一种夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种药品、保健品、食品或化妆品的质量分析方法，特别涉及一种夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法及其应用。


背景技术：

2.夏枯草为唇形科(lamiaceae)植物夏枯草prunella vulgaris l.的干燥果穗，始载于《神农本草经》，因“此草夏至后即枯”而得名，是一种药食同源的多年生草本植物，至今已有几千年的药用历史，现收载于2015年版之《中国药典》。夏枯草味苦、辛，性寒，归肝、胆经，可清肝散火、明目、散结消肿，对目赤肿痛、畏光流泪、目珠夜痛、头晕目眩、瘰疬、瘿瘤、乳腺癌、高血压、淋巴结核、浸润性肺结核、单纯性甲状腺肿、腮腺炎、急性黄疸型传染性肝炎等多种疾病均有良好的临床治疗效果。现代研究表明，夏枯草中含有多种化学成分：包括三萜、甾醇、黄酮、有机酸、香豆素等类型化合物，其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、降血压、降血糖、降血脂等药理作用。夏枯草籽为唇形科(lamiaceae)植物夏枯草prunella vulgaris l.的干燥成熟种子，为夏枯草的生殖种子，应具有夏枯草的遗传活性物质与作用，但其在食用、保健或药物中的应用价值还未受到重视，还未见到其异迷迭香酸苷的相关报导，特别是夏枯草籽中异迷迭香酸苷的质量控制方法更是空白。
3.异迷迭香酸苷(结构式如下所示)又名迷迭香酸苷，英文名称：salviaflaside，rosmarinic acid-3-o-glucoside，分子式：c
24h26o13
，分子量:522.4；为白色结晶性粉末，可溶于甲醇、乙醇、dmso等有机溶剂，药理研究表明，异迷迭香酸苷具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎活性、免疫抑制活性、抗血栓的作用。异迷迭香酸苷为迷迭香酸与一分子葡萄糖结合形成的苷，应具有和迷迭香酸相同或相近的药理作用。异迷迭香酸苷的药理研究的报道相对较少，而迷迭香酸的药理研究的报道相对较多。现代药理研究表明：迷迭香酸具有抗氧化、抗菌抗炎、抗肿瘤、抗抑郁和抗焦虑、改善肾脏疾病、保肝等多方面药理学活性。其作用及作用机理主要为：
⑴
抗氧化作用：迷迭香酸具有较强的抗氧化和清除体内自由基的作用，该作用与其邻二酚羟基的结构有关；
⑵
抗菌抗炎作用：迷迭香酸对金黄色葡萄球菌、藤黄细球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等细菌均有明显的抑制作用，对牛皮癣、皮肤炎、呼吸道炎症、急性肺损伤等多种炎症均有一定的抑制作用；
⑶
抗肿瘤作用：迷迭香酸对结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肺癌、肝癌等多种肿瘤有明显的抑制作用，其抗肿瘤机制可能与提高机体免疫功能和有效地抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭并诱导凋亡有关；
⑷
抗抑郁和抗焦虑作用：迷迭香酸的抗抑郁作用，体外实验发现迷迭香酸可促进新生大鼠星形胶质细胞的增殖，体内实验发现迷迭香酸可改善慢性不可预见应激抑郁模型大鼠的抑郁样行为，低剂量的迷迭香酸能够发挥抗焦虑作用；
⑸
保肝作用：迷迭香酸能够抑制肝星状细胞hscs的增殖分化，通过抑制tgf-β1和ctgf的表达对抗四氯化碳诱导的抗纤维化；
⑹
改善肾脏疾病作用：迷迭香酸有改善肾脏相关疾病的作用，主要表现为减少尿酸生成，抑制肾小球肾炎以及延缓慢性肾功能不全。
[0004][0005]
本发明首次发现夏枯草籽中富含异迷迭香酸苷成分，并首次创立了夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，该检测方法包括利用薄层色谱法对夏枯草籽异迷迭香酸苷进行定性鉴别；利用极性溶剂提取法将脂溶性成分与异迷迭香酸苷类极性成分分离，再用异迷迭香酸苷对照品对照，用高效液相色谱法对夏枯草籽中的异迷迭香酸苷进行含量测定。为夏枯草籽及其制品的开发和利用提供了方法和依据。


技术实现要素：

[0006]
本发明的首要目的是针对夏枯草籽的质量控制方法还是空白，首次发现了夏枯草籽中富含异迷迭香酸苷成分，并首次建立开了夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，从而提供一种具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法。
[0007]
本发明的另一目的在于提供上述夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法的应用。
[0008]
