载药空化剂

1.本发明涉及含有一种或多种治疗剂或诊断剂的超声响应多肽颗粒。所述颗粒有助于将药物或诊断剂输送到体内的靶位点。它们本身在治疗或预防疾病方面也很有用。


背景技术：

2.一段时间以来，超声响应颗粒一直被用于辅助向体内递送治疗剂或诊断剂。例如，药物可以与充当空化核的微泡共同施用。超声对微泡的作用导致由空化效应引起的短时微流爆发。这可以增加药物在靶位点的递送。超声的施用还可以改善生理屏障，例如脉管系统壁的渗透性，从而增加药物输送。
3.然而，微泡仅提供非常短的作用持续时间，空化持续不超过约30秒。它们也不适合透皮施用。此外，气泡本身太大而无法离开脉管系统，这限制了它们输送到血管外空间的有效性。
4.纳米颗粒空化剂也被描述(wo 2015/075442)，其具有作用持续时间较长且足够小以进入血管外空间的优点。所述颗粒通过种子聚合形成杯形塑料颗粒，能够在杯的空腔中容纳气泡。已经发现这些颗粒例如暴露在超声下30秒时扩散到整个肿瘤肿块。然而，所描述的颗粒是塑料的，是不可生物降解的。
5.因此，需要新的超声响应颗粒和/或用于将药物和诊断剂超声响应递送至靶位点的新方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

6.本发明人已经发现，可生物降解的超声响应颗粒可以由多肽(例如蛋白质)制成。这种颗粒响应于超声而产生惯性空化，可以制成亚微米尺寸。所述颗粒具有良好的作用持续时间，已经发现在超声暴露后产生空化大约10分钟的时间段。如果需要，它们可以被制造成足够小以穿过血管壁的尺寸。因此，颗粒本身，以及它们所含的任何治疗剂或诊断剂，都可以有效地递送到脉管系统之外的靶位点(例如肿瘤)。所述颗粒也高度稳定。因此，这些颗粒提供了在治疗或诊断环境中产生惯性空化的有效手段，从而以高度选择性的方式将其有效载荷的治疗剂或诊断剂递送至靶位点。
7.因此，本发明提供第一方面(1)：
8.1.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，其中所述颗粒包含：
[0009]-核，其包含一种或多种治疗剂或诊断剂，以及任选的水不混溶液体；和
[0010]-多肽壳；
[0011]
其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。
[0012]
本发明的颗粒的特别优点是它们可以有效地透皮施用。将本发明的颗粒施用于皮肤，然后施用超声，产生惯性空化效应，足以透皮递送颗粒以及任何所含的治疗剂或诊断剂。因此，所述颗粒可作为透皮递送药物的手段，特别是在治疗皮肤病和病症方面。
[0013]
本发明还提供以下方面：
[0014]
2.根据方面1所述的多肽颗粒，其中所述多肽壳包含交联的多肽颗粒。
[0015]
3.根据方面1或2所述的多肽颗粒，其中所述多肽壳包含一种或多种非免疫调节多肽，优选地，所述多肽壳包含至少95重量％的非免疫调节多肽。
[0016]
4.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中，所述多肽壳主要由一种或多种人血液蛋白组成，优选地，其中所述多肽壳是人血清白蛋白壳。
[0017]
5.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中所述颗粒的粒度为100nm至1000nm，优选200nm至700nm。
[0018]
6.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中至少一个表面凹痕的横截面形成圆锥截面。
[0019]
7.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中至少一个表面凹痕的深度为至少10nm和/或开口尺寸为至少50nm。
[0020]
8.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中所述颗粒包含一或两个凹痕，其开口尺寸为粒度的20％或更大。
[0021]
9.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中所述多肽壳与选自肽、蛋白质、糖、纳米颗粒和核酸的一种或多种配体偶联。
[0022]
10.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中，当所述颗粒悬浮于水中并受到1.2mpa和265khz的超声时能够产生惯性空化，优选地，当所述颗粒悬浮于水中并受到1mpa和500khz的超声时能够产生惯性空化，更优选地，颗粒尺寸为450nm或更小，并且所述颗粒悬浮于水中并受到1.5mpa和500khz的超声时能够产生惯性空化。
[0023]
11.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中所述核包含一种或多种治疗剂，所述治疗剂选自小分子药物，包括化疗剂、抗血栓药物、抗炎药物、类固醇、心血管药物和用于治疗癌症、皮肤疾病、脑部疾病或病症的治疗剂，以及用于疼痛管理的治疗剂。
[0024]
12.根据前述方面中任一项所述的多肽颗粒，其中所述核是水不混溶液体核，其包含水不混溶液体和一种或多种治疗剂或诊断剂。
[0025]
13.组合物，其包含一种或多种如前述方面中任一项所述的多肽颗粒以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
[0026]
14.制备如方面1至12中任一项所述的多肽颗粒的方法，包括：
[0027]-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、一种或多种治疗剂或诊断剂、以及任选的一种或多种非挥发性组分；
[0028]-将所述水不混溶相与至少一种包含至少两个半胱氨酸残基的多肽的水溶液混合；
[0029]-交联半胱氨酸残基以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；以及
[0030]-通过使所述颗粒处于减压条件下在颗粒中从核中去除挥发性组分，从而产生一个或多个凹痕。
[0031]
15.根据方面14所述的方法，其中水不混溶相中挥发性组分与非挥发性组分的比例为1:20至20:1。
[0032]
16.根据方面14或15所述的方法，其进一步包括：
[0033]-干燥所述颗粒；和
[0034]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中。
[0035]
17.根据方面14至16中任一项所述的方法，其进一步包括：
[0036]-冻干所述颗粒；和
[0037]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中；
[0038]
其中优选地，在干燥颗粒并将颗粒重新悬浮在液体介质中之后进行冻干和任选的重新悬浮。
[0039]
18.根据方面14至17中任一项所述的方法，其进一步包括纯化颗粒的步骤。
[0040]
19.根据方面1至12中任一项所述的多肽颗粒，或根据权利要求12所述的组合物，用于诊断或治疗方法。
[0041]
20.根据方面19所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述方法包括施用所述多肽颗粒或组合物、施加超声和诱导惯性空化。
[0042]
21.根据方面19或20所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中超声以100至3000khz的频率和0.5至7.0mpa的峰值负压递送；优选地，其中(a)透皮施用多肽颗粒或组合物并且以100至500khz的频率和0.5mpa至2.0mpa的峰值负压递送超声；或者(b)通过肠胃外施用多肽颗粒或组合物并以200至3000khz的频率和1.0mpa至7.0mpa的峰值负压递送超声。
[0043]
22.根据方面19至21中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述方法用于将治疗剂或诊断剂递送至体内靶位点，优选地其中所述多肽颗粒或组合物用于将治疗剂或诊断剂递送到肿瘤、心脏、大脑或皮肤。
[0044]
23.根据方面19至22中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述多肽颗粒或组合物通过肠胃外施用，优选地，其中所述多肽颗粒或组合物通过静脉注射、肌肉注射、皮内或皮下给药施用。
[0045]
24.根据方面19至22中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述多肽颗粒或组合物通过透皮给药施用。
[0046]
25.根据方面19至24中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，用于治疗或预防肿瘤、心血管疾病、感染或神经疾病或病症。
[0047]
26.根据方面19至24中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，用于治疗或预防皮肤疾病或病症。
[0048]
27.根据方面1至12中任一项的多肽颗粒或方面13所述的组合物在制备用于诊断或治疗方法的药物中的用途，特别是其中所述方法如方面20至24中任一项所述。
[0049]
28.根据方面27所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防肿瘤、心血管疾病、感染或神经系统疾病或病症。
[0050]
29.根据方面27所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防皮肤疾病或病症。
[0051]
30.治疗或诊断受试者的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的如方面1至12中的任一项所述的多肽颗粒或如方面13所述的组合物，特别是其中的方法如方面19至24中任一项所述。
[0052]
31.治疗、改善、预防或减少受试者中肿瘤、心血管疾病、感染或神经系统疾病或病症的发生率的方法，向受试者施用有效量的如方面1至12中的任一项所述的多肽颗粒或如方面13所述的组合物，特别是其中的方法如方面20至24中任一项所述。
