或基因组合构建到pbbr1mcs-2质粒中得到；进一步优选为将spegtb+spegtd或spegtd+spegte构建到pbbr1mcs-2质粒中得到。
18.优选地，4)中所述的重组微生物为将3)中所述的重组载体转化到鞘氨醇单胞菌中得到；进一步优选为将3)中所述的重组载体转化到鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193中得到。
19.上述鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因、基因组合或相关材料在合成麦角硫因中应用。
20.优选地，所述的应用是所述的应用是在鞘氨醇单胞菌体内过表达所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合；进一步优选为在鞘氨醇单胞菌体内过表达spegtb+spegtd或spegtd+spegte。
21.优选地，所述的鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193。
22.一种麦角硫因的生物合成方法，包括如下步骤：
23.①
表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte的构建：
24.利用同源重组酶同时将带有同源臂的spegtd基因片段和带有同源臂的spegtb或spegte基因片段与线性化的pbbr1mcs-2载体片段进行同源重组，得到表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte；
25.②
重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de的构建：
26.将达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte采用电介导转化的方法导入鞘氨醇单胞菌hbj-193，得到重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de；
27.③
重组菌的发酵：
28.挑取重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de单菌落至lb液体培养基，并加入卡那霉素，培养，得到种子液；取种子液加至发酵培养基并加入卡那霉素，避光培养；再次加入等量的卡那霉素，继续避光培养，结束发酵；
29.④
麦角硫因分离与纯化：
30.取发酵后的培养液，加入乙醇提取液，静置获得粗提液，粗提液离心，取上清液，除杂过滤，得到麦角硫因。
31.优选地，
①
中所述的同源重组采用clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒实现。
32.优选地，
①
中所述的同源重组的10μl反应体系组成如下：
[0033][0034]
优选地，
①
中所述的同源重组的反应参数：50℃孵育30min，立即冷却。
[0035]
优选地，
③
中所述的种子液的接种量为2％。
[0036]
优选地，
③
中所述的避光培养的条件为28℃、150rpm、72h。
[0037]
优选地，
③
中所述的卡那霉素的添加量按其与培养基的体积比为1mg：40ml计。
[0038]
优选地，
④
中所述的乙醇提取液的组成如下：每1l体系中含1.67g十二烷基硫酸钠(sds)，700ml无水乙醇，水余量。
[0039]
优选地，
④
中所述的乙醇提取液的添加量为发酵后的培养液的4倍体积。
[0040]
优选地，
④
中所述的静置的条件为4℃、12h。
[0041]
优选地，
④
中所述的离心的条件为12000r/min、10min。
[0042]
本发明的原理：鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193，于2022年03月29日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.24613。鞘氨醇单胞菌是普遍认为安全的菌株，工业上多用于生产胞外多糖，对于该食品源菌株的麦角硫因关键酶合成基因进行挖掘将有利于构建鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成工厂。
[0043]
由于鞘氨醇单胞菌的麦角硫因合成途径不明，因此我们在linux系统下利用鞘氨醇单胞菌hbj-193的基因组数据建立了本地比对核酸库，以较为近缘并且其麦角硫因合成关键基因经过功能验证的耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)作为本地比对的输入基因与hbj-193基因组的本地核酸库进行blast比对。根据本地核酸库比对结果并结合pfam、nr数据库注释信息，拟定鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegtb、spegtd、spegte基因分别为基因组中ge002087、ge002086、ge001348。
[0044]
以提取鞘氨醇单胞菌hbj-193的dna为模版，设计特异性引物进行克隆，获得麦角硫因合成途径中的基因，在鞘氨醇单胞菌hbj-193体内以pbbr1mcs-2为载体过表达部分基因，实现了麦角硫因产量的提升。
[0045]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0046]
(1)本发明利用同源比对的方法找到鞘氨醇单胞菌hbj-193的麦角硫因合成酶基因，并提取鞘氨醇单胞菌hbj-193的dna后进行克隆获取。运用本地核酸库比对结果并结合pfam、nr数据库注释信息，拟定鞘氨醇单胞菌hbj-193的麦角硫因合成酶基因，通过swiss-model同源建模与耻垢分枝杆菌麦角硫因关键基因做对比可知，鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegtb基因ge002087氨基酸序列与选择的同源建模模板相似度为52.66％；鞘氨醇单胞菌
