奇异长喙壳实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒与流程

奇异长喙壳实时荧光定量pcr检测方法及检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于植物真菌病害检测鉴定技术领域，具体涉及一种奇异长喙壳实时荧光定量pcr检测方法及检测试剂盒。


背景技术：

2.椰子泻血病是椰子主要病害之一，其病原是奇异根串珠霉菌的有性世代奇异长喙壳菌。奇异长喙壳属隶属于小囊菌目、长喙壳科，奇异长喙壳对椰子的危害极大，发病初期树干茎部出现细小的病斑，随着病情发展，病斑扩大并结合成大块病斑。在树干上形成大大小小的裂缝，茎干内部组织开始腐烂，流出锈色液体，继而导致树叶凋零，植株死亡。实时荧光定量pcr用于检测鉴定植物真菌病害要符合特定引物探针设计要求，尤其要找到区别于其它近似种的特异引物和探针位点，探针选择不好会有假阳性扩增。目前没有奇异长喙壳的实时荧光定量pcr检测鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。本发明针对奇异长喙壳进行检测鉴定。
3.目前，国内外对植物真菌病害的检测鉴定主要通过分离培养后的菌落特征形态进行观察分析鉴定，探索新的方法弥补形态鉴定的不足显得尤为重要和迫切。本发明要解决的技术问题是提供一种奇异长喙壳的实时荧光定量pcr检测方法，解决奇异长喙壳特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，以达到快速准确检测鉴定奇异长喙壳的目的；为此，本发明还提供用于上述方法的检测试剂盒。利用奇异长喙壳检测引物及探针可以快速、准确地对奇异长喙壳进行检测鉴定。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种奇异长喙壳实时荧光定量pcr检测方法，该检测方法可以解决奇异长喙壳特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，从而快速准确地检测鉴定奇异长喙壳。
5.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种奇异长喙壳的实时荧光定量pcr检测方法，提取待检样品dna，利用引物和探针进行实时荧光定量pcr检测鉴定奇异长喙壳。
6.具体的，所述引物包含上游引物cp-f与下游引物cp-r，其序列为：cp-f:5'-ttaccttctggctgctttgg-3'；cp-r:5'-gcatttcgctgcgttcttca-3'。
7.具体的，所述探针序列为：cp-p:5'-ccttgggatttgcc-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。
8.具体的，所述实时荧光定量pcr检测的反应体系为25μl，包括2
×
premix ex taq（probe qpcr）12.5μl、上游引物cp-f（10μmol/l） 0.5μl、下游引物cp-r（10μmol/l） 0.5μl、探针cp-p(10μmol/l） 0.5μl、50
×
rox reference dye 0.5μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl。
9.具体的，所述实时荧光定量pcr检测方法的反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。
10.本发明还提供了一种用于实时荧光定量pcr检测奇异长喙壳的试剂盒，该检测试剂盒包括：上游引物cp-f，下游引物cp-r，探针cp-p。
11.具体的，所述上游引物cp-f序列为：5'-ttaccttctggctgctttgg-3'；所述下游引物cp-r序列为：5'-gcatttcgctgcgttcttca-3'；所述探针cp-p序列为：5'-ccttgggatttgcc-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。
12.通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：（1）通过对奇异长喙壳及近似种进行深入序列测定、序列比对及基因信息分析，确定了奇异长喙壳核糖体its基因中特定片段作为分析鉴定的靶标，根据其特异靶标序列设计特异性引物和探针，可以有效地区分奇异长喙壳及其近似种。
13.（2）可实现在核酸浓度较低的情况下对奇异长喙壳的检测，检测的最低dna浓度可达1
×
10
﹣2
ng/μl。
14.（3）可实现用一对引物、一个探针在一个反应内对奇异长喙壳实施快速、精准地鉴定溯源，且扩增效率高，解决了容易出现假阳性扩增的技术难题。
附图说明
15.图1为本发明中特异性引物cp-f/cp-r和探针cp-p在奇异长喙壳核糖体its基因上的位置示意图。
16.图2为奇异长喙壳实时荧光定量pcr检测引物cp-f/cp-r和探针cp-p组合的实时荧光定量pcr特异性检测结果。其中，a为奇异长喙壳ceratocystis paradoxa、b为甘薯长喙壳ceratocystis fimbriata、c为根串珠霉berkeleyomyces basicola、d为拟盘多毛孢pestalotiopsis palmarum、e为胶孢炭疽菌colletotrichum gloeosporioides、f为棕榈疫霉phytophthora palmivora、g为镰刀菌fusarium sp.、h为ddh2o。
17.图3为奇异长喙壳实时荧光定量pcr检测方法灵敏度检测结果。其中，a、b、c、d、e、f对应的dna模板浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、1
×
10-1
ng/μl、1
×
10-2
ng/μl、1
×
10-3
ng/μl，g为ddh2o。
具体实施方式
18.下面将对本发明实施例中的技术方案清楚、完整地进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1本实施例设计并合成了所述奇异长喙壳的检测方法所用的特异性引物和探针。