[0053]
32.治疗或预防受试者皮肤疾病或病症的方法，向受试者施用有效量的如方面1至
12中的任一项所述的多肽颗粒或如方面13所述的组合物，特别是其中的方法如方面20至24中任一项所述。
[0054]
附图简要说明
[0055]
图1是根据本发明的具有单个凹痕的颗粒的示意图。s代表粒度，d代表凹痕深度。p表示凹痕开口的尺寸，也称为开口直径。
[0056]
图2提供了用于制备本发明的超声响应颗粒的方法以及用于制备基本上球形的颗粒的方法的示例性示意图。
[0057]
图3a和3b显示了通过转盘共聚焦显微镜使用预先偶联有alexafluor 488nhs(图3a)和cy5nhs(图3b)的颗粒生成的z堆栈的3d重建；图3c显示了根据本发明的颗粒的扫描电子显微镜(sem)图像；图3d显示了根据本发明的颗粒的光学显微镜图像。图3e显示了具有特拉唑嗪(terazonsin)核(上图)的本发明颗粒和特拉唑嗪参照(下图)的溶出的uplc分析。
[0058]
图4显示了通过改变核内部挥发性组分的性质而产生的颗粒的平均直径(z-平均值(平均粒径))。
[0059]
图5显示了通过改变核内部挥发性组分的相对量而产生的颗粒的平均直径(z-平均值(平均粒径))。
[0060]
图6显示了四种压力设置下粒度对空化能力的影响。
[0061]
图7显示了在四种压力设置下核内挥发性组分百分比对空化能力的影响。
[0062]
图8显示了根据本发明产生的颗粒的持续惯性空化的代表性能量轨迹。
[0063]
图8a显示了在本发明颗粒和荧光素酶pdna的体内透皮递送过程中，pcd在1.7mpa下随时间检测到的能量。
[0064]
图9提供了体内空化实验中使用的超声硬件示意图。
[0065]
图10显示了第7天elisa比较了在透皮和通过一系列注射递送由bsa制成的颗粒对bsa蛋白的免疫应答。
[0066]
图11显示了编码荧光素酶的dna给药后，通过ivis成像确定的生物发光测量，根据本发明，这可能是通过使用空化剂的透皮给药，使用替代空化剂，或使用替代给药途径。
[0067]
图12显示了超声方案2中使用的透皮递送设置的概述。
[0068]
图13显示了在处理后约22小时，在各种us压力(0.4mpa、1.5mpa、1.7mpa和2.0mpa)下，编码荧光素酶的dna与空化剂一起透皮递送后，通过ivis成像进行的生物发光测量。
[0069]
图14至17显示了在通过与空化剂一起透皮递送或皮内递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光。图14显示了各种us压力(0.4mpa、1.5mpa、1.7mpa和2.0mpa)的结果。图15显示了不同us处理时间后观察到的发光。图16显示了不同处理时间的总声学传感器能量(tase)。
[0070]
图17显示了不同蛋白质颗粒剂量下观察到的发光。
[0071]
图18a显示了在通过与空化剂一起透皮施用或通过皮内给药递送编码荧光素酶的dna之后观察到的发光。图18b和18c分别显示了透皮组和皮内组在处理后约24小时通过ivis成像进行的生物发光测量。
[0072]
图19显示了在递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光，其可以通过与空化剂一起在各种压力下透皮施用，或通过皮内施用。
[0073]
图20显示了通过透皮施用递送bsa空化剂后2分钟或24小时在皮肤中检测到的
bsa。
[0074]
图21显示了由一系列免疫调节蛋白和非免疫调节蛋白合成的凹痕颗粒，并通过pcd在1.4mpa下检测空化。实线为探测到的空化信号能量，虚线为水中典型背景信号。
具体实施方式
[0075]
定义
[0076]
如本文所用，超声响应颗粒是当暴露于超声时产生响应，通常是空化响应的颗粒。适合于在暴露于超声时诱导(即能够诱导或适合于诱导)空化的颗粒是本文所述的超声响应颗粒。
[0077]
当流体中的气泡，例如与本发明的颗粒相关的气泡，由于外部输入(通常是声压)而改变尺寸或形状时，会发生空化。通常，颗粒在暴露于超声时会产生惯性空化响应。惯性空化是当流体中的气泡，例如与本发明的颗粒相关的气泡，在暴露于声压后生长并随后破裂时发生的效应。气泡破裂可能会在周围流体中引起冲击波和/或微流，并伴有宽带(而不是音调)声发射。惯性空化可以通过单元件或多元件检测器检测，包括用于常见医疗诊断的传统手持式超声阵列。惯性空化可被评估为在排除任何音调成分后，宽带噪声的存在程度可从背景中清晰辨别(例如，至少是背景均方根噪声的3倍)。如果对水中的颗粒混悬剂施加超声(例如在1.2mpa和265khz下)时存在宽带噪声(例如如上所述测量)，则认为颗粒会产生惯性空化响应。颗粒悬浮在水中，在1mpa、500khz的超声作用下，会产生惯性空化响应(即宽带发射)。更理想的是，颗粒悬浮在水中，在1.5mpa、500khz的超声作用下，会产生惯性空化响应(即宽带发射)。通过检测被动空化(pcd)水平，例如如图6所示，对于具有一定尺寸范围的颗粒展示惯性空化。
[0078]
本文定义的粒度是穿过颗粒的最大距离，即球形颗粒情况下的直径。尽管本文定义的颗粒形状不一定是球形，但是粒度在本文中可以称为颗粒直径，并且这两个术语具有相同的含义。
[0079]
对于根据本发明的包含多个颗粒的组合物，粒度被定义为平均粒度。组合物内的平均粒度可以通过本领域技术人员已知的多种技术(malvern nanosight、beckman coulter粒度、动态光散射(dls))来测量。通常，平均粒度定义为通过动态光散射(dls)测量的流体动力学直径。单个纳米颗粒的粒度(图1中的s)可以通过扫描电子显微镜(sem)测量。
[0080]
如本文所用，凹痕是导致颗粒表面中出现空腔或凹陷的表面特征。凹痕在本文中也称为表面凹痕。通常，凹痕能够捕获或保留气泡。凹痕的深度如图1中的d所示，可以通过显微镜(例如，sem或透射显微镜、tem)确定。任何凹痕的深度通常为至少约10nm，优选至少约20nm，更优选至少约50nm。凹痕具有开口，在部分球形凹痕的情况下，开口是颗粒表面处的凹痕的直径。开口如图1中的p所示。开口的尺寸在本文中被称为开口尺寸或开口直径，尽管开口的形状可以是圆形也可以不是圆形。
[0081]
具有一个或多个表面凹痕的多肽颗粒通常是指其中在多肽壳中形成表面凹痕的颗粒。
[0082]
壳厚度是多肽壳的平均厚度并且可以通过sem或tem测定。
[0083]
如本文所用，术语“多肽”是指全长蛋白质、蛋白质的一部分、以一串氨基酸为特征的肽。通常，多肽至少包含25、或30、或35、或40、或45、或50、或55或60个氨基酸。例如，多肽
可以包含100个或更多个氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”是指全长蛋白质或蛋白质片段。
[0084]
本文所用，术语“片段”、“蛋白质片段”或“多肽片段”是指一串氨基酸或氨基酸序列，其长度通常相对于参考蛋白或多肽缩短，并且在共同部分上包含与参考蛋白质或多肽相同的氨基酸序列。在一些情况下，本文提及的片段可以是8或9至20、或25、或30、或35、或40、或45、或50个氨基酸。
[0085]
多肽壳是指由多肽形成的壳。通常，壳是基本上由一种或多种多肽组成的多肽壳。基本上由一种或多种多肽组成的多肽壳包含至少90重量％、至少95重量％、优选至少98重量％、例如至少99重量％、至少99.5重量％或至少99.9重量％的多肽。通常，壳包含交联的多肽颗粒。交联多肽颗粒能够形成稳定的壳结构。因此，颗粒不需要任何单独的基质来涂覆多肽，并且多肽本身形成颗粒的基础。这可以具有改善的生物降解性的优点。
[0086]
本文提及包含特定类型多肽的多肽壳意味着所述多肽在壳结构内交联。例如，包含非免疫调节蛋白如人血蛋白的多肽颗粒包含在多肽壳内交联的所述蛋白质，即与壳中的多肽颗粒交联(壳中的多肽颗粒可以是其它非免疫调节蛋白质如壳中的人血蛋白，或与壳内其它类型的多肽颗粒交联)。类似地，包含血清白蛋白、胰岛素、球蛋白和/或血红蛋白的多肽颗粒包括多肽壳，其中血清白蛋白、胰岛素、球蛋白和/或血红蛋白是交联的，即与壳中的其他多肽颗粒交联。
[0087]
本文所用的术语“挥发性”是指物质在25℃时的蒸气压高于相同温度下水的蒸气压(水的蒸气压约为3kpa)。通常，挥发性物质或挥发性组分能够在室温(25℃)下蒸发。因此，本文所用的挥发性组分是液体，通常是有机溶剂，其在25℃下的蒸气压为至少3kpa，优选至少3.5kpa，例如至少5kpa、至少10kpa或至少15kpa。
[0088]
非挥发性表示物质在室温(25℃)下不蒸发或基本上不蒸发。因此，非挥发性组分通常是液体，例如油，其蒸汽压在25℃时不超过相同温度下的水(蒸汽压约为3kpa)。本文所用的非挥发性组分在25℃下的蒸气压通常小于3kpa，优选小于2.5kpa，例如小于2kpa。
[0089]
如本文所述，所述颗粒可用于治疗或诊断受试者的方法。受试者是人类或动物受试者。一方面，待治疗的受试者是哺乳动物，特别是人类。然而，它可能是非人类。优选的非人类动物包含但不限于灵长类动物，例如狨猴或猴子，商业养殖的动物，例如马、牛、羊或猪，以及宠物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂、沙鼠或仓鼠。
[0090]
本文使用的术语“治疗”包括治疗性治疗和预防性治疗。通常以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防可以被认为是治疗)施用，这足以产生临床反应或对个体显示出临床益处，例如预防或延迟疾病或病症发作、改善一种或多种症状、诱导或延长缓解、或延迟复发或复发的有效量。
[0091]
免疫调节多肽(或免疫调节蛋白)是在施用于受试者时诱导免疫应答的多肽(或蛋白)。通常，受试者是人，蛋白质在给药时诱导免疫应答。通常，给予免疫调节多肽(或免疫调节蛋白)会引起受试者产生针对该多肽(或蛋白)的抗体，尽管也可能产生替代免疫应答以及或代替产生抗体。
[0092]
非免疫调节多肽(或非免疫调节蛋白)是在施用时不引起免疫应答的多肽(或蛋白)。通常，这种多肽或蛋白质是在受试者体内天然存在的多肽或蛋白质。在人类受试者中，非免疫调节蛋白的实例是人血清白蛋白。更普遍地，人血液蛋白是非免疫调节蛋白的实例，