hbj-193的spegtd基因ge002086氨基酸序列与选择的同源建模模板相似度为40.72％；鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegte基因ge001348氨基酸序列与选择的同源建模模板相似度为31.45％。
[0047]
(2)本发明以鞘氨醇单胞菌hbj-193为原始菌株，以pbbr1mcs-2为载体过表达鞘氨醇单胞菌hbj-193麦角硫因合成基因，使得该菌株麦角硫因生产能力得到了提升，其产量可达73.46mg/l，较原始菌株麦角硫因产量增加44.63％，为麦角硫因的生产提供一条全新的生物合成途径，有望解决目前麦角硫因生产菌的缺点与不足。鞘氨醇单胞菌是普遍认为安全的菌株，，发酵周期短、发酵产物易于提取的特点，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0048]
图1是重组质粒电泳图；其中，m4是marker 4，ck是pbbr1mcs-2，bd是pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd，de是pbbr1mcs-2-spegtd-spegte；
[0049]
图2是实施例1中pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd表达质粒图谱；
[0050]
图3是实施例2中pbbr1mcs-2-spegtd-spegte表达质粒图谱；
[0051]
图4是鞘氨醇单胞菌hbj-193发酵液的hplc麦角硫因检测结果图；其中，麦角硫因出峰时间为23.041min；
[0052]
图5是实施例1中重组鞘氨醇单胞菌hbj-193-bd发酵液的hplc麦角硫因检测结果图；其中，麦角硫因出峰时间为23.025min；
[0053]
图6是实施例2中重组鞘氨醇单胞菌hbj-193-de发酵液的hplc麦角硫因检测结果图；其中，麦角硫因出峰时间为23.030min；
[0054]
图7是对比例1中pbbr1mcs-2-spegtb表达质粒图谱；
[0055]
图8是对比例2中pbbr1mcs-2-spegtd表达质粒图谱；
[0056]
图9是对比例3中pbbr1mcs-2-spegte表达质粒图谱；
[0057]
图10是对比例4中pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd-spegte表达质粒图谱；
[0058]
图11是对比例1中重组鞘氨醇单胞菌hbj-193-b发酵液的hplc麦角硫因检测结果；其中，麦角硫因出峰时间为22.868min；
[0059]
图12是对比例2中重组鞘氨醇单胞菌hbj-193-d发酵液的hplc麦角硫因检测结果；其中，麦角硫因出峰时间为22.888min；
[0060]
图13是对比例3中重组鞘氨醇单胞菌hbj-193-e发酵液的hplc麦角硫因检测结果；其中，麦角硫因出峰时间为22.917min；
[0061]
图14是对比例4中重组鞘氨醇单胞菌hbj-193-bde发酵液的hplc麦角硫因检测结果；其中，麦角硫因出峰时间为22.937min。
具体实施方式
[0062]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0063]
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0064]
鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193：于2022年03月29日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.24613。
[0065]
lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，蒸馏水定容至1l，ph 7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min。固体培养基加入2％琼脂粉即可。
[0066]
发酵培养基：胰蛋白胨10g，甘油7.5g，nacl 10g，半胱氨酸40mm，蒸馏水定容至1l，ph 5.4，121℃高压蒸汽灭菌30min。发酵前加入6.25μl卡那霉素母液。
[0067]
卡那霉素母液(100mg/ml)：称取100mg卡那霉素粉末，溶于1ml超纯水中，无菌环境下过滤除菌存于-20℃备用。
[0068]
乙醇提取液：称取1.67g十二烷基硫酸钠(sds)，溶于700ml无水乙醇，使用超纯水定容至1000ml。
[0069]
marker3：由上至下dna片段长度分别为4500bp、300bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp，购自广州东盛生物科技有限公司。
[0070]
marker4：由上至下dna片段长度分别为15000bp、8000bp、5000bp、2500bp、1000bp、500bp，购自广州东盛生物科技有限公司。
[0071]
pbbr1mcs-2质粒购自上海海吉浩格生物科技有限公司。
[0072]
dna聚合酶2
×
rapid taq master mix(p222)、dna聚合酶max super-fidelity dna polymerase(p505)、同源重组的试剂盒clonexpress ultra one step cloning kit(c115)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
[0073]
质粒提取的试剂盒hipure plasmid mini kit、核酸纯化回收试剂盒hipure gel pure dna mini kit、细菌dna提取试剂盒hipurebacterial dna kit购自美基生物。
