一种提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法及其应用

1.本发明属于动物病毒培养技术领域，更具体地涉及一种提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法及其应用。


背景技术：

2.猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,pdcov)是近年来新发的引起猪腹泻的肠致病性冠状病毒之一，具有很强的致病性和传播性。pdcov是有囊膜单股正链rna病毒，属于套氏病毒目(nidovirales)，冠状病毒科(coronaviridae)，丁型冠状病毒属(deltacoronavirus)。pdcov可感染不同日龄的猪，新生仔猪对pdcov最为易感且发病更严重，主要通过消化道(粪便-口腔途径)传播，靶向感染猪的小肠组织，并引起新生仔猪出现严重的呕吐、水样腹泻、脱水等临床症状，死亡率高达30％-80％。日龄较大的猪感染后虽然能够恢复并处于带毒不发病的状态，但是当机体免疫力降低时，日龄较大的猪可重新排毒并引起猪群感染，严重影响猪的增重，降低饲料的报酬率，导致生产效益低下，给养猪业造成严重的经济损失。
3.目前，关于pdcov的致病机制仍不清楚，尚无特效药，传统的弱毒疫苗和灭活疫苗免疫接种是主要的防治措施。通常疫苗产生良好免疫效果的前提是高滴度的病毒，但是大多数分离的野毒株在体外细胞的适应力差，体外培养难度大，难以获得高滴度的pdcov，需要大量细胞培养，再通过浓缩病毒等方法提高pdcov的滴度，这也是目前对该病毒研究所面临的主要困难，在一定程度上制约pdcov分子生物学的研究发展，严重阻碍pdcov疫苗的研究进展。因此，如何在体外培养获得高滴度的pdcov，确保所生产pdcov疫苗效力的稳定性，仍迫切需要进一步探索和优化病毒体外培养方法和条件。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的第一目的是提供了一种提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，可以获得高滴度的pdcov。
5.本发明的第二目的是提供所述猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高pdcov病毒蛋白表达量、rna含量、病毒滴度以及疫苗生产中的应用。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，包括以下步骤，在体外培养pdcov过程中添加重金属镉。
7.优选的，所述重金属镉的浓度为7.5μm～15μm。
8.所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，包括以下步骤：
9.(1)将猪细胞置于细胞生长dmem培养基中培养；
10.(2)细胞融合达到70～90％，去除原细胞生长dmem培养基，为所述猪细胞更换新鲜无血清dmem培养基，并加入重金属镉培养3～4h；
11.(3)弃细胞上清，用pbs缓冲液冲洗步骤(2)重金属镉处理后的猪细胞，为所述猪细胞更换新鲜含胰酶的无血清dmem培养基，用pdcov感染所述猪细胞。
12.优选的，所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，具体包括以下步骤：
13.(1)将猪细胞按8
×
104个/ml铺设12孔细胞培养板，每孔加入1ml细胞生长dmem培养基，于37℃5％co2培养箱中培养；
14.(2)待所述猪细胞融合达到70～90％左右，去除原有细胞生长dmem培养基，于细胞培养板中每孔加入1ml新鲜的无血清dmem培养基，并加入重金属镉，于37℃5％co2培养箱中培养3h～4h；
15.(3)弃细胞上清，用pbs缓冲液冲洗步骤(2)重金属镉处理后的猪细胞三次，向细胞培养板孔每孔加入1ml含2ug/ml胰酶的无血清dmem培养基，加入病毒感染复数moi为1的pdcov，于37℃下继续培养。
16.优选的，所述猪细胞为pk-15细胞或ipec-j2细胞。
17.优选的，所述细胞生长dmem培养基包括10％(v/v)热灭活胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
18.本发明还提供了所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高pdcov病毒rna含量中的应用。
19.本发明还提供了所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高pdcov病毒蛋白表达量中的应用。
20.本发明还提供了所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高pdcov病毒滴度中的应用。
21.本发明还提供了所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在其疫苗生产中的应用。
22.本发明综合利用病毒学等技术，首先对重金属镉的细胞毒性进行检测；通过荧光定量pcr(rt-pcr)对无细胞毒性的重金属镉浓度进行筛选，鉴定出可以显著提高pdcov体外培养rna含量的重金属镉浓度；再分别通过免疫印迹法(wb)和病毒蚀斑形成实验进一步确定显著提高pdcov体外培养病毒蛋白表达和子代病毒滴度的重金属镉浓度。