包含胰岛素、球蛋白和血红蛋白。
[0093]
超声响应多肽颗粒
[0094]
本发明的多肽颗粒是超声响应颗粒。当在存在流体的情况下暴露于超声时，超声响应颗粒能够产生空化响应。通常它们会产生惯性空化。因此，当本发明的颗粒存在于流体中，例如配制成凝胶或洗剂，或存在于体内时，暴露于超声将导致该流体内的惯性空化。
[0095]
所述颗粒具有一个或多个凹痕(即表面凹陷或空腔)，这提供了它们的超声响应特性。不限制本发明，目前理解颗粒表面中的凹痕或空腔能够捕获或保留气泡。暴露在超声下时，气泡长大然后破裂，引起惯性空化效应。因此，颗粒具有一个或多个能够在暴露于超声时引起惯性空化的凹痕。一方面，本发明提供了本文所述的颗粒，其包含捕获在颗粒上的凹痕处的气泡。例如，气泡可以包含空气或氧气。
[0096]
通常，当悬浮在水中并在1.2mpa和265khz超声作用下，颗粒能够引起惯性空化。如上所述，颗粒引起惯性空化的能力可以通过发射信号中宽带噪声的存在来评估。优选地，当颗粒悬浮在水中并在1mpa和500khz的超声作用下时，颗粒能够产生惯性空化。更优选地，颗粒的尺寸为450nm或更小，并且当颗粒悬浮在水中并经受1.5mpa和500khz的超声时能够产生惯性空化。
[0097]
本文所述的颗粒的平均尺寸通常为8000nm或更小，例如5000nm或更小，优选平均尺寸1000nm或更小的纳米颗粒。优选地，颗粒的尺寸为100nm至5000nm，优选100nm至1000nm。例如，颗粒的尺寸为至少200nm，优选200nm至700nm，例如约500nm。一方面，颗粒的尺寸为450nm或更小。优选地，包括本发明的一种或多种颗粒的组合物的平均粒度为100nm至8000nm，例如100nm至5000nm，优选100nm至1000nm，更优选200nm至700nm，例如约500nm。一方面，组合物包含平均粒度为450nm或更小的颗粒。例如，可以通过粒度过滤来控制粒度。
[0098]
一方面，粒度可为100nm至600nm，优选为100nm至500nm，例如300nm至500nm，例如100nm至450nm或300nm至450nm。这种大小的颗粒足够小，可以穿过血管壁，因此可以积聚在血流外所需的位点。在组合物的情况下，平均粒度可以为1000nm或更小，特别是100nm至600nm，优选100nm至500nm，例如300nm至500nm，例如100nm至450nm或300nm至450nm。
[0099]
另一方面，所述颗粒的粒度大于500nm，优选大于600nm，例如从600nm至8000nm，例如600nm至5000nm或700nm至1000nm。就组合物而言，平均粒度可大于500nm，优选大于600nm，例如600nm至5000nm或700nm至1000nm。
[0100]
通常，颗粒包含单个凹痕或包含两个凹痕(在后一种情况下，它们通常近似环形形状，在颗粒的相对侧上包含两个凹痕)。还可以存在更小的颗粒特征，例如表面粗糙度，其中特征的开口尺寸为50nm或更小、优选20nm或更小、更优选10nm或更小。然而，通常，颗粒具有一或两个开口尺寸为50nm或更大的凹痕。
[0101]
凹痕的形式可以变化，只要凹痕颗粒能够引起惯性空化(例如，凹痕能够在其空腔内捕获或保持气泡)。通常，能够引起惯性空化的凹痕的开口尺寸为至少50nm或至少100nm。开口例如为10至500nm，例如50至300nm或100至300nm。在圆形开口的情况下，本文所指的凹痕的开口尺寸涉及颗粒表面处的开口的直径。在空腔在开口处具有非圆形横截面的情况下，开口尺寸是跨越颗粒表面处的开口的最大尺寸。
[0102]
凹痕开口的尺寸可以根据粒度而变化。例如，凹痕的开口的尺寸(直径)可以是粒度(直径)的至少10％，例如是粒度(直径)的至少20％，优选粒度(直径)的至少40％。颗粒中
凹痕或空腔的开口尺寸(直径)(其绝对尺寸或与粒度相比的相对尺寸)可以通过成像来确定，例如通过扫描电镜或原子力显微镜来确定。
[0103]
通常，能够引起惯性空化的凹痕的深度为至少10nm，例如至少50nm或至少100nm。例如，一个或多个凹痕的深度可能为10nm至250nm。一个或多个凹痕的深度可以是例如粒度的至少10％，例如粒度的至少20％或至少25％。颗粒中凹痕或空腔的深度其绝对尺寸或与粒度相比的相对尺寸)可以通过成像来确定，例如通过扫描电镜或原子力显微镜来确定。
[0104]
通常，至少一个凹痕的横截面形成圆锥截面。
[0105]
在一个实施方案中，颗粒具有包含水不混溶相的核，所述水不混溶相核包含非挥发性、水不混溶性组分中的一种或混合物(下文中称为“水不混溶性核”)。非挥发性组分(也称为水不混溶液体)的含量占颗粒的比例可能变化很大。例如，颗粒可包含0.1重量％至70重量％的非挥发性组分和30重量％至99.9重量％的多肽壳。非挥发性组分的性质不受特别限制并且可以使用任何生物相容性的、药学上可接受的油或其混合物。合适的组分包括葵花籽油、橄榄油、大豆油、椰子油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、柠檬烯油、聚乙二醇、油酸、角鲨烯或其他非挥发性有机溶剂，以及这些油中的两种或两种以上的组合。在一个实施方案中，非挥发性组分是葵花籽油、橄榄油、大豆油、椰子油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、柠檬烯油、聚乙二醇或其他非挥发性有机溶剂，以及这些油中的两种或更多种的组合。优选葵花籽油、橄榄油或这些油的组合。生物相容性的、药学上可接受的油通常本身不具有药学活性。
[0106]
在一个实施方案中，颗粒的核不包括水不混溶液体，或者水不混溶液体仅以少量存在，例如以足以稳定或溶解任何治疗或诊断组分的量存在通常，在该实施方案中，与颗粒总重量相比，水不混溶液体的存在量不超过10重量％，例如不超过5重量％。在该实施方案中，颗粒的核心包括一种或多种治疗或诊断成分，其可以固体或液体形式存在于核中，或者它们可以溶解在少量的水不混溶液体中(例如，与颗粒的总重量相比，高达10重量％或高达5重量％的水不混溶液体)或与之混合。核中还可以提供一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
[0107]
已发现，不具有或具有少量水不混溶液体的该实施方案的颗粒，对超声特别敏感。因此，当暴露于超声时，它们有效地产生惯性空化。
[0108]
颗粒的核包含一种或多种治疗剂或诊断剂。存在于核中的治疗剂或诊断剂的性质不受特别限制，并且可以使用可有效地通过本发明的颗粒递送的任何试剂。当核是本文所述的水不混溶核时，通常，治疗剂或诊断剂可溶于构成水不混溶性核的非挥发性组分或与其混溶。因此，通常，治疗剂或诊断剂可溶于有机溶剂。某些难溶于有机溶剂的治疗剂或诊断剂可进行改造以提高其在有机介质中的溶解度。例如，寡核苷酸例如dna或rna可以通过本领域已知的技术进行修饰以使其可溶于有机介质中(例如，如abe等人在angewandte chemie international edition，第51卷，第26期，2012年第6475-6479页中所阐述的)。因此，本文提及的治疗剂或诊断剂包括此类衍生物。
[0109]
可以包含在本发明颗粒的核中的治疗剂的实例包括止痛剂、抗生素、抗血栓药物(例如t-pa)、抗抑郁药、抗癌药物例如化疗药物，包括其组合(例如5-氟尿嘧啶)、亚叶酸(fa)或其盐、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、吉西他滨、奥沙利铂、甲氨蝶呤、放线菌素d、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、多西他赛、雌莫司汀、紫杉醇、长春花碱、依托泊苷、伊立替康、替尼泊
苷、拓扑替康、泼尼松，甲基强的松龙、地塞米松以及两种或多种这些化疗药物的组合)、抗癫痫药、抗炎药、抗精神病药、抗病毒药、镇静剂、类固醇、心血管药物、疼痛管理药物、皮肤病治疗药物和脑部疾病治疗药物。在一个实施方案中，治疗剂是咪喹莫特。
[0110]
可以包含在核中的诊断剂的实例包括造影剂和放射性或示踪分子。有用的造影剂的具体实例是mri造影剂，例如基于gd的mri造影剂，或荧光检查造影剂。
[0111]
本发明的颗粒可以包含两种或两种以上不同的治疗剂或诊断剂的混合物。通常，每个颗粒含有一种治疗剂或诊断剂。
[0112]
在一个实施方案中，所述颗粒的核不包含佐剂。本文使用的术语“佐剂”是指用于增强免疫调节的物质。在本实施方案中通常不存在于核中的佐剂的实例包括可溶于油基溶剂的佐剂。因此，在一个实施例中，所述核不包含下列一个或多个：铝盐，例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是钙盐(例如氢氧化磷酸钙)、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性混悬剂，或可以是阳离子或阴离子衍生的糖、聚磷腈、可生物降解微球、单磷酰脂质a(mpl)、脂多糖、脂质a衍生物(例如毒性降低的)、3-o-脱酰基mpl[3d-mpl]、洗涤剂，例如quil a、皂素、qs21、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(difco laboratories，detroit，密歇根州)、默克佐剂65(merck and company,inc.，rahway，n.j.)、as-2(smith-kline beecham，费城,pa.)、cpg寡核苷酸、油，例如角鲨烯、矿物油，例如石蜡油、食品油，例如石蜡油佐剂65(源自花生油)、例如灭活的细菌，选自百日咳杆菌、牛分枝杆菌、类毒素、生物粘附剂和粘膜粘附剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁酰肽或咪唑喹诺酮化合物(例如咪夸莫特及其同系物)。适合用作佐剂的人免疫调节剂包含细胞因子，例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。在一个特定实施例中，所述核不包含咪唑喹诺酮类化合物，例如咪喹莫特。在一个实施例中，核不含咪喹莫特或角鲨烯或其混合物。
[0113]