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，包括如下步骤：利用薄层色谱法对夏枯草籽中异迷迭香酸苷进行定性鉴别；利用特定的极性溶剂提取法直接提取异迷迭香酸苷并与脂溶性成分分离，再以异迷迭香酸苷对照品对照，用高效液相色谱法对夏枯草籽中的异迷迭香酸苷进行含量测定。
[0009]
所述的薄层色谱检测法的具体步骤如下：
[0010]
(1)供试品溶液的制备：
[0011]
夏枯草籽供试品溶液的制备：
[0012]
a、将夏枯草籽粉末加入甲醇水溶液中超声提取，过滤，得到的滤液除去溶剂，得到残渣；
[0013]
b、残渣用甲醇溶解，过滤，得到夏枯草籽粉供试品溶液；
[0014]
(2)对照品溶液的制备：用甲醇溶解异迷迭香酸苷对照品，作为对照品溶液；
[0015]
(3)薄层色谱(tlc)检测：吸取供试品溶液和对照品溶液分别点于同一高效硅胶gf
254
薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干；
[0016]
(4)观察硅胶gf
254
薄层板：分别置紫外光灯254nm与紫外光灯365nm下检识；观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出夏枯草籽中是否含有异迷迭香酸苷成分。
[0017]
步骤(1)中所述的夏枯草粉末优选为通过如下步骤得到：将夏枯草籽粉碎破壁，过至少40目筛，得到夏枯草粉末。
[0018]
所述的筛优选为40-50目的筛。
[0019]
步骤(1)a中所述的甲醇水溶液中甲醇的含量优选为体积百分比40～60％；更优选体积百分比50％。
[0020]
步骤(1)a中所述的甲醇水溶液的用量优选按1.0～5.0g夏枯草籽粉末配比50～250ml甲醇水溶液计算；更优选按2.0g夏枯草籽粉末配比100ml甲醇水溶液计算。
[0021]
步骤(1)a中所述的超声提取的条件优选为于功率50～200w、频率40～60khz提取20～80分钟；更优选为于功率80～150w、频率45～50khz提取30～60分钟；最优选为于功率150w、频率45khz提取45分钟。
[0022]
步骤(1)a所述的过滤可通过滤纸过滤，也可以通过滤膜过滤。
[0023]
所述的滤膜优选为0.45μm滤膜。
[0024]
步骤(1)a中所述的除去溶剂优选为通过水浴加热蒸发方式除去溶剂。
[0025]
步骤(1)b中所述的甲醇的用量优选按1.0～5.0g夏枯草籽粉末配比1～5ml甲醇计算；更优选按2.0g夏枯草籽粉末配比2ml甲醇水溶液计算。
[0026]
步骤(1)b中所述的过滤优选为使用0.45μm的滤膜过滤。
[0027]
步骤(2)中所述的对照品溶液中异迷迭香酸苷的浓度优选为0.9～1.1mg/ml；更优选为0.95～1mg/ml。
[0028]
步骤(3)中所述的供试品溶液的用量为2～10μl；更优选为4μl。
[0029]
步骤(3)中所述的对照品溶液的用量为2～10μl；更优选为4μl。
[0030]
步骤(3)中所述的展开剂优选为甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液；更优选为按体积比4.4～4.6:2.4～2.6:2.4～2.6:0.4～0.6混合得到的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液；最优选为按体积比4.5:2.5:2.5:0.5混合得到的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液。
[0031]
所述的特定的极性溶剂提取法是以体积百分比45-55％的甲醇水溶液直接提取异迷迭香酸苷，能有效地提取异迷迭香酸苷，并与脂溶性成分分离。
[0032]
所述的甲醇水溶液优选体积百分比50％的甲醇水溶液。
[0033]
所述的高效液相色谱检测法的具体步骤如下：
[0034]
1)色谱条件：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-甲醇-0.2％(v/v)乙酸水溶液为流动相，检测波长为319nm；理论板数按异迷迭香酸苷峰计算应不低于8000；
[0035]
2)对照品溶液的制备：精密称定异迷迭香酸苷对照品，用甲醇水溶液溶解并定容，得到异迷迭香酸苷对照品溶液；
[0036]
3)供试品溶液的制备：取夏枯草籽粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液，精密称重，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0037]
4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱议，测定，即得。
[0038]
步骤1)中所述的流动相优选为乙腈、甲醇和0.2％(v/v)乙酸水溶液按体积比14-16:11-13:72-74配比得到；更优选为乙腈、甲醇和0.2％(v/v)乙酸水溶液按体积比15:12:73配比得到。
[0039]
步骤1)中所述的色谱中的色谱柱优选为ultimate xb-c18色谱柱。
[0040]
