MNR-MBP蛋白质的发酵和纯化工艺的制作方法

mnr-mbp蛋白质的发酵和纯化工艺
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及mnr-mbp蛋白质的发酵和纯化工艺。


背景技术：

2.肿瘤细胞疫苗有可能激活免疫系统，让它们直面癌症细胞。肿瘤疫苗诱导肿瘤特异的免疫反应，激活免疫系统进攻带有特殊抗原的癌细胞。在众多免疫抗原中，粘蛋白muc1被赋予希望。最初发现muc1具有保护和润滑上皮的功能。后来陆续发现它在细胞信号传导以及从恶性细胞转化到肿瘤扩散的肿瘤发生的所有阶段均起着重要作用。muc1是一种高度糖基化的跨膜蛋白，是一种i型跨膜蛋白，具有高度糖基化的胞外结构域，从细胞表面延伸200-500纳米。全长分为胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区由脯氨酸，苏氨酸和富含丝氨酸的(pts)域和sea域组成。pts域，也叫可变数目串联重复序列(vntr)区，由高度多态的外显子编码，该外显子编码多个20-21个氨基酸序列重复序列组成，而muc1的胞内区(ct)是高度保守的。muc1的过表达通常与结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和胰腺癌有关。muc1被证明存在于各种腺癌中。在一项原发性肝癌的病人治疗研究中，muc1高表达的病人比例高达68％。同时手术后复发的比例也是最高，跟muc1表达强度呈正相关。另外，muc1在一些血液恶性肿瘤的也是过度表达。肿瘤组织和正常组织的muc1不仅在表达量上有差异，肿瘤与正常组织的muc1糖基化也存在差异。低糖基化的muc1是在肿瘤细胞的整个表面过度表达，使肿瘤细胞粘附力的降低，为肿瘤转移提供了便利。已经形成的肿瘤中，大量muc1可以抑制nk细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，还可以抑制细胞毒淋巴细胞(ctl)的增殖,甚至可以诱导ctl凋亡。
3.疫苗接种可以为宿主提供长期的保护作用，且几乎没有副作用，是治疗癌症的重要方法之一。理论上muc1应该是一个非常好的疫苗抗原，但在人体临床试验中的临床效果并不理想。疫苗产生的抗体大多不能与肿瘤细胞很好地结合，无法有效保护机体杀灭肿瘤。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，申请人研制的针对人体癌症细胞的注射免疫用muc1重组蛋白mnr-mbp，其中mbp是蛋白质表达促溶成分，有助于蛋白质的纯化，也有研究表明mbp可以诱导机体免疫系统的t淋巴细胞活化。在此基础上，本发明进一步提供其发酵和纯化工艺，对于提高使用重组融合蛋白的产品稳定性、降低单位剂量成本具有重要意义。
5.本发明第一方面提供一种表达融合蛋白菌株的构建方法，所述方法包括利用融合蛋白基因连接载体、转化、诱导表达和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。
6.根据本发明，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n。
7.优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n串联而成。
8.更进一步地，所述muc1-n的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述mbp的氨基酸序列如seq id no.3所示。优选地，所述muc1-n的基因核苷酸序列如seq id no.2所示，所述mbp的基因核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.更进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。根据本发明，所述载体优选pet载体。所述转化使用的感受态细胞，优选bl21(de3)。所述诱导表达使用iptg诱导。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如seq id no.6所示的基因。
10.本发明第二方面提供一种表达融合蛋白的菌株，所述菌株是通过上述构建方法获得的。更优选，通过测定所述菌株的蛋白表达量进行进一步筛选。
11.本发明第三方面提供一种融合蛋白的发酵方法，所述方法包括利用融合蛋白发酵、再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。
12.其中，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n。
13.优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n串联而成。
14.更优选地，所述muc1-n的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述mbp的氨基酸序列如seq id no.3所示。优选地，所述muc1-n的基因核苷酸序列如seq id no.2所示，所述mbp的基因核苷酸序列如seq id no.4所示。