所述颗粒具有多肽壳，通常围绕核的周围。例如，所述多肽壳可以围绕水不混溶核，或者所述多多肽壳可以围绕存在于所述核中的治疗或诊断组分。多肽的性质不受特别限制并且可以使用多种不同的多肽。
[0114]
通常，多肽壳包含具有两个或更多个半胱氨酸残基的多肽。这使得多肽能够形成二硫交联键以产生多肽壳。优选地，所述多肽包含至少4个半胱氨酸残基，例如至少10个半胱氨酸残基。更多数量的半胱氨酸残基，特别是在多肽表面可接近的半胱氨酸残基，在多肽壳中产生更大程度的交联，这反过来可以为结构提供更大的稳定性。半胱氨酸残基天然存在于许多蛋白质中。然而，半胱氨酸残基可以被引入多肽链，例如通过基因工程技术。
[0115]
多肽壳通常包含分子量至少5kd、优选至少10kd的多肽。具有不同分子量的多种多肽可用于形成多肽壳。因此，多肽的分子量通常为5至80kd，优选为10至50kd。
[0116]
通常，多肽壳包含蛋白质。本发明的颗粒通常保留形成它的一种或多种蛋白质的功能。因此，例如，包含血红蛋白的多肽具有携带氧气的能力，而包含胰岛素的多肽保留改变葡萄糖代谢的能力。这进一步意味着，空化过程完成后，整个颗粒可能会被代谢。
[0117]
多肽壳可能包含人血蛋白(包含其片段)。合适的蛋白质的实例包含白蛋白、胰岛素、球蛋白和血红蛋白。其中，优选白蛋白、胰岛素和球蛋白。在一个实施方案中，多肽壳包含血清白蛋白，优选人血清白蛋白。人血清白蛋白和其他血液蛋白是非免疫调节性的，即它
们在施用于人类时不会引起免疫应答。因此，它们有利于在不需要免疫调节响应的空化剂中使用。
[0118]
在一个实施方案中，多肽壳包含一种或多种非免疫调节多肽，通常为一种或多种非免疫调节蛋白，即在施用于人类时不引起免疫应答的一种或多种多肽或蛋白。优选地，在该实施方案中，多肽壳含有不超过5重量％的免疫调节蛋白，优选不超过1重量％，更优选地，多肽壳不包含免疫调节蛋白。在本实施例中，优选多肽壳主要由一个或多个非免疫调节多肽组成，优选由一个或多个非免疫调节多肽组成。主要由一种或多种非免疫调节多肽组成的多肽壳，包含至少95重量％，优选至少98重量％，例如至少99重量％，至少99.5重量％或至少99.9重量％的非免疫调节多肽或其片段。
[0119]
优选地，在该实施方案中，所述多肽壳包含人血液蛋白，特别是血清白蛋白、胰岛素、球蛋白和/或血红蛋白。该壳优选地包含至少95重量％、优选至少98重量％、例如至少99重量％、至少99.5重量％或至少99.9重量％的一种或多种人血蛋白，优选血清白蛋白、胰岛素、球蛋白和/或血红蛋白。通常，不超过痕量的其它蛋白质存在于壳中，使得壳基本上由一种或多种人类血液蛋白质组成，特别是由一种以上人类血液蛋白质组成，特别是它可以基本上由血清白蛋白、胰岛素、球蛋白和/或血红蛋白中的一种或几种组成，尤其是由血清白蛋白、胰岛素、球蛋白和/或血红蛋白中的一个或多种组成。
[0120]
优选地，在本实施例中，多肽壳包含人血清白蛋白。更优选地，所述多肽壳为人血清白蛋白壳。人血清白蛋白壳通常包括至少95重量％，优选至少98重量％，例如至少99重量％，至少99.5重量％或至少99.9重量％的人血清白蛋白，或其片段。通常，壳中存在的其他蛋白质不超过痕量，使得壳主要由人血清白蛋白组成，特别是由人血清白蛋白组成。
[0121]
在替代实施方案中，免疫调节多肽可以是例如免疫检查点调节剂、抗体、疫苗抗原、佐剂或抗炎多肽。可用于本发明的免疫调节多肽的其他实例包括巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf，例如tnf-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和干扰素。
[0122]
合适的免疫检查点调节剂的实例包括抗pdl-1(apdl1)、抗pd1(apd1)、抗ctla4(actla4)、双特异性t细胞接合剂(bite)、细胞因子和趋化因子例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12等)。
[0123]
合适的抗体的实例包括apdll；apdl；actla4；bite抗体；也会触发抗体依赖性细胞毒性(adcc)的抗生长因子抗体，例如抗egfr抗体(例如西妥昔单抗和赫赛汀)；具有抗炎作用的抗体，例如抗tnf(阿达木单抗、humira)；和jak抑制剂抗体。
[0124]
合适抗原的实例包括疫苗抗原。例如，多肽壳包含至少一种致病性抗原蛋白。致病性抗原蛋白可以是全长蛋白或其片段。合适的抗原蛋白的实例包含病毒蛋白或寄生蛋白的片段。例如，抗原可以来自选自cal09(流感病毒)、冠状病毒(例如β冠状病毒科或sars-cov-2)、乙型肝炎、百日咳杆菌、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、脑膜炎球菌、人乳头状瘤病毒(hpv)或疟原虫(plasmodium sporozoites)的病原体。在本实施方案中，优选地，多肽壳包含能够产生免疫应答(例如，至少一种致病抗原)的多肽，其重量与壳中的总多肽相比不小于1重量％，例如约10重量％。
[0125]
在一个优选的方面，抗原蛋白是病毒刺突蛋白，优选sars-cov-2蛋白的刺突蛋白(例如sars-cov-2s1亚基蛋白(rbd))。另一方面，抗原是环子孢子蛋白(csp)，是子孢子寄生
虫的分泌表面蛋白。在进一步的方面，抗原是hepb表面抗原蛋白(hbsag)。在另一方面，抗原与流感病毒相关并且选自血凝素和/或流感神经氨酸酶。另一方面，抗原是丝状血凝素(百日咳)。另一方面，抗原是肺炎球菌表面蛋白a(pspa)。另一方面，抗原选自奈瑟氏菌黏附因子a(nada)、奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)和/或因子h结合蛋白(fhbp)。另一方面，抗原是hpv-16e6/e7融合蛋白。也可以使用这些蛋白质中任意一种的片段或基因修饰版本。
[0126]
合适的佐剂的实例包含人白蛋白(例如牛血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、卵清蛋白)、sflt配体、细胞因子和趋化因子，例如白细胞介素(例如il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0127]
合适的抗炎药的实例包括阿达木单抗(humira)。
[0128]
一方面，多肽壳包含铁转运蛋白(例如转铁蛋白)。
[0129]
一方面，颗粒不含抗原，例如，它们不含致病性抗原蛋白。
[0130]
多肽壳可包含单一多肽或两种或更多种不同多肽的混合物。优选地，多肽壳包含单一多肽(即，多肽壳包含单一类型的多肽，包含其片段，并且不包含两种或更多种不同多肽的组合)。
[0131]
多肽壳任选地与一个或多个配体偶联。例如，多肽壳可以与选自肽、蛋白质、糖、纳米颗粒和核酸的一种或多种配体偶联。标记部分也可以与多肽壳偶联。出于多种原因，通常使用与蛋白质的偶联。例如，可以通过与聚糖(糖)或具有特定所需性质的其他蛋白质(例如抗原)偶联来修饰蛋白质的性质。可以提供标记部分以使颗粒成像，例如作为诊断测定的一部分。
[0132]
在本发明中可采用的与蛋白质偶联的常见技术是将赖氨酸残基靶定在蛋白质表面上。因此，具有与胺(例如，nhs)反应的基团的配体可以与多肽壳上的赖氨酸偶联。然而，可以采用替代的偶联化学。
[0133]
配体可在颗粒形成后与多肽壳偶联。或者，配体可以在颗粒形成之前与多肽偶联。
[0134]
多肽颗粒的壳厚度通常为至少10nm，优选至少20nm，例如约30至40nm。例如，多肽壳厚度可以为10至100nm，优选20至60nm。多肽纳米颗粒壳的厚度可以通过冷冻切片和tem成像来确定。
[0135]
本发明的颗粒高度稳定并且可以作为在水溶液中的混悬剂或以固体形式储存。例如，颗粒可以在4℃下保存至少几个月。
[0136]
合成
[0137]
本发明的多肽颗粒可通过两步工艺制备，该两步工艺涉及(a)获得具有多肽壳和水不混溶核的颗粒，所述核包含一种或多种挥发性组分、和任选的一种或多种非挥发性组分，以及(b)从核中去除挥发性组分以产生具有超声响应特性的所需具有凹痕的颗粒。
[0138]
因此，本发明提供了生产根据本发明的多肽颗粒的方法，包括：
[0139]-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、任选的一种或多种治疗剂或诊断剂、以及任选的一种或多种非挥发性组分；
[0140]-将所述水不混溶相与至少一种包含至少两个半胱氨酸残基的多肽的水溶液混合，从而提供双相组合物；
[0141]-交联半胱氨酸残基以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的
颗粒；和
[0142]-通过使所述颗粒处于减压条件下在颗粒中从核中去除挥发性组分，从而产生一个或多个凹痕。
[0143]
通常通过首先产生双相组合物来制备颗粒，所述双相组合物包含(1)水不混溶相，所述水不混溶相包含一种或多种挥发性组分以及一种或多种治疗剂或诊断剂和任选的一种或多种非挥发性组分；以及(2)包含存在于多肽壳中的多肽或多肽混合物的水相。水溶液通常包含至少约0.05重量/体积％的多肽，例如至少约0.5％、优选至少约1重量/体积％的多肽。通常，多肽浓度不高于约25重量/体积％，例如不高于约15重量/体积％，优选不高于约10重量/体积％。因此，水相中多肽的合适浓度为0.5至15重量/体积％，优选1至10重量/体积％，更优选约5重量/体积％。
[0144]
双相混合物中水不混溶相与水相的体积比通常约为1:5至3:1，例如1:4至1:1，例如约1:3。
[0145]
水不混溶相包含一种或多种挥发性组分。挥发性组分的性质没有特别限制，但通常选择使得该挥发性组分或每种挥发性组分是(a)与水不混溶的，通常是挥发性有机组分，例如挥发性有机溶剂，并且(b)在减压步骤中容易除去。因此，通常，该挥发性组分或每种挥发性组分在25℃下的蒸气压大于相同温度下水的蒸气压。通常，该挥发性组分或每种挥发性组分在25℃时的蒸气压为至少3kpa、优选至少3.5kpa、例如至少5kpa、至少10kpa或至少15kpa。合适的挥发性组分包含环己烷、己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯和甲苯，例如己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯和甲苯。环己烷是优选的挥发性组分。可以使用这些组分中的两种或更多种的混合物。