23.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)利用本发明所述的方法能够显著提高病毒感染量，在pk-15细胞或ipec-j2细胞体外培养pdcov过程中添加7.5μm～15μm重金属镉，与未加重金属镉处理组相比，添加有重金属镉处理组pdcov的rna含量和蛋白表达明显升高，且收获子代病毒滴度明显升高；(2)本发明、在不增加额外生产成本的基础上，可使单位时间收获子代病毒量大幅提高，约为未添加镉处理的2～3倍；(3)本发明提供的pdcov感染细胞信息丰富了pdcov增殖机制，为后续研究pdcov致病机理提供了参考，本发明提供的方法还可应用于pdcov疫苗生产。
附图说明
24.图1是不同浓度的重金属镉短期对pk-15细胞毒性；ns表示无显著差异，**表示p《0.01；
25.图2是不同浓度的重金属镉长期对pk-15细胞毒性；ns表示无显著差异，**表示p《0.01；
26.图3是pk-15细胞培养pdcov rna含量；**表示p《0.01；
27.图4是pk-15细胞培养pdcov病毒蛋白含量；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)为细胞
内参；
28.图5是st细胞培养pdcov病毒蚀斑形成试验；每个病毒空斑为一个病毒颗粒；
29.图6是pk-15细胞培养pdcov感染量的重金属镉浓度依赖性；a：不同重金属镉浓度处理下pdcov rna含量；b：不同重金属镉浓度处理下pdcov病毒蛋白含量；c：不同重金属镉浓度处理下病毒空斑数量；**表示p《0.01；
30.图7是ipec-j2细胞培养pdcov感染量；a：不同重金属镉浓度处理下pdcov rna含量；b：不同重金属镉浓度处理下pdcov病毒蛋白含量；c：不同重金属镉浓度处理下病毒空斑数量；**表示p《0.01。
具体实施方式
31.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
32.pk-15细胞由实验室保藏；ipec-j2细胞来源于美国宾夕法尼亚大学；st细胞由实验室保藏。
33.实施例1重金属镉对pk-15细胞短期毒性鉴定
34.(1)将pk-15细胞按1
×
104个/ml铺设96孔细胞培养板，每孔加入100μl含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素(美国gibco公司)的dmem培养基(上海源培生物科技股份有限公司，货号l110kj)，于37℃5％co2培养箱中培养；
35.(2)待细胞融合达到70～80％，去除原有dmem培养基，于细胞培养板中每孔加入1ml新鲜的无血清dmem培养基，加入浓度为1.5μm的重金属镉(美国sigma公司，货号202908)，于37℃5％co2培养箱中培养3h；
36.另设置重金属镉浓度分别为7.5、15、30、60、150μm的实验组，以及未添加重金属镉的空白对照组；
37.(3)去除原有dmem培养基，向细胞培养板孔每孔加入100μl无血清dmem培养基；加入10μl中国南京诺唯赞公司cck-8solution试剂(货号a311)于37℃5％co2培养箱中培养3～4h。
38.按照操作说明进行细胞毒性鉴定，结果如图1所示，未加重金属镉的空白对照细胞活性为100％，与空白对照相比，重金属镉浓度≤30μm时，细胞活性cck8无明显差异，即无细胞毒性，可用于后续实施例。
39.实施例2重金属镉对pk-15细胞长期毒性鉴定
40.步骤同实施例1，区别在于步骤(2)细胞于37℃5％co2培养箱中培养24h。
41.结果如图2所示，未加重金属镉的空白对照细胞活性为100％，与空白对照相比，重金属镉浓度≤15μm时，细胞活性cck8无明显差异，即无细胞毒性，可用于后续实施例。
42.实施例3重金属镉对pk-15细胞培养pdcov rna含量影响
43.(1)将pk-15细胞按8
×
104个/ml铺设12孔细胞培养板，每孔加入1ml含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素(美国gibco公司)的dmem培养基(上海源培生物科技股份有限公司，货号l110kj)，于37℃5％co2培养箱中培养；
44.(2)待细胞融合达到70～90％，去除原有dmem培养基，于细胞培养板中每孔加入1ml新鲜的无血清dmem培养基，加入浓度为1.5μm的重金属镉(美国sigma公司，货号202908)，于37℃5％co2培养箱中培养3h；
45.另设置未添加重金属镉的空白对照组；
46.(3)弃细胞上清，用磷酸盐缓冲液pbs冲洗细胞三次，向细胞培养板孔每孔加入1ml含2μg/ml胰酶的无血清dmem培养基；加入病毒感染复数moi为1的pdcov(chn-gd16-05毒株，genbank编号ky363868.1)，于37℃5％co2培养箱下继续培养；
47.(4)待病毒引起pk-15细胞病变时；弃细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，使用rna提取试剂trizol(大连takara公司)收集细胞，提取pdcov感染细胞的总rna，使用hiscript q rt supermix for qpcr(+gdna wiper)反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)生成互补dna(cdna)作为rt-pcr模板；因pdcov核衣壳蛋白(n)基因常被用于代表病毒rna含量。采用南京诺唯赞aceq qpcr sybr green master mix试剂，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)作为细胞内参，用gapdh mrna对病毒rna进行标准化，并通过2