[0074]
下列实施例所使用的引物(表1)：
[0075]
表1引物序列
[0076]
[0077][0078]
引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
[0079]
实施例1：鞘氨醇单胞菌合成麦角硫因关键基因的克隆
[0080]
在linux系统下利用鞘氨醇单胞菌hbj-193的基因组数据建立了本地比对核酸库，以较为近缘并且其麦角硫因合成关键基因经过功能验证的耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)作为本地比对的输入基因与hbj-193基因组的本地核酸库进行blast比对。根据本地核酸库比对结果并结合pfam、nr数据库注释信息，拟定鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegtb、spegtd、spegte基因分别为基因组中ge002087、ge002086、ge001348。
[0081]
通过hipure bacterial dna kit细菌dna提取试剂盒获得鞘氨醇单胞菌dna，以鞘氨醇单胞菌dna为模版，根据鞘氨醇单胞菌hnj-193基因组中ge002087、ge002086、ge001348序列设计引物，并借助ncbi中的nucleotide blast(网站：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)对引物进行特异性验证，利用dna聚合酶max super-fidelity dna polymerase分别扩增spegtb、spegtd、spegte目的基因，反应体系和反应参数如下：
[0082]
pcr反应体系：
[0083][0084]
pcr反应参数：
[0085]
95℃预变性3min，95℃变性15ec，spegtb55℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min；95℃预变性3min，95℃变性15sec，spegtd 60℃退火15sec，72℃延伸45sec，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min；95℃预变性3min，95℃变性15sec，spegte 60℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0086]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将条带正确的pcr产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。
[0087]
测序结果与鞘氨醇单胞菌hnj-193基因组中ge002087、ge002086、ge001348序列吻合，即鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成酶基因克隆成功。
[0088]
实施例2：pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd表达质粒的构建与转化
[0089]
构建载体的方法为同源重组法，利用同源重组酶将带有同源臂的基因片段连接至表达载体pbbr1mcs-2中，再通过电介导转化导入鞘氨醇单胞菌完成重组菌的构建。
[0090]
2.1基因片段同源臂的添加
[0091]
以鞘氨醇单胞菌dna为模版，根据鞘氨醇单胞菌hnj-193基因组中spegtb(ge002087)、spegtd(ge002086)序列设计引物p-b&spegtb-r、b-d&d-p，利用dna聚合酶max super-fidelity dna polymerase扩增目的基因spegtb和spegtd使其带有同源臂，反应参数如下：
[0092]
添加同源臂pcr反应体系：
[0093][0094]
pcr反应参数：
[0095]
95℃预变性3min，95℃变性15sec，spegtb55℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min；95℃预变性3min，95℃变性15sec，spegtd 60℃退火15sec，72℃延伸45sec，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0096]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用hipure gel pure dna mini kit试剂盒进行核酸的回收，步骤详见说明书，回收产物存于-20℃备用。
[0097]
2.2载体的双酶切
[0098]
过夜摇菌，用质粒提取试剂盒hipure plasmid mini kit提取pbbr1mcs-2质粒。随后用fastdigest ecor i和fastdiest saci对pbbr1mcs-2质粒进行双酶切，反应体系和参数如下：
[0099]
双酶切反应体系：
[0100][0101]
双酶切反应参数：37℃孵育40min，80℃失活5min，4℃冰浴5min。
[0102]
双酶切产物经1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定后，采用hipure gel pure dna mini kit试剂盒进行核酸的回收，步骤详见说明书，回收产物存于-20℃备用。
[0103]
2.3表达质粒的构建
[0104]
通过clonexpress ultra one step cloning kit同源重组酶构建载体，多个带有同源臂的基因片段与一个线性化的载体片段进行同源重组后构建成一个环状结构的质粒。具体的反应体系和参数如下：
[0105]
同源重组反应体系：