步骤1)中所述的色谱中的柱温为24-27℃；更优选为25℃。
[0041]
步骤1)中所述的流动相的流速优选为0.8-1.2ml/min；更优选为1ml/min。
[0042]
步骤2)中所述的甲醇水溶液优选浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；更优选浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液。
[0043]
步骤2)中所述的异迷迭香酸苷对照品溶液的浓度优选为每lml含0.05-0.06mg异迷迭香酸苷。
[0044]
步骤3)中所述的夏枯草粉末优选为通过如下步骤得到：将夏枯草籽粉碎破壁，过至少40目筛，得到夏枯草粉末。
[0045]
步骤3)中所述的甲醇水溶液优选浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；更优选浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液。
[0046]
步骤3)中所述的甲醇水溶液的用量优选按每0.5-1.5g夏枯草籽粉末配比50-150ml甲醇水溶液计算；更优选按每1.0g夏枯草籽粉末配比100ml甲醇水溶液计算。
[0047]
步骤3)中所述的超声的条件优选为功率500-700w、频率30-50khz处理40-80分钟；更优选为于功率600w、频率40khz处理30-60分钟。
[0048]
步骤4)中所述的对照品溶液的吸取体积和所述的供试品溶液的吸取体积优选按体积比1：1配比。
[0049]
所述的对照品溶液的吸取体积优选为10μl。
[0050]
所述的供试品溶液的吸取体积优选为10μl。
[0051]
本品按干燥品计算，夏枯草籽含异迷迭香酸苷(c
24h26o13
)不得少于0.35％。
[0052]
所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法在夏枯草籽及其制品开发中的应用。
[0053]
夏枯草是我国药典收载的一种药食同源的常见药味，其野生与种植资源十分丰富，但由于夏枯草籽未被开发利用，致使每年成千上万吨的夏枯草籽未被收集，散落在荒地野外，造成资源浪费。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0054]
1、本发明首次提供了一种夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，为夏枯草籽及夏枯草籽油开发利用提供了方法和依据，将减少夏枯草籽的资源浪费；
[0055]
2、本发明首次发现了夏枯草籽中富含异迷迭香酸苷类成分，为夏枯草籽的保健与药用提供了依据；
[0056]
3、本发明提供的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好等特点。
附图说明
[0057]
图1是夏枯草籽中异迷迭香酸苷的tlc鉴别结果在紫外光灯254nm下的照片图；其中，1、2、3、4、6、7为夏枯草籽供试品，5为异迷迭香酸苷对照品。
[0058]
图2是夏枯草籽中异迷迭香酸苷的tlc鉴别结果在紫外光365nm下的照片图；其中，1、2、3、4、6、7为夏枯草籽供试品，5为异迷迭香酸苷对照品。
[0059]
图3是异迷迭香酸苷对照品hplc色谱图。
[0060]
图4是夏枯草籽中异迷迭香酸苷的hplc色谱图。
[0061]
图5是夏枯草籽中空白提取溶剂的hplc色谱图。
[0062]
图6是异迷迭香酸苷标准溶液线性拟合曲线图。
具体实施方式
[0063]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0064]
实施例1夏枯草籽中异迷迭香酸苷的薄层色谱(tlc)检测
[0065]
(1)供试品溶液的制备：取夏枯草籽样品6份，分别粉碎破壁，过40目筛，准确称取夏枯草籽粉各2.0g，分别加入含50％(v/v)甲醇的水溶液100ml，超声(功率150w、频率45khz)提取45min，过滤，滤液置蒸发皿中，水浴加热蒸发至干，残渣加甲醇2ml使溶解，0.45μm滤过，分别得夏枯草籽粉供试品1、2、3、4、6、7号溶液，备用。
[0066]
(2)对照品溶液的制备：称取异迷迭香酸苷对照品1.96mg，加甲醇2ml使溶解，成每lml含0.98mg异迷迭香酸苷对照品溶液，作为对照品溶液，编号5号，备用。
[0067]
(3)薄层色谱(tlc)检测：
[0068]
按照《中华人民共和国药典》一部2015年版一部中薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一高效硅胶gf
254
薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸(4.5:2.5:2.5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干；分别置紫外光灯(254nm)与置紫外光灯(365nm)下检识；