[0146]
挥发性组分最初可用作任何存在的治疗剂或诊断剂的溶剂，使得治疗剂或诊断剂在挥发性组分中的溶液用于制备本发明的颗粒。所使用的任何药学上可接受的赋形剂也可以溶解在水不混溶组分中。
[0147]
在下一步之前，双相混合物可以在升高的温度下保持一段时间。例如，双相混合物可以在约37℃下孵育长达2小时，例如约1小时。
[0148]
然后，将包含水不混溶相和水相的双相混合物置于使多肽中的半胱氨酸残基交联的条件下。所使用的条件也可以使混合物乳化。通常，例如，交联是通过使双相混合物均质化来实现的，例如通过施加高压和/或高剪切应力条件。优选地，使用超声进行均质化。在另一个优选的实施方案中，通过高剪切混合进行均质化。高剪切应力导致多肽交联，特别是通过连接多肽链内的半胱氨酸基团。应当理解，均质化条件可以氧化半胱氨酸残基上的巯基，或破坏现有的二硫键，从而允许新的二硫键形成并产生交联的壳结构。水不混溶相保持物理地捕获在交联的多肽壳内，从而提供所需的核-壳结构。通过均质化步骤产生的颗粒通常是基本上球形的。
[0149]
实现均质化的方法的一个实施例是将超声探头放置在水相和水不混溶相的界面处，并施加低频超声。可以以大约50％的振幅施加超声。例如，可以施加超声至少1分钟，例如约3分钟。例如，使用qsonica q125超声探头(频率：20khz；功率：125瓦)以50％振幅持续3分钟实现颗粒形成。
[0150]
实现均质化的另一种方法是使用流体动力空化，它使用高压将液体泵入狭窄的孔口。当液体通过孔口时流速增加，并且通过孔口后速度随后降低，导致空化核生长然后塌
陷。将流体动力学空化应用于双相混合物可能会引起半胱氨酸残基的交联和/或乳化，从而导致颗粒的形成。流体动力剪切是另一种替代方法，它可以产生相同的活性氧，减少/氧化导致颗粒形成的半胱氨酸残基。例如，该方法可包含通过高剪切混合形成预乳液，然后使该预乳液通过流体动力剪切微流化器，例如在7000psi至40000psi(约50至约275mpa)、通常10000至30000psi(约70至约200mpa)、例如约20000psi(约140mpa)的压力下。也可以使用其他超声处理方法。例如，可以使用肿瘤匀质器。
[0151]
通过这种均质化方法产生的具有水不混溶核和多肽壳的球形颗粒在本领域中是已知的，并且先前已经描述了它们的合成方法(参见suslick k.s.和m.w.grimstaff，美国化学学会会刊，1990，112(21)，7807-7809页，其内容通过引用并入本文)。本发明的颗粒可以通过这样的技术或其他超声处理方法来制备，例如us5439686中描述的那些，其内容通过引用并入本文。
[0152]
在产生多肽壳之后，本发明的颗粒经历去除挥发性组分的步骤，导致颗粒变形并因此产生所需的具有凹痕的结构。挥发性组分的去除可以在减压条件下进行。例如，该步骤可以使用真空蛋白质浓缩器例如speed vac
tm
(thermo scientific)来进行，但也可以使用其他仪器，例如旋转蒸发仪。减压条件通常施加至少30分钟，优选至少1小时。例如，可以施加减压2至16小时。冻干(冷冻干燥)可用作去除挥发性溶剂的替代方法。在一些实施方案中，采用这些方法的组合。
[0153]
除去挥发性组分的步骤除去存在的全部或部分挥发性组分。优选至少50％，更优选至少80％、90％或95％的挥发性组分被去除。更优选地，基本上全部(例如，至少98体积％、99体积％或99.5体积％)挥发性组分被去除。移除足以创建凹痕结构。
[0154]
存在于水不混溶相中的挥发性组分的性质和量影响粒径并且可以用作控制所产生粒径的因素。挥发性组分的量也会影响颗粒的变形，从而影响任何凹痕的大小。一般而言，挥发性组分的量越大，预期产生的凹痕尺寸越大。由于气泡被困在凹痕空腔内的可能性发生变化，凹痕尺寸的变化也可能与凹痕颗粒产生的空化效应有关。
[0155]
当在水不混溶相中同时使用挥发性和非挥发性组分时，可通过改变水不混溶相中非挥发性组分和挥发性组分的相对量来改变挥发性组分的量。通常，(a)含有溶解的治疗或诊断组分的挥发性组分与(b)非挥发性组分的体积比为约1:20至20:1，优选约1:4至15:1，例如约1:3至3:1，更优选约0.5:1至2:1(1:2至2:1)，最优选约1:1。通常需要至少1:20的挥发性与非挥发性组分的最小体积比(约5体积％非挥发性组分)，以在从核中去除挥发性组分时实现颗粒中的凹痕。已发现，在水不混溶相中，挥发物含量至少为40体积％，优选为45体积％至55体积％，优选约为50体积％(或1:1)，可提供改善的空化性能。
[0156]
在另一个优选实施方案中，水不混溶相中挥发性与非挥发性组分的比例通常为约1:20至20:1，优选约1:4至15:1，例如约1:1至15:1，更优选约5:1至10:1。
[0157]
或者，水不混溶相可基本上不包含非挥发性组分，或可不存在非挥发性组分。因此，可以存在不超过5体积％，例如不超过2体积％、1％或0.5体积％的非挥发性组分，例如不超过0.1体积％或0.01体积％的非挥发性组分。
[0158]
当使用时，存在于水不混溶相中的治疗剂或诊断剂的量可以变化并且取决于试剂的性质。例如，治疗剂或诊断剂在挥发性组分中的存在量可以为0.1ug至1mg/ml，通常为0.5至100ug/ml，例如1至10ug/ml。一旦产生，存在于颗粒核中的治疗剂或诊断剂的量可以通过
改变挥发性组分中试剂的浓度来控制。
[0159]
本发明的方法还可以包括以下步骤：
[0160]-干燥颗粒；和
[0161]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中。
[0162]
干燥步骤可通过蒸发进行，例如在减压和/或温和加热的情况下。例如，该步骤可以使用温度设定至高达约40℃的旋转蒸发仪来进行。通常，干燥步骤与挥发性组分的蒸发步骤相结合，但继续减压(和任选地温和加热)条件下进行较长时间并通过使用温和加热，以蒸发水以提供固体产品。因此，例如，可以通过施加减压条件和在高达40℃下加热直到产生固体来进行挥发性组分的去除和干燥。
[0163]
然后优选将颗粒重新悬浮在液体介质中，通常是水或水溶液例如缓冲液。重新悬浮可以为颗粒提供改善的长期稳定性，因此优选在储存之前将它们重新悬浮。然而，颗粒也可以以固体形式储存并在使用前重新悬浮。干燥和重新悬浮可能有助于将气泡捕获在颗粒上的任何凹痕中，从而提供改进的惯性空化响应。
[0164]
该方法可以替代地或另外地包括：
[0165]-冻干颗粒；以及
[0166]-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中。
[0167]
冻干可用于除去挥发性溶剂并干燥颗粒，例如以与前述旋转蒸发类似的方式。因此，冻干被用作溶剂去除/干燥方法的替代方法，如上所述。或者，冻干可以在通过另一种方法除去溶剂之后进行，并且任选地在如上所述的干燥之后进行。
[0168]
通常，将颗粒重新悬浮在液体介质中，通常是水或水溶液，例如缓冲液。重新悬浮可以为颗粒提供改善的长期稳定性，因此优选在储存之前将它们重新悬浮。然而，颗粒也可以以固体(冻干)形式储存并在使用前重新悬浮。冻干和重新悬浮可以进一步帮助将气泡捕获在颗粒上的任何凹痕中，这提供了改进的惯性空化响应。经干燥和重新悬浮、随后冻干和重新悬浮的颗粒已经证明了特别改进的空化响应。
[0169]
干燥和/或冻干的步骤可以用本文描述的任何颗粒进行。然而，在一个优选的实施方案中，当颗粒通过使用核中仅含有挥发性组分(即，挥发性组分蒸发后的最终颗粒在核中不包含水不混溶液体)生产时，或者当颗粒使用低比例，约10体积％、通常小于10体积％、优选小于5体积％、例如小于1体积％或小于0.1体积％的水不混溶相中的非挥发性组分(使得最终颗粒具有包含少量非挥发性组分，例如与总颗粒相比约10体积％、小于10重量％、优选小于5重量％的核)生产时，优选将颗粒干燥和/或冻干。最优选地，将这些颗粒干燥、重新悬浮，然后冻干。还更优选地，将这些颗粒干燥、重新悬浮、冻干并再次重新悬浮。
[0170]
颗粒可以通过合适的方式纯化和/或进行筛分过滤。例如，可以通过任何合适的方法，例如通过透析，例如通过具有适当大小(例如1m da)截留分子量的透析过滤器透析，将颗粒与残余油、溶剂和蛋白质分离。尺寸过滤和/或离心也可用于限制颗粒的最大尺寸。纯化可以在挥发性组分蒸发之后、干燥和重新悬浮之后、或者在冻干和重新悬浮之后进行。
[0171]
颗粒可以悬浮在液体介质中以供储存或使用，液体介质例如水或水溶液，任选为缓冲溶液。
[0172]
组合物
[0173]
本发明提供了一种组合物，通常是药物组合物，其包含一种或多种本文所述的多
肽颗粒。组合物可以单独包含多个多肽颗粒，或者颗粒可以与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂一起提供。通常，与载体或稀释剂一起提供的组合物含有至多85重量％的本发明颗粒。更典型地，这样的组合物含有至多50重量％的本发明的颗粒。优选的药物组合物是无菌且无热原的。
[0174]
本发明的组合物可以包含一种或多种不同类型的根据本发明的颗粒。例如，组合物可包含具有第一类型多肽壳的第一颗粒和具有第二(不同)类型多肽壳的第二颗粒。通常，本发明的组合物包含单一类型的颗粒。类似地，该组合物可包括在核中具有第一(组合)治疗剂或诊疗剂的第一颗粒和在核中具有第二(组合)治疗剂或诊疗剂的第二颗粒。
[0175]
组合物中的颗粒可以基本上是单分散的。例如，它们的多分散性指数为0.20或更小，例如0.19或更小、0.18或更小、0.17或更小、0.16或更小、或者0.15或更小。颗粒的更大单分散性可以提供对空化的更大控制，从而改善声学调谐(acoustic tuning)。多分散性可以通过dls测定。
[0176]
根据治疗的性质，本发明的颗粒可以通过任何合适的途径给药，例如口服(如糖浆、片剂、胶囊、含片、控释制剂、速溶制剂等)；外用(如凝胶、乳膏、软膏、洗剂、鼻喷雾剂或气雾剂等)；通过注射(皮下、皮内、肌肉、静脉注射、肿瘤内、鞘内等)、透皮(如贴片、凝胶或植入物)或吸入(干粉、溶液、分散体等)。在一个方面，所述颗粒通过肠胃外给药，例如通过输注或注射，优选通过静脉、肌肉、皮内或皮下给药来施用。在另一方面，颗粒通过透皮给药来施用。优选地，所述颗粒经肠胃外施用，例如通过注射(优选在血管内或鞘内)或透皮施用。