‑△△
ct
方法进行相对定量rt-pcr对pdcov n rna含量进行测定；引物和反应体系见表1和表2，使用abi荧光定量pcr仪(美国applied biosystems公司)，反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，以上40个循环；扩增完成后进行融解曲线分析，其程序为：95℃15s，60℃1min；95℃15s。根据熔解曲线具有85
±
0.8℃tm扩增的特异性判断引物的特异性，每个待测样本均进行3次重复检测，取平均值。
48.结果如图3所示，与未加重金属镉处理相比，15μm重金属镉处理下pdcov rna含量约为空白对照的3.39倍，说明重金属镉能够提高pk-15细胞培养pdcov rna含量。
49.表1荧光定量pcr引物序列
50.引物名称序列(5
’‑3’
)pdcov-nforwardcccagctcaaggtttcagagpdcov-nreverseattggcaccagtacgagaccgapdhforwardtcatcatctctgccccttctgapdhreversegtcatgagtccctccacgat
51.表2荧光定量pcr反应体系
52.试剂使用量2
×
aceqqpcrsybrgreenmastermix10μlpdcov-nforward(10μm)0.4μlpdcov-nreverse(10μm)0.4μlgapdhforward(10μm)0.4μlgapdhreverse(10μm)0.4μlcdna(50ng)2μlddh2o补充至20μl
53.实施例4重金属镉对pk-15细胞培养pdcov病毒蛋白表达影响
54.步骤(1)至(3)同实施例3，不同之处在于：
55.(4)待病毒引起pk-15细胞病变时，弃细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，洗去细胞表面的残余病毒粒子，弃掉pbs，加入100μl细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号p0013b)获取全细胞裂解液；以4℃，12000rpm离心15min，获取细胞裂解液上清，加入5
×
蛋白上样缓冲液，沸水煮样10min后短暂离心；以相同含量甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)为标准调节上样量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)；按恒压110v转膜
1h，将蛋白样品转移至0.22μm的聚偏二氟乙烯膜(pvdf，美国merck millipore公司)；用含5％(v/v)脱脂奶粉的tbst室温封闭1h；分别以本实验室的鼠抗pdcov n和南京巴傲得生物科技有限公司鼠抗gapdh(货号mb001)作为一抗，4℃过夜孵育；tbst洗涤3次，每次10min，再以辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠抗体(南京巴傲得生物科技有限公司，货号bs12478)作为二抗，室温孵育1h；tbst洗涤3次，使用超敏ecl化学发光试剂盒(苏州新赛美生物科技有限公司，货号p10300)分别对pdcov n和gapdh的蛋白水平进行wb显色。
56.结果如图4显示，在gapdh含量相同的条件下，与未加重金属镉处理相比，15μm重金属镉处理下条带增粗约为未加重金属镉处理的3倍，说明重金属镉能够显著提高pdcov病毒蛋白含量。
57.实施例5重金属镉对pk-15细胞培养pdcov病毒滴度影响
58.步骤(1)至(3)同实施例3，不同之处在于：
59.(4)待病毒引起pk-15细胞病变时，进行病毒滴度实验(病毒蚀斑形成实验)。将未感染的st细胞稀释至8
×
104个/ml铺设12孔细胞培养板，每孔加入1ml dmem培养基，置于37℃5％co2培养箱培养；待细胞融合达到80～90％，取上述感染的pk-15细胞上清液分别稀释10、100、1000、10000倍，接种于已铺设12孔细胞培养板的st细胞，每孔接种稀释后的pk-15细胞上清液500μl，于37℃5％co2培养箱培养2h，弃上清后加入1ml 1％低熔点琼脂于室温下凝固，将该12孔细胞培养板放于37℃5％co2培养箱培养；另以空白dmem培养基代替感染细胞上清液作为空白对照；每24h观察一次细胞的生长状态，观察1～3d，直至细胞出现明显病毒蚀斑并记录统计每个处理组的病毒蚀斑数量。
60.病毒破坏健康的细胞后会留下痕迹，称之为空斑。通过检测空斑，可以得出病毒的浓度(效价或滴度)和毒性等相关信息。对上述4个稀释梯度进行比较发现，当稀释液的病毒颗粒较多，即感染的pk-15细胞上清液分别稀释10、100的情况下，st细胞全部死亡，不能形成活细胞和死细胞相间的实验结果；当稀释液的病毒颗粒较少，即感染的pk-15细胞上清液稀释10000倍的情况下，空斑形成不明显，无法比较。因此选取稀释浓度为1000的pk-15细胞上清液感染st细胞形成的蚀斑作为最佳实验结果，用于和空白对照进行比较。