[0069]
紫外光灯(254nm)下检识：供试品色谱中，在与对照品异迷迭香酸苷色谱相应的位置上，显相同的荧光淬灭斑点；见图1。
[0070]
置紫外光灯(365nm)下检识：供试品色谱中，在与对照品异迷迭香酸苷色谱相应的位置上，显相同的颜色荧光斑点；见图2。
[0071]
(4)薄层色谱(tlc)检测结果与结论：
[0072]
从紫外光灯254nm下检识和紫外光灯(365nm)下检识的结果证明：6份夏枯草籽样品中均含有异迷迭香酸苷成分；且6份供试品色谱中的异迷迭香酸苷成分色谱基本相同。
[0073]
实施例2夏枯草籽中异迷迭香酸苷的含量测定方法及方法学验证
[0074]
1原理与试药
[0075]
1.1原理
[0076]
夏枯草籽中所含的异迷迭香酸苷为极性水溶性类物质，利用极性溶剂提取法将极性成分异迷迭香酸苷提取同时与脂溶性成分分离，用高效液相色谱法对异迷迭香酸苷成分进行含量测定。
[0077]
1.2试剂
[0078]
乙酸分析纯，甲醇分析纯、甲醇色谱纯、乙腈色谱纯，异迷迭香酸苷对照品(批号dstdy055001，纯度：hplc≥98％)四川成都乐美天医药/德思特生物出品；夏枯草籽样品，江西鑫康健生态农业开发有限公司。
[0079]
1.3仪器
[0080]
by-500a高速万能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；赛默飞u3000系列高效液相色谱仪(u紫外检测器)，德国赛默公司；bt125d型十万分之一电子分析天平，德国赛多利斯公司；sb25-12td型新芝超声清洗机，愽纳清洗设备有限公司；紫外光灯；水浴锅；常用玻璃仪器；干燥箱。
[0081]
2方法与结果
[0082]
2.1对照品溶液制备
[0083]
精密称取异迷迭香酸苷对照品5.51mg，置于100ml容量瓶中，用50％(v/v)甲醇溶解并定容，即得异迷迭香酸苷对照品溶液。
[0084]
2.2供试品溶液制备
[0085]
夏枯草籽供试品溶液的制备：取夏枯草籽，粉碎破壁，过40目筛，称取夏枯草籽粉约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含50％(v/v)甲醇的水溶液100ml，精密称重，超声处理(功率600w，频率40khz)60分钟，放冷，再称定重量，用含50％(v/v)甲醇的水溶液补足减失的重量，摇匀，0.45μm滤过，取续滤液，得夏枯草籽供试品溶液。
[0086]
2.3色谱条件
[0087]
采用ultimate xb-c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，柱温25℃，检测波长319nm，流速1ml/min，进样量：对照品溶液、供试品溶液均为10μl，流动相为乙腈-甲醇-0.2％乙酸水溶液(15:12:73)；色谱图见图3-5。
[0088]
从色谱图见图3-5可知，在异迷迭香酸苷对照品hplc色谱图中，在保留时间11.5分钟左右有异迷迭香酸苷对照品的吸收峰呈现，在夏枯草籽的hplc色谱图中在保留时间11.5分钟左右有异迷迭香酸苷的吸收峰出现，且峰形与异迷迭香酸苷对照品的峰形一至，分离度良好，异迷迭香酸苷的塔板数在13000左右。而在空白提取溶剂的hplc色谱图中未见异迷迭香酸苷的吸收峰；提示夏枯草籽中的异迷迭香酸苷的hplc测定条件成熟可用。
[0089]
2.4线性关系考察
[0090]
取“2.1”项下对照品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，按“2.3”项下色谱条件，分别取2、4、8、12、16、20μl进样，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1和图6；得回归方程：y＝30.928x-1.5175，r2＝0.9998。
[0091]
表1异迷迭香酸苷线性关系实验数据(n＝6)
[0092][0093]
y＝30.928x-1.5175，r2＝0.9998
[0094]
以上结果表明：异迷迭香酸苷在0.2204～2.2040μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
[0095]
2.5精密度试验：精密吸取“2.1”项下异迷迭香酸苷对照品溶液10μl，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，计算异迷迭香酸苷峰面积值的平均值为15.596，rsd为1.68％，峰面积值的rsd《2％，结果见表2；结果表明仪器精密度良好。
[0096]
表2精密度试验数据(n＝6)
[0097][0098]
2.6稳定性试验：取“2.2”项下的夏枯草籽供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分
别于0小时、1小时、4小时、8小时、12小时、24小时，分别进样20μl，测定异迷迭香酸苷峰面积值，计算夏枯草籽供试品中异迷迭香酸苷峰面积值的平均值为14.671，rsd为1.62％；测得样品中异迷迭香酸苷峰面积的rsd《2％，结果见表3。