[0177]
例如，固体口服形式可以与本发明的颗粒一起含有稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；粘合剂；例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，例如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸酯；一般来说，药物制剂中使用的无毒且无药理活性的物质。此类药物制剂可以以已知的方式制造，例如通过混合、制粒、压片、糖衣或薄膜包衣工艺。
[0178]
在一个实施方案中，与载体或稀释剂一起提供的组合物是液体分散体。通常，水(优选无菌水)用作液体分散体的稀释剂。用于口服给药的液体分散体可以是糖浆剂、乳剂和混悬剂。混悬剂是优选的。糖浆剂、乳剂和混悬剂可以含有作为载体的例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。葡萄糖是优选的载体。例如，颗粒可以作为葡萄糖溶液中的混悬剂提供，例如包含高达10重量％葡萄糖的葡萄糖溶液，例如约5重量％葡萄糖。
[0179]
混悬剂和乳剂可以含有作为载体，例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。用于肠胃外给药的混悬剂或溶液，例如肌内注射剂可以与活性化合物一起含有药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、乙二醇，例如丙二醇，如果需要的话，适量的盐酸利多卡因。
[0180]
以混悬剂形式施用的颗粒可以以冻干颗粒的形式提供，用于在施用前在合适的载体(例如无菌水)中重构。
[0181]
用于透皮施用的凝胶可以包含选自醇例如乙醇或丙醇、甘油、丙二醇或聚乙二醇的稀释剂。凝胶还可以包含防腐剂并且可以包含水或缓冲溶液。可以掺入渗透增强剂，例如
脂肪酸、脂肪醇、尿素、亚砜、氮酮、吡咯烷酮、精油、萜烯和萜类化合物。或者，用于透皮递送的凝胶可以配制为囊泡(proniosome)或微乳凝胶。
[0182]
施用
[0183]
如上所述，本发明的颗粒可通过多种给药途径施用。一旦施用，在靶位点提供超声以产生颗粒的惯性空化响应。
[0184]
超声通常以100至3000khz，例如100至1000khz，例如200至600khz的频率递送，并且任选地，占空比(dc)为1％至20％，例如从2％到15％。通常，所递送的超声的脉冲重复频率(prf)为0.01至100hz，例如0.1至50hz，优选为0.1至20hz。通常，超声在0.5mpa至7.0mpa的峰值负压(pnp)下提供，例如0.5至3.0mpa，例如1.0至2.5mpa，例如至少1.5mpa或1.5至2.5mpa。
[0185]
特别优选的超声条件为1.0至2.0mpa和100至600khz。
[0186]
超声参数可根据施用方式而变化。例如，对于透皮递送，超声可以以100至500khz，例如200至300khz的频率递送，并且任选地以5％至20％，例如5％至15％的占空比(dc)递送。通常，所递送的超声的脉冲重复频率(prf)为0.1至100hz，例如，1至50hz，优选5至20hz。通常，超声在0.5mpa至2.0mpa，例如1.0至2.0mpa、1.5mpa至2.0mpa或1.5至1.8mpa的峰值负压(pnp)下提供。
[0187]
对于肠胃外施用，例如注射颗粒，超声通常以200至3000khz，例如200至1000khz，例如400至600khz的频率传递，并且任选地，占空比(dc)为1％至10％，例如2％至10％。通常，所递送的超声的脉冲重复频率(prf)为0.01至50hz，例如0.1至10hz，优选0.1至1hz。通常，超声的峰值负压(pnp)为1.0mpa至7.0mpa，例如1.0至3.0mpa，例如1.5至2.5mpa。
[0188]
超声可施加持续时间为10秒至15分钟，通常为30秒至10分钟，优选为1至5分钟。透皮递送情况下，特别优选的治疗时间为1至3分钟，最优选约2分钟。
[0189]
施用后将颗粒暴露于超声会在含有颗粒的流体中引起惯性空化效应。例如，如果颗粒是全身施用，例如血管内或动脉内，颗粒暴露于靶位点的超声会导致血管内的惯性空化。这可能导致微流效应，其中颗粒本身和任何包含治疗剂或诊断剂可能被运送到靶位点。通过这种方式，惯性空化可以选择性地靶向选定的给药位点。
[0190]
类似地，对施用于皮肤的颗粒制剂施加超声可以在制剂内引起惯性空化，从而有助于颗粒和包含诊断剂或治疗剂的颗粒的透皮递送。超声以前曾被用来辅助药物的透皮递送。然而，之前的工作主要集中在使用超声来渗透皮肤，并且通过其他方式，例如通过弹道递送(ballistic delivery)来递送颗粒。相反，本发明仅通过将颗粒以合适的制剂(例如凝胶)施用并在该位点提供超声就能够使颗粒穿过皮肤。小尺寸颗粒和惯性空化引起的微流效应相结合，推动颗粒穿过相对不渗透的角质层，从而提供有效的透皮递送。
[0191]
本文提供的实施例演示了通过透皮给药成功地施用本发明的颗粒。颗粒与编码荧光素酶的dna一起施用，给药后的发光测量提供了透皮给药成功程度的指示(参见图11)。与现有技术的空化剂相比，用本文所述的空化剂施用后观察到更大程度的发光。发光效果与直接注射dna的效果相当。
[0192]
颗粒的用途
[0193]
本发明的颗粒可用于空化辅助递送治疗剂和诊断剂到体内的靶位点。此前，kwan等人在small杂志(2015年10月；11(39):5305-5314)中证实了惯性空化在选定位置积聚纳
米颗粒的作用。本发明的颗粒具有在体内产生惯性空化效应的能力，同样可以积聚在选定的靶位点，例如肿瘤。因此，本发明在期望的靶位点提供治疗剂或诊断剂的积累。
[0194]
在施用纳米颗粒后施加超声会引起空化。这增强了所含治疗剂或诊断剂进入细胞的运输。以这种方式使用空化来增强活性剂进入细胞的运输的一个特别优点是，超声可以在选定的位置施加，导致活性剂仅在这些选定的位置被运输到细胞中。此外，使用惯性空化来增强运输可以增加药剂到达靶位点的数量。蛋白质的生物降解可在靶位点选择性地释放所含的治疗剂或诊断剂。因此，本发明的颗粒可用于增加药剂至靶位点的递送。
[0195]
因此，本发明提供了用于增强免疫治疗剂或诊断剂至靶位点的转运的颗粒。本发明还提供了一种用于增强治疗剂或诊断剂至靶位点的转运的方法。还提供了在制备药物中使用本文所述的颗粒或组合物，用于增强治疗剂或诊断剂至靶位点的转运。这种增强的转运增加了免疫调节多肽的细胞外或细胞内浓度。增强输运是通过惯性空化的微流效应实现的。颗粒在物理上被驱动通过细胞之间的天然孔洞，例如内皮细胞中的天然孔洞。因此，与增加内皮通透性的方法相比，这提供了一种改进的运输治疗剂或诊断剂的方法。
[0196]
当本发明的颗粒用于将药物输送到血管外位点时，例如向肿瘤提供治疗时，优选地，颗粒的尺寸为500nm，通常为100nm至500nm。更优选的是，所述颗粒的尺寸为100至300nm。例如，为了通过增强渗透性和滞留性(epr)效应来改善肿瘤组织中的积累，可能需要这样的颗粒尺寸。肿瘤组织可能含有形态和结构异常的新生血管，导致异常的分子和流体传输动力学。这可能产生约100nm至500nm，例如100至300nm的纳米颗粒，在肿瘤组织中的积累量比在正常组织中的积累量要多得多。纳米颗粒的尺寸为100至500nm，例如100至450nm或100至300nm可能是优选的，特别是用于治疗肿瘤。在优选实施例中，纳米颗粒用于治疗肿瘤，粒度为450nm或更小。
[0197]
所述颗粒可透皮施用，因此也可用于治疗皮肤疾病或病症。它们也可用于治疗皮肤损伤或感染(例如，当颗粒含有一种或多种抗生素、抗病毒药物和/或止痛药时)。
[0198]
所述颗粒在肿瘤治疗中特别有用(例如，其中所述颗粒含有一种或多种化学治疗剂，如本文讨论的那些)。在这种情况下，超声可用于将药物靶向肿瘤。所述颗粒还可用于治疗心血管疾病，特别是溶栓性疾病，例如缺血性中风或深静脉血栓形成(例如，其中所述颗粒含有一种或多种抗血栓剂，例如tpa)。在这种情况下，当使用超声响应颗粒时，超声可以用来靶向颗粒以将其递送到心脏。所述颗粒还可用于治疗感染(通常是细菌感染)，例如尿路感染和骨折后可能发生的感染(例如颗粒含有一种或多种抗生素)。在这种情况下，当使用超声响应颗粒时，超声可用于靶向感染或损伤位点。所述颗粒还可用于治疗神经系统疾病和失调，如阿尔茨海默病、帕金森病和特发性震颤以及其他神经系统疾病(例如，其中颗粒含有一种或多种抗抑郁药、抗癫痫药、抗精神病药或已知可治疗神经系统疾病的药物时)。在这种情况下，当使用超声响应颗粒时，超声可以用来将颗粒靶向递送到大脑。使用超声辅助递送可能有打开血脑屏障的额外好处。
[0199]
所述颗粒还可用于任何需要惯性空化的情况，例如组织切片和热消融，特别是当这些方法有效地伴随着治疗剂的施用，或通过诸如造影剂的诊断剂的施用来监测时。例如，颗粒可用于涉及使用惯性空化引起局部组织消融和/或去除以实现治疗结果的方法。这些方法包括例如在治疗心脏病中治疗肿瘤和去除心脏组织。在这方面，本发明的颗粒由于其小尺寸、稳定性和生物降解性而具有优势。
[0200]
因此，本发明提供了本文所述的用于诊断或治疗方法的颗粒和组合物。该方法通常包括施用本文所述的颗粒或组合物并施加超声。特别地，所述颗粒或组合物用于在所述主体中产生惯性空化。惯性空化可在选定的靶位点产生，使得所述颗粒可用于向靶位点输送治疗剂或诊疗剂。还提供了一种治疗受试者的方法，该方法包括施用本文所述的有效量的颗粒或组合物并施加超声。该方法可在主体中产生惯性空化。还提供了在制造用于通过治疗或诊断进行治疗的药物中使用本文所述的颗粒或组合物的方法，该方法包括施用颗粒或组合物和施加超声。特别地，该药物用于在受试者中产生惯性空化。
[0201]
纳米颗粒还可以提供体内药物分布的实时跟踪和绘图，例如使用传统的超声成像或惯性空化的被动声学绘图(wo 2010 052494)。
[0202]
任何诊断或治疗性治疗的对象通常是哺乳动物，优选是人。
[0203]
剂量
[0204]