15.更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。
16.根据本发明，优选利用本发明构建的表达融合蛋白的菌株。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如seq id no.6所示的质粒。所述发酵体系的配方优选5.0g/l酵母提取物、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/l k2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/lmgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖。更优选的，所述发酵体系的配方还含有10.0g/l胰蛋白胨和/或微量元素。
17.其中，所述微量元素为cuso450μmol/l，znso430μmol/l，mnso450μmol/l，feso430μmol/l。
18.根据本发明，优选本发明所述发酵温度37℃。所述发酵培养诱导前培养0-2h的搅拌转速为400rpm，2-3h为550rpm，3-11h为700rpm。空气关联溶氧，起始为1-2vvm，氧气在2vvm后和溶氧关联。葡萄糖低于2g/l开始补料，3-5h补料速率为35ml/l/h，5-7h补料速率为65ml/l/h，7-11h为35ml/l/h。
19.其中，所述补液为：250g/l酵母提取物，250g/l葡萄糖。所述发酵培养od
600nm
值达到50时开始加入iptg终浓度为0.5mm，37℃，诱导培养4h。
20.本发明第四方面提供一种融合蛋白的制备方法，所述方法包括发酵含有能表达所述融合蛋白的表达载体的微生物，其中，所述方法还包括利用分离的发酵液中的融合蛋白、将所分离的菌体进行发酵的步骤。
21.根据本发明，所述方法还包括利用本发明所述的发酵方法对本发明表达融合蛋白的菌株进行发酵的步骤。
22.本发明第五方面提供一种分离和/或纯化融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
23.(1)发酵本发明的表达融合蛋白的菌株；
24.(2)菌体破碎后澄清。
25.优选地，对步骤(2)菌体破碎后通过过滤澄清。优选用微米过滤澄清，更优选地，深层过滤后用0.2m2、0.2微米滤器过滤澄清。所述深层过滤为用3m、90sp深层膜包过滤，通量为90l/m2。
26.根据本发明，所述步骤(2)澄清后的澄清液用亲和层析柱进行纯化。优选地，所述
亲和层析柱为dextrin beads 6ff。
27.根据本发明，所述步骤(2)澄清后的澄清液进行亲和层析步骤，例如，先用结合缓冲液平衡亲和层析柱dextrin beads 6ff，上样超声破碎，再用结合缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液洗脱。其中，所述结合缓冲液为20mm tris-hcl，0.2m nacl，1mm edta，ph7.4，洗脱缓冲液为20mm tris-hcl，0.2m nacl，1mm edta，10mm麦芽糖，ph7.4。
28.根据本发明，所述方法还包括亲和层析步骤后的一级精纯步骤，例如，使用diamond mixa、bestarose q hp、capto mmc impres、poros xs或superdex s 75进行一级精纯。其中，diamond mixa的上样缓冲液为50mm tris-hcl(ph7.0)，洗脱缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl，(ph7.0)，0-100％梯度洗脱。bestarose q hp的上样缓冲液为50mm tris-hcl(ph 8.0)，洗脱缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl(ph 8.0)；capto mmc impres的结合缓冲液为20mm pb(ph 4.6-6.0)，洗脱缓冲液为20mm pb，1m nacl(ph 4.6-6.0)；poros xs的结合缓冲液为20mm柠檬酸-柠檬酸钠(ph 4.6)，洗脱缓冲液为20mm柠檬酸-柠檬酸钠，0.5m nacl(ph 4.6)；superdex75的缓冲液为20mm pb，150mm nacl(ph 7.5)。
29.根据本发明，所述方法还包括一级精纯之后的二级精纯步骤，例如使用bestarose phenyl hp、poros xs或capto mmc impres二级精纯。优选地，使用bestarose q hp与poros xs组合精纯。
30.根据本发明，所述步骤(2)包括如下内容：
31.(2.1)菌体破碎后通过过滤澄清；任选地，
32.(2.2)所述澄清后的澄清液的亲和层析步骤，例如用亲和层析柱进行纯化；具体地，所述澄清后的澄清液先用结合缓冲液平衡亲和层析柱dextrin beads 6ff，上样超声破碎，再用结合缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液洗脱；任选地，