[0099]
表3稳定性试验数据(n＝6)
[0100][0101]
试验结果表明，样品供试液在24小时内稳定性良好。
[0102]
2.7重现性试验：取同一批号夏枯草籽样品(批号20220314)，按“2.2”项下的夏枯草籽供试品溶液的制备方法制备6份夏枯草籽样品液；分别按“2.3”项下色谱条件，进样测定，计算异迷迭香酸苷含量；夏枯草籽样品中异迷迭香酸苷含量的平均值为0.5234％，rsd为1.88％；测得样品中异迷迭香酸苷含量的rsd《2％。结果见表4。
[0103]
表4重现性试验数据(n＝6)
[0104][0105]
试验结果表明，该测定方法的重现性良好。
[0106]
2.8回收率试验：精密称取已知含量同一批号夏枯草籽样品(批号20220314)6份，每份0.5g，分别精密加入加入相当于样品中异迷迭香酸苷含量100％的对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液；再按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算异迷迭香酸苷含量及回收率，结果夏枯草籽样品中异迷迭香酸苷的平均回收率为99.81％，rsd为2.21％。结果见表5。
[0107]
表5异迷迭香酸苷加样回收率试(n＝6)
[0108][0109]
试验结果表明：夏枯草籽的异迷迭香酸苷回收率在97.74-102.63％之间，样品的加样回收良好。
[0110]
实施例3三批夏枯草籽中异迷迭香酸苷的含量测定
[0111]
按照上述实施例3含量测定的方法操作，分别测定3个不同批次的夏枯草籽样品中异迷迭香酸苷的含量，结果见表6。
[0112]
表6夏枯草籽中异迷迭香酸苷的含量测定结果(n＝3)
[0113][0114]
测得三批夏枯草籽中异迷迭香酸苷的含量在0.4376％-0.55234％之间；
[0115]
讨论：本研究结果表明，夏枯草籽中异迷迭香酸苷的含量测定在线性范围内线性关系良好，其精密度、稳定性、重现性、回收率试验均符合要求。本研究为首次发现夏枯草籽中含有丰富的异迷迭香酸苷成分，本测定方法同样也是首次创立夏枯草籽中异迷迭香酸苷的hplc的检测方法，为夏枯草籽的质量控制提供了方法和依据；由于异迷迭香酸苷为水溶性成分，在夏枯草籽油(用压榨法或常规超临界co2萃取得到，详见专利申请“2022102354058”和“202210235666x”)中难以溶解，所以，在夏枯草籽油中几乎不含异迷迭香酸苷成分。
[0116]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于包括如下步骤：利用薄层色谱法对夏枯草籽中异迷迭香酸苷进行定性鉴别；利用特定的极性溶剂提取法直接提取异迷迭香酸苷并与脂溶性成分分离，再以异迷迭香酸苷对照品对照，用高效液相色谱法对夏枯草籽中的异迷迭香酸苷进行含量测定。2.根据权利要求1所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：所述的薄层色谱检测法的具体步骤如下：(1)供试品溶液的制备：夏枯草籽供试品溶液的制备：a、将夏枯草籽粉末加入甲醇水溶液中超声提取，过滤，得到的滤液除去溶剂，得到残渣；b、残渣用甲醇溶解，过滤，得到夏枯草籽粉供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：用甲醇溶解异迷迭香酸苷对照品，作为对照品溶液；(3)薄层色谱检测：吸取供试品溶液和对照品溶液分别点于同一高效硅胶gf
254
薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干；(4)观察硅胶gf
254
薄层板：分别置紫外光灯254nm与紫外光灯365nm下检识；观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上是否存在相同颜色的斑点，即可鉴定出夏枯草籽中是否含有异迷迭香酸苷成分。3.根据权利要求2所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的夏枯草粉末通过如下步骤得到：将夏枯草籽粉碎破壁，过至少40目筛，得到夏枯草粉末；步骤(1)a中所述的超声提取的条件为于功率50～200w、频率40～60khz提取20～80分钟；步骤(1)a中所述的甲醇水溶液中甲醇的含量为体积百分比40～60％；步骤(1)a中所述的甲醇水溶液的用量按1.0～5.0g夏枯草籽粉末配比50～250ml甲醇水溶液计算；步骤(1)b中所述的甲醇的用量按1.0～5.0g夏枯草籽粉末配比1～5ml甲醇计算；步骤(3)中所述的展开剂为甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液。4.