[0106][0107]
同源重组反应参数：50℃孵育30min，立即置于冰上冷却。重组产物可存于-20℃。
[0108]
冰浴融化-80℃保存的0.1m cacl2制备的大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入10μl上述重组产物，轻轻吹打混匀，在冰浴中放置10min。42℃水浴热激30sec，然后立即冰浴2min，该过程不要摇动离心管。加入500μl无菌lb液体培养基，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，复苏菌体。将复苏菌液离心浓缩涂至含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，倒置37℃过夜培养。长出单菌落后利用dna聚合酶2
×
rapid taq master mix对菌落进行鉴定，反应体系和反应参数如下：
[0109]
菌落鉴定反应体系：
[0110][0111]
菌落鉴定pcr反应参数如下：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min30sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃彻底延伸5min。
[0112]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，由图1的5-7号泳道可看到，在2500bp之间出现了相应的条带，且亮度较好，可初步判断为spegtb-spegtd插入成功，随后经北京擎科生物科技有限公司测序为一个2262bp完整的阅读框，对测序结果正确的菌落进行保存备用，至此构建得到重组表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd(图2)。
[0113]
2.4鞘氨醇单胞菌的转化与鉴定
[0114]
载体构建之后采用电介导转化的方法导入hbj-193，电转化方法参考manjusha等人的的方法(manjusha et al.,2020)并有较大改动，具体步骤为：(1)挑取鞘氨醇单胞菌hbj-193单菌落至lb液体培养基37℃、200r/min避光震荡培养12h至od
600
＝0.6～0.8；(2)将菌液分装于50ml无菌离心管内冰浴30min，4℃、8000r/min离心20min，弃上清液；(3)加入30ml冰浴的无菌水充分重悬混匀，离心弃上清液，再分别加入20ml、10ml冰浴的无菌水洗涤收集菌体；(4)加入2ml冰浴无菌水重悬，分装100μl/管至无菌1.5ml离心管中冰浴待用；(5)使用冰浴的无菌水冲洗电击杯3次，然后使用无水乙醇冲洗3次，置于冰上晾干待用；(6)将约100ng重组表达质粒轻缓混入hbj-193感受态细胞中，冰浴20min，使用电转仪电击，参数为1.8kv，25μf，电击后脉冲时程应为4.5-5.5ms，迅速加入900μl的lb液体培养基轻轻混匀，吸取至1.5ml无菌离心管，37℃、200r/min复苏50min；(7)浓缩菌液至100μl，涂到含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，30℃培养；(8)待单菌落长出后，利用dna聚合酶2
×
rapid taq master mix对菌落进行鉴定，反应体系和反应参数如下：
[0115]
菌落鉴定反应体系：
[0116][0117][0118]
菌落鉴定pcr反应参数如下：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min30sec，接着回到退火步骤，一共30循环，72℃彻底延伸5min。
[0119]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，对条带大小正确的菌落进行保存备用。
[0120]
至此完成鞘氨醇单胞菌hbj-193spegtb和spegtd过表达菌株的构建，简称hbj-193-bd。
[0121]
2.5重组菌的发酵
[0122]
pbbr1mcs-2载体带有卡那霉素抗性，所以hbj-193-bd能够在卡那霉素存在的条件下正常生长，培养基中加入卡那霉素可以防止重组菌质粒的丢失，所以本次发酵采取以下方法：(1)挑取hbj-193-bd单菌落至25ml lb液体培养基并加入6.25μl卡那霉素母液，28℃，150rpm培养16h作种子液；(2)以2％接种量吸取种子液加至含25ml发酵培养基，并加入6.25μl卡那霉素母液，28℃、150rpm避光培养72h；(3)加入与步骤(2)等量的卡那霉素母液，继续以28℃、150rpm避光培养72h，结束发酵。
[0123]
2.6麦角硫因产物检测
[0124]
取2mlhbj-193-bd发酵144h后的培养液，加入4倍体积的乙醇提取液，于4℃静置12h获得粗提液，取1ml粗提液至1.5ml离心管，常温12000r/min离心10min，取上清液用0.22
μm的有机相滤头进行除杂过滤，随后进行hplc分析。
[0125]
使用岛津lc 2030 cn仪器进行麦角硫因高效液相色谱检测。使用色谱柱型号为welch ultimate hilic amphionⅱ(5μm 4.6
×
250mm)，紫外检测器检测波长为257nm，检测流动相为乙腈∶水＝80∶20，流速为1ml/min，进样量20μl，柱温30℃。麦角硫因标准品溶于dd h2o中，麦角硫因标准品浓度分别为5、10、20、40、80mg/l，用相同条件进行hplc检测。hplc检测后记录不同浓度标准溶液所对应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度(mg/l)为横坐标，拟合线性回归方程。
[0126]