本发明的颗粒的剂量可以根据各种参数，特别是根据所使用的物质；接受治疗的个体的年龄、体重和状况；施用途径以及所需的治疗方案来确定。例如，每个剂量中颗粒的量可以选择为诱导免疫应答的量。医生将能够确定任何特定个体所需的施用途径及剂量。该剂量可以作为单剂量提供或者可以作为多剂量提供，例如以规则间隔服用，例如每小时施用2、3或4剂。通常，通常，基于多肽的治疗以1pg至1mg、更典型地1pg至10μg的范围施用用于颗粒介导的递送，以及1μg至1mg、更典型地1至100μg、更典型地5至50μg施用以用于其他途径。通常，预计每个剂量将包括0.01至3mg的多肽。
[0205]
实施例
[0206]
颗粒合成
[0207]
根据方案a制备超声响应颗粒如下：
[0208]
将3ml的50mg/ml蛋白质溶液用1ml含有油和任选的挥发性组分以及在某些情况下还含有添加剂的水不混溶溶液覆盖，以产生双相溶液。将双相混合物密封在玻璃瓶中并在37℃的培养箱中放置1小时。
[0209]
然后将超声探头放置在两层的界面处，并使用qsonica q125以50％振幅施加125瓦的低频超声3分钟。这产生了颗粒的乳液，其中包含含有水不混溶的混合物的核和蛋白质壳。
[0210]
然后使用speedvac
tm
蛋白质浓缩器在减压下除去颗粒核的挥发性溶剂成分，以提供含有颗粒的溶液。
[0211]
然后通过在1m da分子量过滤器中透析24至48小时，将所得具有凹痕的颗粒与残油、溶剂和蛋白质分离。
[0212]
还根据修改后的方案b制备颗粒。方案b与方案a相同，不同之处在于蛋白质的浓度较低，为666ul水中0.5mg蛋白质，然后用333ul的油/挥发性溶剂层覆盖。
[0213]
还根据修改后的方案c生产颗粒：
[0214]
将3ml的50mg/ml的蛋白质溶液用1ml水不混溶的溶液覆盖以产生双相溶液。将双相混合物密封在玻璃瓶中并在37℃的培养箱中放置1小时。
[0215]
然后将超声探头放置在两层的界面处，并使用qsonica q125以50％振幅施加125瓦的低频超声3分钟。这产生了颗粒的乳液，其中包含含有水不混溶混合物的核和蛋白质壳。
[0216]
然后通过在40℃下旋转蒸发48小时在减压下除去颗粒核的挥发性溶剂组分以提供固体颗粒。
[0217]
颗粒重新悬浮在水中。然后将一些颗粒冷冻干燥48小时，然后再次重新悬浮在水中。
[0218]
制备了以下颗粒：
[0219]
表1
[0220][0221][0222]
使用的牛血清白蛋白(bsa)纯度》99％，sigma a7638。
[0223]
igg是从人血中分离出来的非特异性igg((》99％ sigma,14506)。
[0224]
使用的covid刺突蛋白为sars-cov-2，si，rbd，cambridge bioscience，230-30162-1000
[0225]
颗粒分析和颗粒表面化学改性
[0226]
在颗粒与荧光团偶联后，通过动态光散射(dls)、扫描电子显微镜(sem)和转盘共聚焦显微镜对颗粒进行分析。
[0227]
扫描电镜分析
[0228]
仪器：
[0229]
使用zeiss sigma 300场发射枪扫描电子显微镜(feg-sem)进行扫描电子显微镜(sem)分析。
[0230]
方法：
[0231]
通常将原液稀释为1/1000。将其用1％戊二醛固定2小时，并将10ul添加到黑色碳带上并在成像前涂金。
[0232]
转盘共聚焦显微镜
[0233]
仪器：
[0234]
使用andor dragonfly转盘共聚焦显微镜生成高分辨率z堆栈，然后将其编译成蛋白质颗粒的3d重建。
[0235]
方法：
[0236]
颗粒与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或alexafluor tm 488n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应1小时。使用10kda分子量盒透析16小时用于在成像之前去除残留的未偶联染料。
[0237]
动态光散射
[0238]
仪器：
[0239]
使用dls(zetasizernano，malvern)和红色激光测量尺寸分布。每个样品均经过大约10次运行的3次测量进行测试。
[0240]
方法：
[0241]
用millipore水将10ul如上所述制备的颗粒样品稀释至1ml并在标准1ml比色皿中进行分析。
[0242]
图3a至3b和图3c分别通过3d共聚焦显微镜和扫描电镜显示了前述实施例1的颗粒。配体通过nhs-赖氨酸偶联成功地与颗粒偶联，并通过共聚焦显微镜观察颗粒，如图3a所示。
[0243]
可以看到颗粒具有凹痕结构，这与颗粒在凹痕中捕获气泡的能力相一致。颗粒有一个或两个主要的凹痕。
[0244]
该实验还证实，在形成颗粒后，蛋白质保留了进行标准蛋白质偶联反应的能力，在这种情况下，与靶向赖氨酸残基的化学反应。两种不同的赖氨酸反应染料偶联后，颗粒发出荧光。
[0245]
图3d显示了使用光学显微镜观察的根据实施例20(经过冷冻干燥和在水中重悬)的颗粒。
[0246]
将化合物添加到油核中
[0247]
实施例1a表明，在合成过程中溶解在油层中的化合物被掺入颗粒的油核中。
[0248]
按照前述实施例1中所述的方案a来制备颗粒，但在应用超声形成颗粒之前，将300ug尼罗红油溶性荧光团掺入油层中。通过透析从颗粒中除去任何残留的荧光团。
[0249]
使用荧光共焦显微镜对颗粒进行成像。这证实了颗粒核内存在尼罗红。
[0250]
实施例1b描述了含有治疗药物特拉唑嗪的颗粒的制备。特拉唑嗪以1mg/ml的浓度
包含在三氯甲烷挥发性组分中，并在颗粒制备前与葵花籽油混合。根据标准方案a制备蛋白质颗粒。
[0251]
纯化的蛋白质颗粒用β巯基乙醇和蛋白酶k在60℃消化1小时，使蛋白壳破裂并释放内核。然后通过uplc分析核含量以确认特拉唑嗪的存在。uplc分析基本上按照balireddi等人(hournal of chrom science，第57卷，第3期，2019年3月，第249-257页)所述的方法进行。
[0252]
uplc分析证实了特拉唑嗪的存在，如图3e所示。图3e(ii)显示了紫外吸光度曲线，其对应于咪喹莫特的特征吸光度曲线。图3e的上图显示消化蛋白颗粒的uplc分析，而下图显示特拉唑嗪的参考标准品。荧光检测，ex＝280,em＝413nm。
[0253]
挥发性组分对颗粒大小的影响
[0254]
在实施例3至6中，挥发性组分的性质发生了变化，以确定其对粒度的影响。结果如图4所示，表明挥发性组分的变化可以用来改变粒度。同样，在实施例7至10中，挥发性组分的量也发生了变化，并研究了粒度的变化。结果如图5所示。挥发性组分的增加通常会导致粒度的减小。
[0255]
多肽的变化
[0256]
如实施例14至19中所述，实现了蛋白质的变化以将各种不同的蛋白质结合到颗粒中。
[0257]
颗粒的体外空化
[0258]
所有惯性空化测量均在0.5mhz频率、1000周期脉冲长度和100ms脉冲重复周期下进行，驱动压力如下所示。
[0259]
首先，为了表征在不同尺寸颗粒的空化能力，将根据前述实施例1制备的颗粒通过200nm和450nm过滤器过滤，然后评估惯性空化。在0.5mpa、1.0mpa、1.5mpa和2.0mpa驱动压力下评估被动空化检测(pcd)水平。图6给出了未经过尺寸过滤的颗粒(所有尺寸)和通过200nm和450nm过滤器过滤的颗粒在30秒曝光期间的平均pcd水平。在所有颗粒中都检测到空化现象。
[0260]
还使用根据前述实施例18产生的颗粒证实了惯性空化。将颗粒暴露于1.2mpa下5分钟。图8显示了持续惯性空化的典型能量轨迹。
[0261]
还使用根据以上实施例20生产的颗粒证明了惯性空化。颗粒暴露于1.4m pa、1.7mpa和2.1mpa至少300秒。在冷冻干燥之前和之后对颗粒进行了研究。使用水作为对照。所有颗粒在所有条件下均观察到空化现象。在1.4mpa下，干燥但非冻干颗粒的空化时间少于20秒，但冻干颗粒的空化时间超过150秒。在1.7mpa下，对于干燥但非冻干的颗粒，观察到空化大约100秒，但对于冻干颗粒，观察到空化超过150秒。在2.1mpa下，对于干燥但非冻干的颗粒，观察到空化大约200秒，但对于冻干颗粒，观察到空化超过300秒。
[0262]
核挥发性组分百分比对空化能力的影响
[0263]
前述实施例11至13描述了以与实施例1相同的方式制备颗粒，但使用不同量的挥发性组分己烷。进行实验以确定改变挥发性溶剂的比例(以及颗粒中凹痕的潜在深度)是否会影响颗粒的空化能力。以与前述相同的方式研究空化，结果如图7所示。改变挥发性组分(以及凹痕深度)对颗粒的空化势有显着影响。尽管在所有挥发物含量水平下均检测到空化，但50体积％挥发物对于所得颗粒的空化而言是最佳的。
[0264]
体内空化超声方法
[0265]
下面描述的实验中的体内透皮颗粒空化是通过使用源换能器(117d-01，sonic concepts，美国)来启动空化来进行的。该换能器配有有机玻璃耦合锥(用于有效地将超声从声源传输到治疗靶点)，充满脱气水并覆盖声学透明的聚酯薄膜塑料。耦合锥的形状被设计成与聚焦超声束的壳对齐。将含有颗粒溶液的制剂支架放置在小鼠皮肤上，并将源换能器放置在其顶部，并放置聚酯薄膜塑料声学窗口以防止空气进入声学路径。充当无源声学检测器(pcd)的单元件球形聚焦超声换能器同轴位于源换能器内部，以记录空化信号。pcd信号通过2.0mhz高通滤波器，并由前置放大器(sr445a，斯坦福研究系统公司，美国)以25的相对增益进行放大。然后通过12位数字示波器(handyscope hs3100mhz，tiepie engineering，the netherlands)对信号进行数字化和实时监测，并将数据保存在外部硬盘驱动器(便携式ssd t5，三星，韩国)上(图2)。这种特定的空化检测设置已记录在gray等人的ieee trans中，uffc 65(2)2018，第258-267页。该设置示意性描述于图9中。
[0266]
透皮颗粒递送和体内空化
[0267]
将本发明的颗粒施用于小鼠，研究颗粒的透皮给药。通过透皮给药和超声给药，对所递送的蛋白质的免疫应答用于评估通过透皮给药随后超声的颗粒的成功递送。
[0268]
实验用8只小鼠，每只小鼠分别接受两种不同的颗粒制剂，每侧腹部各施用一种。因此，共进行了16项实验，具体如下：
[0269]