61.结果如图5所示，与未加重金属镉处理相比，15μm重金属镉处理下pdcov病毒空斑数量明显增多，数量约为空白对照的3倍，说明重金属镉能够显著提高pk15细胞培养pdcov子代病毒滴度。
62.实施例6重金属镉剂量对pk-15细胞培养pdcov感染量的影响
63.步骤(1)和(3)同实施例3，不同之处在于：
64.(2)待细胞融合达到70～90％，去除原有dmem培养基，于细胞培养板中每孔加入1ml新鲜的无血清dmem培养基，加入浓度为1.5μm的重金属镉(美国sigma公司，货号202908)，于37℃5％co2培养箱中培养3h；
65.另设置重金属镉浓度为7.5μm的实验组，以及未添加重金属镉的空白对照组；
66.(4)待病毒引起pk-15细胞病变时，按实施例3、4和5所述方法，分别对浓度为0、7.5和15μm的重金属镉处理下，pk-15细胞培养的pdcov rna、蛋白和病毒滴度进行检测。
67.结果如图6所示，与未加重金属镉的空白对照处，添加有7.5μm和15μm重金属镉处理组pdcov rna相对含量、蛋白含量和子代病毒滴度(病毒空斑数量)均明显升高，其中7.5μm浓度重金属处理各项指标约为空白对照的2倍，15μm浓度重金属处理各项指标约为空白对
照的3倍，说明重金属镉能够提高pk-15细胞培养pdcov rna、蛋白和子代病毒滴度，证实了7.5～15μm重金属镉能够提高pk-15细胞培养pdcov感染量。
68.实施例7重金属镉对ipec-j2培养pdcov rna含量影响
69.ipec-j2为pdcov感染猪体内的主要靶细胞。为验证重金属镉是否也能提高ipec-j2培养prrsv感染量，对重金属镉处理后pdcov rna、蛋白和子代病毒滴度进行检测。
70.步骤(1)和(3)同实施例3，所培养与感染猪细胞换为ipec-j2，另有不同之处在于：
71.(4)待病毒感染ipec-j2 24h时，按实施例3、4和5方法，分别检测15μm重金属镉对ipec-j2细胞培养pdcov rna、蛋白和子代病毒滴度。
72.结果如图7所示，与未加重金属镉的空白对照相比，添加有15μm重金属镉处理组的pdcov rna相对含量、蛋白含量和子代病毒滴度(病毒空斑数量)均明显升高，各项指标约为空白对照的3倍，说明重金属镉能够提高ipec-j2细胞培养pdcov rna、蛋白和病毒滴度，证实了重金属镉能够提高ipec-j2培养pdcov的感染量。

技术特征：
1.一种提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，其特征在于，包括以下步骤，在体外培养pdcov过程中添加重金属镉。2.根据权利要求1所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，其特征在于，所述重金属镉的浓度为7.5μm～15μm。3.根据权利要求1-2任一项所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将猪细胞置于细胞生长dmem培养基中培养；(2)细胞融合达到70～90％，去除步骤(1)所述细胞生长dmem培养基，为所述猪细胞更换新鲜无血清dmem培养基，并加入重金属镉培养3～4h；(3)弃细胞上清，用pbs缓冲液冲洗步骤(2)重金属镉处理后的猪细胞，为所述猪细胞更换新鲜含胰酶的无血清dmem培养基，用pdcov感染所述猪细胞。4.根据权利要求3所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，其特征在于，所述猪细胞为pk-15细胞或ipec-j2细胞。5.根据权利要求3所述的提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，其特征在于，步骤(1)中所述细胞生长dmem培养基包括dmem培养基、热灭活胎牛血清、青霉素、链霉素。6.一种权利要求1所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高pdcov病毒rna含量中的应用。7.一种权利要求1所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高pdcov病毒蛋白表达量中的应用。8.一种权利要求1所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在提高病毒滴度中的应用。9.一种权利要求1所述提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法在其疫苗生产中的应用。

技术总结
本发明公开了一种提高猪德尔塔冠状病毒体外培养感染量的方法，在PK-15细胞或IPEC-J2细胞体外培养PDCoV过程中添加重金属镉，重金属镉的添加浓度为7.5μM～15μM。与未加重金属镉处理组相比，添加有重金属镉处理组PDCoV的RNA含量、蛋白表达量，以及收获子代病毒滴度显著提高，各项指标约为空白对照的2～3倍。本发明提供的PDCoV感染细胞信息丰富了PDCoV增殖机制，为后续研究PDCoV的致病机理奠定基础，本发明提供的方法还可应用于PDCoV疫苗生产。本发明提供的方法还可应用于PDCoV疫苗生产。本发明提供的方法还可应用于PDCoV疫苗生产。


技术研发人员：张帅 包文斌 王海飞 陈振海 吴正常 吴圣龙
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2022.09.30
技术公布日：2023/9/11