麦角硫因标准线性方程为y＝74940x-29220，r2＝1，线性范围5～80mg/l。hbj-193-bd发酵液hplc分析如图5所示，根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出hbj-193-bd发酵液中麦角硫因的最终浓度为73.46mg/l，较hbj-193原始菌株麦角硫因产量(图4)增加44.63％。
[0127]
实施例3：pbbr1mcs-2-spegtd-spegte表达质粒的构建与转化
[0128]
构建载体的方法为同源重组法，利用同源重组酶将带有同源臂的基因片段连接至表达载体pbbr1mcs-2中，再通过电介导转化导入鞘氨醇单胞菌完成重组菌的构建。
[0129]
3.1基因片段同源臂的添加
[0130]
以鞘氨醇单胞菌dna为模版，根据鞘氨醇单胞菌hnj-193基因组中spegtd(ge002086)、spegte(ge001348)序列设计引物p-d&spegtd-r、d-e&e-p，利用dna聚合酶max super-fidelity dna polymerase扩增目的基因spegtd和spegte使其带有同源臂，反应参数如下：
[0131]
添加同源臂pcr反应体系：
[0132][0133]
pcr反应参数：
[0134]
95℃预变性3min，95℃变性15sec，spegtd 60℃退火15sec，72℃延伸45sec，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min；95℃预变性3min，95℃变性15sec，spegte60℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。。
[0135]
pcr产物经1％琼脂糖进行凝胶电泳鉴定后，采用hipure gel pure dna mini kit试剂盒进行核酸的回收，步骤详见说明书。
[0136]
3.2载体的双酶切，参照实施例2的2.2载体的双酶切。
[0137]
3.3表达质粒的构建
[0138]
通过clonexpress ultra one step cloning kit同源重组酶构建载体，多个带有
同源臂的基因片段与一个线性化的载体片段进行同源重组后构建成一个环状结构的质粒。具体的反应体系和参数如下：
[0139]
同源重组反应体系：
[0140][0141]
同源重组反应参数：50℃孵育30min，立即置于冰上冷却。重组产物可存于-20℃。
[0142]
转化入0.1m cacl2制备的大肠杆菌dh5α感受态细胞、菌落鉴定参照实施例2的2.3表达载体的构建。
[0143]
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，由图1的8-10号泳道可看到，在2500bp之间出现了相应的条带，且亮度较好，可初步判断为spegtd-spegte插入成功，随后经北京擎科生物科技有限公司测序为一个2238bp完整的阅读框，对测序结果正确的菌落进行保存备用，至此构建得到重组表达质粒pbbr1mcs-2-spegtd-spegte(图3)。
[0144]
3.4鞘氨醇单胞菌的转化与鉴定，参照实施例2的2.4鞘氨醇单胞菌的转化与鉴定。
[0145]
至此完成鞘氨醇单胞菌hbj-193spegtd和spegte过表达菌株的构建，简称hbj-193-de。
[0146]
3.5重组菌的发酵，参照实施例2的2.5重组菌的发酵。
[0147]
3.6麦角硫因产物检测，参照实施例2的2.6麦角硫因产物检测。
[0148]
hbj-193-de发酵液hplc分析如图6所示，根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出hbj-193-de发酵液中麦角硫因的最终浓度为55.18mg/l，较hbj-193原始菌株麦角硫因产量(图4)增加26.30％。
[0149]
对比例1：pbbr1mcs-2-spegtb表达质粒的构建与转化
[0150]
参照实施例2或3的实验方法，首先为目的基因片段spegtb添加同源臂，随后通过同源重组方法将带有同源臂的spegtb片段连接至双酶切的质粒载体，通过电转完成重组菌的构建，随后hplc检测重组菌发酵液的麦角硫因产量。区别在于：
[0151]
基因片段同源臂的添加：spegtb(ge002087)同源臂添加的pcr反应体系引物为p-b&b-p。
[0152]
反应参数：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0153]
表达质粒的构建：同源重组反应体系中带有同源臂的spegtb使用量为54ng。
[0154]
同源重组反应参数：50℃孵育15min，立即置于冰上冷却。重组产物可存于-20℃。
[0155]
电泳鉴定正确后得到重组质粒pbbr1mcs-2-spegtb(图7)，通过电介导转化入hbj-193得到重组菌hbj-193-b。
[0156]
hbj-193-b发酵液hplc分析如图11所示，根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出hbj-193-b发酵液中麦角硫因的最终浓度为17.83mg/l，较hbj-193原始菌株麦角硫因产量
(图4)降低56.15％。
[0157]
对比例2：pbbr1mcs-2-spegtd表达质粒的构建与转化
[0158]
参照实施例2或3的实验方法，首先为目的基因spegtd添加同源臂，随后通过同源重组方法将带有同源臂的spegtd片段连接至双酶切的质粒载体，通过电转完成重组菌的构建，随后hplc检测重组菌发酵液的麦角硫因产量。区别在于：
[0159]
基因片段同源臂的添加：spegtd(ge002086)同源臂添加的pcr反应体系引物为p-d&d-p。
[0160]
反应参数：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸45sec，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0161]