33.(2.3)一级精纯步骤；任选地，
34.(2.4)二级精纯步骤。
35.本发明第六方面提供一种融合蛋白制剂，其特征在于，所述制剂包括本发明制备的融合蛋白或本发明分离和/或纯化的融合蛋白。
36.根据本发明，所述制剂还包含佐剂，所述佐剂优选为氢氧化铝。优选，ph4.5-6.5。本发明的有益效果：
37.第一、本发明在优化重组mnr-mbp融合蛋白分子设计的基础上，进一步通过分子生物学的方法获得了高效表达该融合蛋白的菌株。
38.第二、本发明进一步利用该菌株对下游发酵和纯化工艺的改进来减少目的蛋白的降解、提高目的蛋白的稳定性。通过对表达该融合蛋白的菌株的发酵条件优化，确定优化发酵体系配方、发酵培养工艺。
39.第三、本发明在对mnr-mbp融合蛋白在结构、生物活性、理化形状等方面进行系统分析的基础上，结合上游的诱导发酵工艺、下游的分离纯化工艺，通过理化条件的协同，对于发酵液处理的操作条件、参数进行了多级优化选择，本发明提供的方法获得的重组融合蛋白既具有最好的聚集体及片段去除能力、又能保证较高的序列覆盖率和正确性，对于提高使用重组融合蛋白的产品稳定性以及降低单位剂量成本具有重要意义。
40.第四、本发明制备的融合蛋白形成的制剂，实验结果显示，ph4.5-6.5时，吸附率达到90％以上。
附图说明
41.图1.mnr-mbp表达工程菌株的pcr鉴定。
42.图2.sds-page检测菌株菌体目的蛋白质表达量(m：marker，250、130、100、70、55、35、25、15、10kd；p：诱导前；1-20：1-20号克隆)。
43.图3.sds-page检测细菌菌体和培养液中目的蛋白质表达量(m：marker，250、130、100、70、55、35、25、15、10kd；1：菌体沉淀；2：菌体上清)。
44.图4.sds-page检测细菌菌体和培养液中目的蛋白质表达量(m：marker，250、130、100、70、55、35、25、15、10kd；1-5：5号菌p1、p5、p10、p15、p20蛋白质表达；6-10：6号菌p1、p5、p10、p15、p20蛋白质表达；11-15：9号菌p1、p5、p10、p15、p20蛋白质表达；16-20：17号菌p1、p5、p10、p15、p20蛋白质表达；21-25：19号菌p1、p5、p10、p15、p20蛋白质表达)。
45.图5.sds-page检测9号菌株在不同发酵培养基中的表达(m：marker，250、130、100、70、55、35、25、15、10kd；1：生长7小时诱导前的f1；2：诱导4小时f1的菌泥；3-4：f1破碎上清；5：f1破碎沉淀；6：生长7小时诱导前的f2；7：诱导4小时f2的菌泥；8-9：f2破碎上清；10：f2破碎沉淀)。
46.图6.sds-page检测不同发酵程序发酵菌体纯化的蛋白质纯度(m：marker，250、130、100、70、55、35、25、15、10kd；1：f1诱导前；2：f1诱导4h；3：f1诱导6h；4：f2诱导前；5：f2诱导4h；6：f2诱导6h；7：f3诱导前；8：f3诱导4h；9：f3诱导6h；10：f1菌体超声上清；11：f1菌体超声上清穿柱液；12：f1洗脱蛋白；13：f2菌体超声上清；14：f2菌体超声上清穿柱液；15：f2洗脱蛋白；16：f3菌体超声上清；17：f3菌体超声上清穿柱液；18：f3洗脱蛋白)。
47.图7.sds-page检测不同发酵菌株发酵目标蛋白质占比(m：marker，250、130、100、70、55、35、25、15、10kd；1：9号诱导前；2：9号诱导4h后；3：19号诱导前；4：19号诱导4h后)。
48.图8.hplc分析mnr-mbp。
49.图9.质谱分析mnr-mbp。
50.图10.mnr-mbp肽图。
具体实施方式
51.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
52.下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。
53.实施例1.mnr-mbp菌株基因鉴定
54.从-70℃超低温冰柜中取出一管(50μl)感受态菌，置于冰浴备用。加入5μl连接好的质粒(所述质粒是通过发明人的mnr-mbp融合基因与pet载体连接、转化，提取质粒，测序获得。其中mnr-mbp融合基因构建及组成参见cn202111301004.x)混合液，质粒序列如seq id.no.6所示：
55.atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagcttgtcgacggagctcgaattcttagtgcgccggtggcgccgtac
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ctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaa
tcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca
56.轻轻混匀后放置冰上30min。轻轻摇匀后插入42℃水浴中60秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。在超净工作台中向上述各管中分别加入250μl soc培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，摇床，220rpm，37℃培养1小时。在超净工作台中取上述转化混合液50μl，滴到含50ug/ml kana的固体lb平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。待lb平板上液体在超净台中干燥后，倒置放入37度温箱中过夜静置培养。
57.12小时后挑取转化后平板中20株单菌落，分别接种10ml lb培养基(含50ug/ml kana)过夜培养用于菌株扩增。37℃，200rpm培养16h，菌体od值分别为3.42、3.43、3.65、3.74、3.78、3.68、3.74、3.66、3.78、3.75、3.77、3.64、3.77、3.72、3.90、3.69、3.93、3.36、3.92、3.93。菌株生长状况相似，其中5、9、15、17、19、20略高。同时对20株进行pcr鉴定，结果显示1-20号克隆均带有约2000bp的目的基因(图1)。
58.实施例2.mnr-mbp菌株摇瓶蛋白质表达鉴定
59.将20株候选克隆按1:10接种比例分别接种10ml的lb-kana(50ml离心管中)摇管，并经过终浓度为1mm的iptg、37℃、200rpm诱导表达，诱导起始od600nm为0.7，诱导时间为4.5小时。诱导结束后测定菌液od600nm值，见下表。
60.表1.mnr-mbp表达工程菌株的菌体表达产量的筛选
[0061][0062]
同时用sds-page检测目的蛋白质表达量，见上表和图2。2、4、5、6、7、8、9、10、13、17、19克隆的蛋白质表达较高，定为高产细胞株进行后续研究。
[0063]
经过sds-page分析，细菌上清液中无明显目的蛋白质表达，目的蛋白质主要表达于菌体中(图3)。后续纯化主要从菌体中纯化蛋白质，不考虑上清液。
[0064]
挑选杂蛋白较少的5、6、9、17、19克隆的p1、p5、p10、p15、p20代菌种，按照1：1000比例分别接种到5ml lb培养基中过夜，第二天按照1：10比例接种到10ml lb培养基(含50ug/ml kana)中，37℃，180rpm培养到od值到2。加入iptg终浓度为0.5mm，30℃，180rpm诱导培养
4h，取样做sds-page分析。p15表达较高的是9、19号，p20表达较高的是19号(图4)。而不加卡那霉素传代则不能表达目的蛋白。
[0065]
实施例3.mnr-mbp菌株质粒保有率测定
[0066]
将9、19号克隆p1、p10、p20复苏种子涂布于不含抗生素的lb培养基上，37℃培养过夜，分别挑取单菌落50个到含与不含卡那霉素的lb培养基，37℃培养过夜，计算工程菌传代时质粒保有率。质粒保有率＝含卡那霉素lb平板上菌落数/不含卡那霉素lb平板上菌落数
×
100％。
[0067]
表2.mnr-mbp菌株质粒保有率
[0068][0069]
结果显示19号克隆的质粒保有率略高(表2)。
[0070]
实施例4.mnr-mbp菌株发酵条件优化
[0071]
5l发酵体系配方优化，f1配方：5.0g/l酵母提取物、10.0g/l胰蛋白胨、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/l k2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖；f2配方：5.0g/l酵母提取物、10.0g/l胰蛋白胨、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/l k2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖，微量元素液(cuso450μmol/l,znso430μmol/l,mnso450μmol/l,feso430μmol/l)。
[0072]
按照1：1000比例接种37℃、200rpm培养14小时制备种子，再按照1：10比例接种到2l发酵培养基37℃培养，搅拌转数为400-700rpm，诱导前溶氧为30％，关联搅拌。ph为7.0,关联磷酸和氨水。od
600nm
值达到30时开始诱导。加入iptg终浓度为0.5mm，28℃，诱导培养4h，葡萄糖低于1.0g/l添加补料培养基(200g/l酵母提取物、200g/l葡萄糖)，速度为1-2％。诱导结束后取样，并经过超声破碎后做sds-page分析，结果表明：诱导产生的蛋白质位于破碎上清中，两种配方表达的蛋白质含量接近。2l发酵液的菌泥产量f1为152g，f2为164g，菌泥单位产量分别为69、75g/l。f2配方较优，但考虑到微量元素添加对菌泥增加量有限，而灭菌较为复杂，在后续实验中不建议使用。
[0073]