根据权利要求3所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：步骤(1)a中所述的超声提取的条件为于功率80～150w、频率45～50khz提取30～60分钟步骤(1)a中所述的甲醇水溶液中甲醇的含量为体积百分比50％；步骤(1)b中所述的甲醇的用量按2.0g夏枯草籽粉末配比2ml甲醇水溶液计算；步骤(3)中所述的展开剂为按体积比4.4～4.6:2.4～2.6:2.4～2.6:0.4～0.6混合得到的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸溶液。5.根据权利要求2所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：步骤(1)a中所述的除去溶剂为通过水浴加热蒸发方式除去溶剂；步骤(1)b中所述的过滤为使用0.45μm的滤膜过滤；步骤(2)中所述的对照品溶液中异迷迭香酸苷的浓度为0.9～1.1mg/ml；步骤(3)中所述的供试品溶液的用量为2～10μl；
步骤(3)中所述的对照品溶液的用量为2～10μl。6.根据权利要求1所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：所述的特定的极性溶剂提取法是以体积百分比45-55％的甲醇水溶液直接提取异迷迭香酸苷。7.根据权利要求1所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱检测法的具体步骤如下：1)色谱条件：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-甲醇-0.2％(v/v)乙酸水溶液为流动相，检测波长为319nm；理论板数按异迷迭香酸苷峰计算应不低于8000；2)对照品溶液的制备：精密称定异迷迭香酸苷对照品，用甲醇水溶液溶解并定容，得到异迷迭香酸苷对照品溶液；3)供试品溶液的制备：取夏枯草籽粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇水溶液，精密称重，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取过滤液，即得；4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱议，测定，即得。8.根据权利要求7所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述的流动相为乙腈、甲醇和0.2％(v/v)乙酸水溶液按体积比14-16:11-13:72-74配比得到；步骤1)中所述的色谱中的色谱柱为ultimate xb-c18色谱柱；步骤1)中所述的色谱中的柱温为24-27℃；步骤1)中所述的流动相的流速为0.8-1.2ml/min；步骤2)中所述的甲醇水溶液是浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；步骤2)中所述的异迷迭香酸苷对照品溶液的浓度为每lml含0.05-0.06mg异迷迭香酸苷；步骤3)中所述的夏枯草粉末通过如下步骤得到：将夏枯草籽粉碎破壁，过至少40目筛，得到夏枯草粉末；步骤3)中所述的甲醇水溶液是浓度为体积百分比45-55％的甲醇水溶液；步骤3)中所述的甲醇水溶液的用量按每0.5-1.5g夏枯草籽粉末配比50-150ml甲醇水溶液计算；步骤3)中所述的超声的条件为功率500-700w、频率30-50khz处理40-80分钟。9.根据权利要求8所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述的流动相为乙腈、甲醇和0.2％(v/v)乙酸水溶液按体积比15:12:73配比得到；步骤1)中所述的色谱中的柱温为25℃；步骤1)中所述的流动相的流速为1ml/min；步骤2)中所述的甲醇水溶液是浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液；步骤3)中所述的甲醇水溶液是浓度为体积百分比50％的甲醇水溶液；步骤3)中所述的超声的条件为于功率600w、频率40khz处理30-60分钟。10.权利要求1～9任一项所述的夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法在夏枯草籽及其
制品开发中的应用。

技术总结
本发明公开了一种夏枯草籽中异迷迭香酸苷的检测方法及其应用。该检测方法包括利用薄层色谱法对夏枯草籽中异迷迭香酸苷进行定性鉴别；利用特定的极性溶剂提取法直接提取异迷迭香酸苷并与脂溶性成分分离，再以异迷迭香酸苷对照品对照，用高效液相色谱法对夏枯草籽中的异迷迭香酸苷进行含量测定。该检测方法具有准确度和精密度高、稳定性和重复性好等优点，提供了夏枯草籽开发利用中异迷迭香酸苷成分质量检测的方法，具有较强的专属性和良好的重现性。现性。现性。


技术研发人员：陈斌 李颖 袁程 曾宇城 陈火林 陈娇 程昌奎
受保护的技术使用者：江西鑫康健科技发展有限公司
技术研发日：2022.09.26
技术公布日：2023/9/11