20.通过测定奇异长喙壳的核糖体基因its序列，以及genbank dna序列数据库进行比对分析，确定奇异长喙壳及其近似种的差异位点。利用mega6.0软件，根据比对结果人工寻找奇异长喙壳的特异性位点并在特异性位点上下游设计特异性引物。利用primer premier5.0软件检查设计好的引物是否存在错配、二聚体和发夹结构，并用ncbi中提供的
blast程序检查是否存在同源序列。随后在奇异长喙壳的特异性引物范围内（包括引物序列），人工寻找能与其他近似种区分开的差异位点；结合taq-man探针设计原则，通过primer express 3.0软件（applied biosystems），在特异性位点所在的位置设计探针。所设计的探针5'端荧光报告基团标记为fam（羧基荧光素），探针3'端淬灭基团标记为mgb（minor groove binder，小沟结合物）。
21.经筛选后获得一组可用于鉴定奇异长喙壳的特异性引物和探针引物，其在奇异长喙壳dna上的位置如图1所示，具体序列如下：上游引物cp-f序列为：5'-ttaccttctggctgctttgg-3'；下游引物cp-r序列为：5'-gcatttcgctgcgttcttca-3'；探针引物cp-p序列为：5'-ccttgggatttgcc-3'；其中，探针引物的5'端连接荧光基团fam，3'端连接非荧光淬灭基团mgb。
22.实施例2本实施例建立了奇异长喙壳实时荧光定量pcr鉴定技术方法，其反应体系包括：2
×
premix ex taq（probeq pcr）12.5μl、上游引物cp-f（10μmol/l）0.5μl、下游引物cp-r（10μmol/l）0.5μl、探针cp-p（10μmol/l）0.5μl、50
×
rox reference dye 0.5μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl。
23.其反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。
24.采用实施例1获得的引物cp-f/cp-r与探针cp-p组合，进行实时荧光定量pcr检测，所得实时荧光定量pcr特异性检测结果如图2所示，所得实时荧光定量pcr检测方法灵敏度检测结果如图3所示。
25.由图2可见，仅奇异长喙壳的扩增曲线存在特异性扩增，ct值为16.85，即从第16个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他及ddh2o在所有循环反应结束之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对奇异长喙壳具有特异性。
26.由图3可见，当模板浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、1
×
10-1
ng/μl、1
×
10-2
ng/μl、1
×
10-3
ng/μl时，ct值分别为16.79、20.62、24.06、27.98、32.04、36.17。由于模板浓度1
×
10-3
ng/μl的ct值﹥36，无法确定是否为阳性。所以，奇异长喙壳特异性探针cp-p的检测限位dna浓度为1
×
10-2
ng/μl。
27.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种奇异长喙壳的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于，提取待检样品dna，利用引物和探针进行实时荧光定量pcr检测鉴定奇异长喙壳；所述引物包含上游引物cp-f与下游引物cp-r，其序列为：cp-f:5'-ttaccttctggctgctttgg-3'；cp-r:5'-gcatttcgctgcgttcttca-3'。所述探针的序列为：cp-p:5'-ccttgggatttgcc-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，实时荧光定量pcr检测反应体系为25μl，包括2
×
premix ex taq（probe qpcr）12.5μl、上游引物cp-f 0.5μl、下游引物cp-r 0.5μl、探针cp-p 0.5μl、50
×
rox reference dye 0.5μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量pcr检测反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。4.权利要求1-3任一项所述的检测方法在检测奇异长喙壳中的应用。5.一种奇异长喙壳的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括：上游引物cp-f，下游引物cp-r，探针cp-p。6.根据权利要求5所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述引物的序列为：cp-f:5'-ttaccttctggctgctttgg-3'；cp-r:5'-gcatttcgctgcgttcttca-3'。7.根据权利要求5所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述探针的序列为：cp-p:5'-ccttgggatttgcc-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。8.权利要求5-7任一项所述的试剂盒在检测奇异长喙壳中的应用。

技术总结
本发明提供了一种奇异长喙壳的检测方法及检测试剂盒，经试验筛选的特异性引物（CP-F和CP-R）和探针（CP-P）组合在Taq-Man实时荧光定量PCR方法中可达到鉴定奇异长喙壳的目的。本发明方法的引物和探针特异性强、灵敏度高，检测周期短，建立奇异长喙壳快速、灵敏、准确的检测方法。检测方法。检测方法。


技术研发人员：潘英文 吴华 朱辉 于少帅 张盛敏
受保护的技术使用者：海口海关热带植物隔离检疫中心
技术研发日：2022.12.28
技术公布日：2023/9/11