进一步优化5l发酵体系发酵温度，f1发酵程序：5.0g/l酵母提取物、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/l k2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖；od
600nm
值达到50时开始诱导。加入iptg终浓度为0.5mm，30℃，诱导培养5h，葡萄糖低于1.0g/l添加补料培养基；f2发酵程序：5.0g/l酵母提取物、10.0g/l胰蛋白胨、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/l k2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖；od
600nm
值达到50时开始诱导。加入iptg终浓度为0.5mm，37℃，诱导培养5h，葡萄糖低于
1.0g/l添加补料培养基；f3发酵程序：5.0g/l酵母提取物、10.0g/l胰蛋白胨、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/lk2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖；od
600nm
值达到50时开始诱导。加入iptg终浓度为0.5mm，30℃，诱导培养5h，葡萄糖低于1.0g/l添加补料培养基。发酵结束后，收集f1、f2、f3菌泥，按照1：10加入破碎缓冲液进行超声破碎，离心后收集上清上亲和柱(1g菌泥，超声上清10ml)。
[0074]
表3.mnr-mbp表达工程菌纯化出的蛋白质产量
[0075][0076]
结果显示f2发酵程序蛋白质表达在诱导后4-6小时稳定，捕获的蛋白质产量最高(表3)，即37℃培养温度较30℃可明显提高蛋白表达量；基础培养基中添加蛋白胨利于蛋白表达,但是蛋白质的纯度稍低，但考虑到微量元素添加对菌泥增加量有限，而灭菌较为复杂，在后续实验中不建议使用(图5)。提高诱导表达od(50vs 30)可增加菌泥生产总量进而提高蛋白表达量。确定发酵培养工艺诱导前培养0-2h的搅拌转速为400rpm，2-3h为550rpm，3-11h为700rpm。空气关联溶氧，起始为1-2vvm，氧气在2vvm后和溶氧关联。葡萄糖低于2g/l开始补料，3-5h补料速率为35ml/l/h，5-7h补料速率为65ml/l/h，7-11h为35ml/l/h。
[0077]
实施例5.mnr-mbp高产菌株筛选
[0078]
挑选9、19克隆的p1代菌种进行5l发酵对比实验，发酵配方为：5.0g/l酵母提取物、10.0g/l胰蛋白胨、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/l k2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖；补液为：250g/l酵母提取物，250g/l葡萄糖。发酵培养od
600nm
值达到50时开始加入iptg终浓度为0.5mm，37℃，诱导培养4h。进行sds-page和灰度计算目标蛋白质占比。结果显示19号菌株产率和目标蛋白质占比都较高(表4，图6)，确定为生产菌株。
[0079]
表4.mnr-mbp表达菌株发酵筛选
[0080][0081]
实施例6.mnr-mbp的初纯、一级中纯
[0082]
菌体破碎后采用方案1：离心+300k超滤(10000rpm离心20min，再用科佰特0.1平米膜超滤膜包)；方案2：离心+深层过滤(10000rpm离心20min，再用3m、90sp深层膜包过滤，通量为90l/m2)；方案3：深层过滤+0.2微米过滤(深层过滤后用0.2m2、0.2微米滤器过滤)。方案1、2、3最后澄清的样本浊度小于10、160和15ntu(nephelometric turbility unit)，最后采
用方案3进行破碎菌体的澄清。
[0083]
澄清液先用结合缓冲液(20mm tris-hcl，0.2m nacl，1mm edta，ph7.4)平衡天地人和公司亲和层析柱dextrin beads 6ff体积157ml，上样超声破碎来源于102g菌体的上清157ml，再用结合缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液(20mm tris-hcl，0.2m nacl，1mm edta，10mm麦芽糖，ph7.4)洗脱目的蛋白质，得到133mg蛋白质。再使用diamond mix a、bestarose q hp、capto mmc impres、poros xs、superdex s 75进行一级精纯。diamond mixa的上样缓冲液为50mm tris-hcl(ph7.0)，洗脱缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl，(ph7.0)，0-100％梯度洗脱。bestarose q hp的上样缓冲液为50mm tris-hcl(ph 8.0)，洗脱缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl(ph 8.0)；capto mmc impres的结合缓冲液为20mm pb(ph 4.6/5.2/6.0)，洗脱缓冲液为20mm pb，1m nacl(ph4.6/5.2/6.0)；poros xs的结合缓冲液为20mm柠檬酸-柠檬酸钠(ph 4.6)，洗脱缓冲液为20mm柠檬酸-柠檬酸钠，0.5m nacl(ph 4.6)；superdex75的缓冲液为20mm pb，150mm nacl(ph 7.5)。结果显示diamond mix a、bestarose q hp、poros xs、capto mmc impres、superdex s 75都具有一定的纯化效果(表5)。