表达质粒的构建：同源重组反应体系中带有同源臂的spegtd使用量为42ng。
[0162]
同源重组反应参数：50℃孵育15min，立即置于冰上冷却。重组产物可存于-20℃。
[0163]
电泳鉴定正确后得到重组质粒pbbr1mcs-2-spegtd(图8)，通过电介导转化入hbj-193得到重组菌hbj-193-d。
[0164]
hbj-193-d发酵液hplc分析如图12所示，根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出hbj-193-d发酵液中麦角硫因的最终浓度为14.23mg/l，较hbj-193原始菌株麦角硫因产量(图4)降低65.01％。
[0165]
对比例3：pbbr1mcs-2-spegte表达质粒的构建与转化
[0166]
参照实施例2或3的实验方法，首先为目的基因spegte添加同源臂，随后通过同源重组方法将带有同源臂的目的基因spegte连接至双酶切的质粒载体，通过电转完成重组菌的构建，随后hplc检测重组菌发酵液的麦角硫因产量。区别在于：
[0167]
基因片段同源臂的添加：spegte(ge001348)同源臂添加的pcr反应体系引物为p-e&e-p。
[0168]
反应参数：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0169]
表达质粒的构建：同源重组反应体系中带有同源臂的spegte使用量为53ng。
[0170]
同源重组反应参数：50℃孵育15min，立即置于冰上冷却。重组产物可存于-20℃。
[0171]
电泳鉴定正确后得到重组质粒pbbr1mcs-2-spegte(图9)，通过电介导转化入hbj-193得到重组菌hbj-193-e。
[0172]
hbj-193-e发酵液hplc分析如图13所示，根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出hbj-193-e发酵液中麦角硫因的最终浓度为14.68mg/l，较hbj-193原始菌株麦角硫因产量(图4)降低63.90％。
[0173]
对比例4：pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd-spegte表达质粒的构建与转化
[0174]
参照对比例1、2、3的实验方法，首先为目的基因spegtb、spegtd、spegte添加同源臂，随后通过同源重组方法将带有同源臂的目的基因spegtb、spegtd、spegte连接至双酶切的质粒载体，通过电转完成重组菌的构建，随后hplc检测重组菌发酵液的麦角硫因产量。区别在于：
[0175]
spegtb(ge002087)同源臂添加的pcr反应体系引物为p-b&spegtb-r。
[0176]
反应参数：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0177]
spegtd(ge002086)同源臂添加的pcr反应体系引物为b-d&spegtd-r。
[0178]
反应参数：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸45sec，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0179]
spegte(ge001348)同源臂添加的pcr反应体系引物为d-e&e-p。
[0180]
反应参数：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，接着回到退火步骤，一共35循环，72℃彻底延伸5min。
[0181]
表达质粒的构建：同源重组反应体系中带有同源臂的spegtb使用量为26ng，带有同源臂的spegtd使用量为20ng，带有同源臂的spegte使用量为26ng。
[0182]
同源重组反应参数：50℃孵育30min，立即置于冰上冷却。重组产物可存于-20℃。
[0183]
电泳鉴定正确后得到重组质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd-spegte(图10)，通过电介导转化入hbj-193得到重组菌hbj-193-bde。
[0184]
hbj-193-bde发酵液hplc分析如图14所示，根据所制作的麦角硫因标准曲线，得出hbj-193-bde发酵液中麦角硫因的最终浓度为25.38mg/l，较hbj-193原始菌株麦角硫因产量(图4)降低37.60％。
[0185]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合，其特征在于：为下述任一基因或基因组合：(1)spegtb；(2)spegtd；(3)spegte；(4)spegtb+spegtd；(5)spegtd+spegte；(6)spegtb+spegtd+spegte；其中，spegtb的核苷酸序列如seq id no:1所示，spegtd的核苷酸序列如seq id no:3所示，spegte的核苷酸序列如seq id no:5所示。2.权利要求1中所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的相关生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种：1)所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合编码的蛋白；2)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的表达盒；3)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的重组载体，或含有2)中所述的表达盒的重组载体；4)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的重组微生物，或含有2)中所述的表达盒的重组微生物，或含有3)所述的重组载体的重组微生物。