[0084]
表5.mnr-mbp蛋白质的一级精纯工艺效果比较
[0085][0086]
实施例7.mnr-mbp的二级精纯
[0087]
diamond mix a+bestarose phenyl hp精纯组合，sec纯度难以达到95％以上；bestarose q hp+bestarose phenyl hp精纯组合，bestarose phenyl hp提纯效果较差；bestarose q hp+capto mmc impres精纯组合有一定的聚集体及片段去除能力；bestarose q hp+poros xs精纯组合有最好的聚集体及片段去除能力(表6)
[0088]
表6.mnr-mbp蛋白质的二级精纯工艺效果比较
[0089][0090]
实施例8.mnr-mbp蛋白质确证
[0091]
bestarose q hp+poros xs二级精纯的的蛋白质经过hplc分析，在11.47分钟洗脱
出紫外峰，峰面积占比为96％(图7)，经过质谱分析确定其分子量为55792(图8)，和理论预测值60kd接近。
[0092]
肽图分析发现97％的序列可以被覆盖，总离子流色谱图(total ions chromatograph)显示正确，69.61处显示的是漏切肽段(图9)。
[0093]
实施例9.mnr-mbp的制剂应用
[0094]
氢氧化铝佐剂对mnr-mbp吸附率的测定时先将蛋白质和氢氧化铝佐剂混合，10分钟后13800
×
g离心5min，取上清测定蛋白质浓度，计算吸附率。结果显示吸附率较好，ph4.5-6.5时，吸附率达到90％以上(表7)。
[0095]
表7.mnr-mbp蛋白质的佐剂吸附性能
[0096][0097]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

技术特征：
1.一种表达融合蛋白菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括利用融合蛋白基因连接载体、转化、诱导表达和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n。优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n串联而成。更优选地，所述muc1-n的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述mbp的氨基酸序列如seq id no.3所示。优选地，所述muc1-n的基因核苷酸序列如seq id no.2所示，所述mbp的基因核苷酸序列如seq id no.4所示。更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。2.根据权利要求1的构建方法，其特征在于，所述载体优选pet载体。所述转化使用的感受态细胞优选bl21(de3)。所述诱导表达使用iptg诱导。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如seq id no.6所示的基因。3.一种表达融合蛋白的菌株，其特征在于，所述菌株是通过权利要求1或2的构建方法获得的。更优选，通过测定所述菌株的蛋白表达量进行进一步筛选。4.一种融合蛋白的发酵方法，其特征在于，所述方法包括利用融合蛋白、发酵、再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。其中，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n。优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白mbp和粘蛋白muc1-n串联而成。更优选地，所述muc1-n的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述mbp的氨基酸序列如seq id no.3所示。优选地，所述muc1-n的基因核苷酸序列如seq id no.2所示，所述mbp的基因核苷酸序列如seq id no.4所示。更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。5.根据权利要求4的发酵方法，其特征在于，利用权利要求1或2的构建方法构建的表达融合蛋白的菌株。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如seq id no.6所示的质粒。其中，所述发酵体系的配方优选5.0g/l酵母提取物、5.0g/l nacl、3.5g/l kh2po4、6.6g/lk2hpo4.3h2o、3.5g/l(nh4)2hpo4、1.0g/l mgso4.7h2o、1ml消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/l vb1、10.0g/l葡萄糖。更优选的，所述发酵体系的配方还含有10.0g/l胰蛋白胨和/或微量元素。其中，所述微量元素为cuso450μmol/l，znso430μmol/l，mnso450μmol/l，feso430μmol/l。优选地，所述发酵温度37℃。所述发酵培养诱导前培养0-2h的搅拌转速为400rpm，2-3h为550rpm，3-11h为700rpm。空气关联溶氧，起始为1-2vvm，氧气在2vvm后和溶氧关联。葡萄糖低于2g/l开始补料，3-5h补料速率为35ml/l/h，5-7h补料速率为65ml/l/h，7-11h为35ml/l/h。其中，所述补液为：250g/l酵母提取物，250g/l葡萄糖。所述发酵培养od
600nm
值达到50时开始加入iptg终浓度为0.5mm，37℃，诱导培养4h。6.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括发酵含有能表达所述融合蛋白的表达载体的微生物，其中，所述方法还包括利用分离的发酵液中的融合蛋白、将所分离的菌体进行发酵的步骤。优选地，所述方法还包括利用权利要求4或5所述的发酵方法对权利要求3所述的表达融合蛋白的菌株进行发酵的步骤。7.一种分离和/或纯化融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)发酵权利要求3所述的表达融合蛋白的菌株；(2)菌体破碎后澄清。优选地，步骤(2)菌体破碎后，通过过滤澄清，优选地，用微米过滤澄清，更优选地，深层过滤后用0.2m2、0.2微米滤器过滤澄清。所述深层过滤为用3m、90sp深层膜包过滤，通量为90l/m2。8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(2)获得的澄清液用亲和层析柱进行纯化。优选地，所述亲和层析柱为dextrin beads 6ff。优选地，所述澄清液先用结合缓冲液平衡亲和层析柱dextrin beads 6ff，上样超声破碎，再用结合缓冲液洗涤，最后用洗脱缓冲液。其中，所述结合缓冲液为20mm tris-hcl，0.2m nacl，1mm edta，ph7.4，洗脱缓冲液为20mm tris-hcl，0.2m nacl，1mm edta，10mm麦芽糖，ph7.4。优选地，所述方法还包括亲和层析步骤后的一级精纯步骤。优选使用diamond mix a、bestarose q hp、capto mmc impres、poros xs、superdex s 75进行一级精纯。其中，diamond mix a的上样缓冲液为50mm tris-hcl(ph7.0)，洗脱缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl，(ph7.0)，0-100％梯度洗脱。bestarose q hp的上样缓冲液为50mm tris-hcl(ph 8.0)，洗脱缓冲液为50mm tris-hcl，0.5m nacl(ph 8.0)；capto mmc impres的结合缓冲液为20mm pb(ph 4.6-6.0)，洗脱缓冲液为20mm pb，1m nacl(ph 4.6-6.0)；poros xs的结合缓冲液为20mm柠檬酸-柠檬酸钠(ph 4.6)，洗脱缓冲液为20mm柠檬酸-柠檬酸钠，0.5m nacl(ph 4.6)；superdex75的缓冲液为20mm pb，150mm nacl(ph 7.5)。9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述方法还包括一级精纯之后的二级精纯步骤。优选地，使用bestarose phenyl hp、poros xs或capto mmc impres二级精纯。更优选地，使用bestarose q hp与poros xs组合精纯。10.一种融合蛋白制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求6制备的融合蛋白或权利要求7-9中任一方法分离和/或纯化的融合蛋白。优选地，所述制剂还包含佐剂。其中，所述佐剂优选为氢氧化铝。优选地，ph4.5-6.5。

技术总结
本发明公开了表达MNR-MBP蛋白质的菌株构建和融合蛋白发酵和纯化工艺。本发明提供的方法和菌株既能够减少重组融合蛋白的降解、又不会对重组融合蛋白的生物活性产生显著不良影响，对于提高使用重组融合蛋白的产品稳定性、降低单位剂量成本具有重要意义。降低单位剂量成本具有重要意义。降低单位剂量成本具有重要意义。


技术研发人员：蔡炯 刘毅 付玉洁 牟晨 陈钰 祁丽丽 丁国中 肖凯 宋旭 刘明霞 杨雪 王关炼
受保护的技术使用者：元本（珠海横琴）生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.01
技术公布日：2023/9/11