3.根据权利要求2所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的相关生物材料，其特征在于：1)中所述的蛋白为下述任一蛋白或蛋白组合：(1)spegtb；(2)spegtd；(3)spegte；(4)spegtb+spegtd；(5)spegtd+spegte；(6)spegtb+spegtd+spegte；其中，spegtb的氨基酸序列如seq id no:2所示，spegtd的氨基酸序列如seq id no:4所示，spegte的氨基酸序列如seq id no:6所示；3)中所述的重组载体为将所述的基因或基因组合构建到pbbr1mcs-2质粒中得到；4)中所述的重组微生物为将3)中所述的重组载体转化到鞘氨醇单胞菌中得到。4.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的相关生物材料，其特征在于：3)中所述的重组载体为将spegtb+spegtd或spegtd+spegte构建到pbbr1mcs-2质粒中得到；4)中所述的重组微生物为将3)中所述的重组载体转化到鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193中得到。5.权利要求1中所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合或权利要求2-4任一项中所述的相关生物材料在合成麦角硫因中应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的应用是在鞘氨醇单胞菌体内过表达所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的应用是在鞘氨醇单胞菌体内过表达spegtb+spegtd或spegtd+spegte；所述的鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193。8.一种麦角硫因的生物合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
①
表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte的构建：利用同源重组酶同时将带有同源臂的spegtd基因片段和带有同源臂的spegtb或spegte基因片段与线性化的pbbr1mcs-2载体片段进行同源重组，得到表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte；其中，spegtb的核苷酸序列如seq id no:
1所示，spegtd的核苷酸序列如seq id no:3所示，spegte的核苷酸序列如seq id no:5所示；
②
重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de的构建：将达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte采用电介导转化的方法导入鞘氨醇单胞菌hbj-193，得到重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de；
③
重组菌的发酵：挑取重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de单菌落至lb液体培养基，并加入卡那霉素，培养，得到种子液；取种子液加至发酵培养基并加入卡那霉素，避光培养；再次加入等量的卡那霉素，继续避光培养，结束发酵；
④
麦角硫因分离与纯化：取发酵后的培养液，加入乙醇提取液，静置获得粗提液，粗提液离心，取上清液，除杂过滤，得到麦角硫因。9.根据权利要求8所述的麦角硫因的生物合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
①
中所述的同源重组采用clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒实现；
①
中所述的同源重组的10μl反应体系组成如下：
①
中所述的同源重组的反应参数：50℃孵育30min，立即冷却。10.根据权利要求8或9所述的麦角硫因的生物合成方法，其特征在于：
③
中所述的种子液的接种量为2％；
③
中所述的避光培养的条件为28℃、150rpm、72h；
③
中所述的卡那霉素的添加量按其与培养基的体积比为1mg：40ml计；
④
中所述的乙醇提取液的组成如下：每1l体系中含1.67g十二烷基硫酸钠，700ml无水乙醇，水余量；
④
中所述的乙醇提取液的添加量为发酵后的培养液的4倍体积；
④
中所述的静置的条件为4℃、12h；
④
中所述的离心的条件为12000r/min、10min。

技术总结
本发明公开了鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合及其应用。本发明提供下述任一基因或基因组合：(1)SPegtB；(2)SPegtD；(3)SPegtE；(4)SPegtB+SPegtD；(5)SPegtD+SPegtE；(6)SPegtB+SPegtD+SPegtE。本发明以鞘氨醇单胞菌HBJ-193为原始菌株，以PBBR1MCS-2为载体过表达鞘氨醇单胞菌HBJ-193麦角硫因合成基因，使得该菌株麦角硫因生产能力得到了提升，其产量最高可达73.46mg/L，较原始菌株麦角硫因产量增加44.63％，为麦角硫因的生产提供一条全新的生物合成途径，有望解决目前麦角硫因生产菌的缺点与不足。生产菌的缺点与不足。生产菌的缺点与不足。


技术研发人员：林俊芳 林俊耀 徐晴元 郭丽琼 刘汉清
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/9/11