第1组：4
×
蛋白质颗粒+us
[0270]
第2组：3
×
蛋白质颗粒，不us
[0271]
第3组：3
×
蛋白质皮下注射
[0272]
第4组：3
×
蛋白质皮内注射
[0273]
第5组：3
×
蛋白质肌肉注射
[0274]
所使用的蛋白质颗粒是根据前述实施例1制备的颗粒。通过直接施加到小鼠胁腹(施加或不施加超声(us))或通过注射(如上所述)将颗粒施用于每只小鼠。所施用的各成分的总蛋白质含量为9mg。值得注意的是，对于注射，整个9mg的蛋白质被递送到小鼠，而对于透皮给药，仅递送9mg蛋白质的一小部分。在使用超声的情况下，按照前述“体内空化超声方法”中讨论的进行。暴露时间为10分钟。
[0275]
在以指定方式为每组施用颗粒后，通过进行elisa分析来确定对bsa蛋白的免疫应答，以研究递送后对bsa的免疫应答。
[0276]
结果如图10所示。透皮组(第1组)对bsa的免疫应答与注射组相当，表明通过透皮途径成功递送bsa。
[0277]
通过蛋白质颗粒的空化作用透皮递送编码荧光素酶的dna
[0278]
将根据本发明的颗粒或根据wo 2015/075442生产的聚合物颗粒施用于小鼠胁腹。实验用8只小鼠，每只小鼠分别接受两种不同的颗粒制剂，每侧腹部各施用一种。因此，共进行了16项实验，具体如下：
[0279]
·4×
蛋白质颗粒+dna luc(10分钟us暴露)
[0280]
·4×
蛋白质颗粒+dna luc(2分钟us暴露)
[0281]
·4×
聚合物颗粒+dna luc(10分钟us暴露)
[0282]
·4×
蛋白质颗粒+dna luc(10分钟，不us，假手术组(sham))
[0283]
所使用的蛋白质颗粒是根据前述实施例1制备的颗粒。聚合物颗粒按照wo 2015/075422生产。所有样品均以milliq水提供。蛋白颗粒为9mg蛋白，1.8ml milliq水。所有样品含有50μg编码荧光素酶的dna。将颗粒/dna直接应用于每只小鼠的腹部(施加或不施加超声)。超声(us)使用前述“体内空化超声方法”中描述的方法，用于指定的暴露时间。
[0284]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮递送。图11显示了治疗后22小时通过ivis成像进行的生物发光测量。将结果与直接注射(通过肌内、皮内或皮下注射)编码荧光素酶的dna后产生的生物发光进行比较。注射溶液与用于透皮给药的蛋白质颗粒溶液相同。
[0285]
当与目前的金标准空化剂(聚合物颗粒)相比时，使用本发明的颗粒作为空化递送剂的透皮施用dna在所有情况下都产生可比的或显着更强的发光。
[0286]
实施例20的颗粒也与萤光素酶pdna一起通过相同的方法透皮施用。图8a显示了在体内透皮递送荧光素酶pdna期间pcd在1.7mpa下随时间检测到的能量。在三个不同的时间点绘制频域，表明惯性空化占主导地位。使用2mhz高通滤波器从无源空化探测器获取声发射数据，因此在频谱图上看不到低于2mhz的信号。
[0287]
超声方法方案2
[0288]
下面描述的实验中的体内透皮颗粒空化是通过使用源换能器(117d-01，sonic concepts，美国)来启动空化来进行的。该换能器配有有机玻璃耦合锥(用于有效地将超声从声源传输到治疗靶点)，充满脱气水并覆盖声学透明的聚酯薄膜塑料。耦合锥的形状被设计成与聚焦超声束的壳对齐。将有机玻璃支架放置在耦合锥上，其中包含制剂支架并为麻醉鼻锥和小鼠提供空间。耦合锥充满脱气水，并且床将降低到耦合锥上。用发夹固定小鼠的颈背，并将皮瓣放置在制剂支架上。皮瓣通过放置在皮瓣顶部的吸声器固定。充当无源声学检测器(pcd)的单元件球形聚焦超声换能器同轴位于源换能器内部，以记录空化信号。pcd信号通过1.8mhz高通滤波器，并通过脉冲接收器(dpr300超声波脉冲器/接收器，jsr ultrasonics，imaginant，美国)以23的相对增益进行放大。然后将信号数字化并通过一个12位数字示波器(handyscope hs3 100mhz，tiepie engineering，荷兰)并将数据保存在外部硬盘驱动器(便携式ssd t5，三星，韩国)上(图12)。
[0289]
条件优化
[0290]
为了优化颗粒透皮递送的条件，进行了四项实验(下文为o1至o4)。在每种情况下，本发明的颗粒是根据实施例20(ex 20)的颗粒，其已被冷冻干燥并重新悬浮。在指定的不同条件下将颗粒施加到小鼠颈背上。为了研究有效递送，同时施用dna荧光素酶。
[0291]
所有样品均以超纯水(milliq水)提供。蛋白质颗粒以1.8ml milliq中的90mg蛋白质形式提供。所有样品均含有指定浓度的编码荧光素酶的dna。通过将颗粒/dna直接施用于小鼠颈背(施加或不施加超声)，或通过皮内施用(如所指示的)，将颗粒/dna施用于每只小鼠。使用上面“超声方法方案2”中描述的方法，在指定的暴露时间和指定的压力下施加超声(us)。
[0292]
大约24小时后，使用体内成像系统(ivis，perkinelmer，美国)评估发光。将100μl 15.8mg/ml pierce
tm d-荧光素(thermofisher scientific，美国)注射到尾静脉中。注射后3.5分钟对小鼠进行成像并成像30秒。图像使用living(美国)进行治疗。以数字方式选择治疗区域并确定总通量(光子/秒)和平均辐射率(光子/秒/cm2/sr)。
[0293]
在下面的实施例中，cmv-luc的参考是pdna(pgl4.50[luc2/cmv/hygro]vector(promega,usa))。对于注射，全部142ug的dna被递送，而对于透皮给药，只有一小部分被递送。
[0294]
us＝特定条件下的超声递送，id为皮内递送
[0295]
o1-压力优化:
[0296]
组标签组大小给药颗粒us压力cmv-luc pdnaus处理时间a14us实施例200.4mpa142ug5minb14us实施例201.5mpa142ug5minc14us实施例201.7mpa142ug5mind14us实施例202.0mpa142ug5minf14id无-142ug-[0297]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮给药和dna表达。图13显示了治疗后约22小时通过ivis成像对0.4mpa、1.5mpa、1.7mpa和2.0mpa组(前述a至d组)进行的生物发光测量。在所有压力下均可观察到成功的递送，最佳递送压力为1.5至1.7mpa。图14显示了在递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光。同样，所有组均成功给药，1.5-2.0mpa的给药效果与皮内给药相似，而且给药的一致性更强。
[0298]
o2-时间优化
[0299]
组标签组大小给药1颗粒us压力cmv-luc pdnaus处理时间a24us实施例201.7mpa142ug10minb24us实施例201.7mpa142ug5minc24us实施例201.7mpa142ug2mind24us实施例201.7mpa142ug1min
[0300]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮递送。图15显示了不同处理时间后约24小时后观察到的发光。所有组均可成功递送，最佳递送时间为2分钟。皮肤损伤可能发生在较长的治疗时间，因为更多的超声暴露会增加能量沉积。
[0301]
分析pcd检测到的空化信号以确定总声学传感器能量(tase)，定义为：
[0302][0303]
总之，计算了在时间窗口内测量的电压的均方根。为了计算总功率，将电压的均方根平方并除以阻抗，估计为50ω。将其乘以实际脉冲时间来估计每个脉冲的总能量。将每个脉冲的估计能量相加即可得到总声学传感器能量(tase)。这表明可以检测到至少长达10分钟的持续空化(图16)。
[0304]
o3-颗粒剂量
[0305]
[0306]
通过施用后荧光素酶的产生来评估成功的透皮递送和dna表达。图17显示了在大约24小时后在所有情况下观察到的发光，对于存在的实施例20的颗粒的全浓度或50％稀释浓度，递送显着增加。
[0307]
o4-与皮内给药的比较
[0308][0309]
每只小鼠的颈背右侧均接受超声处理，并在侧腹皮内注射。24小时后处死小鼠。
[0310]
图18a显示了在递送编码荧光素酶的dna之后观察到的发光。根据本发明的透皮递送实现了与皮内递送相似的效果，并且具有更大的一致性。图18b和18c显示分别在透皮(a4组)和皮内(b4组)组治疗后约24小时通过ivis成像进行的生物发光测量。
[0311]
颗粒制备的替代方案
[0312]
颗粒是根据修改后的方案d制备的：
[0313]
将6ml的50mg/ml蛋白质溶液与2ml水不混溶组分覆盖以产生双相溶液。挥发性/非挥发性组分的性质和比例如下表所示。
[0314]
使用高剪切混合器形成预乳液，然后在20000psi(138mpa)的压力下通过流体动力剪切微流化装置。
[0315]
然后将颗粒冷冻干燥48小时，然后再次重新悬浮在水中。根据此方案d可以制备以下颗粒：
[0316][0317]
根据实施例21产生的颗粒通过透皮给药施用至小鼠，如上面的实施例o1至o4所述。治疗条件为:
[0318]
组标签组大小给药1颗粒us压力cmv-luc pdnaus处理时间a54us实施例211.7mpa90ug cmv-luc2minb54us实施例211.2mpa90ug cmv-luc2minc54us实施例210.8mpa90ug cmv-luc2mind54id无 90ug cmv-luc [0319]
图19显示了在递送编码荧光素酶的dna后观察到的发光。这些颗粒在所有压力下
都能可靠地递送，其中1.2mpa和1.7mpa是最佳压力。
[0320]
定量蛋白质递送量
[0321]
进行实验以确定向小鼠透皮施用颗粒后递送的bsa量。将已冷冻干燥并重悬的实施例20的颗粒或实施例21的颗粒在如下指定的不同条件下施用于小鼠颈背。
[0322]
所有样品均在milliq中提供。所有涂在皮肤上的溶液均含有90mg bsa(1.8ml 50mg/ml溶液)。编码荧光素酶的dna按指示共同给药。在指定的暴露时间和指定的压力下，将颗粒/dna直接施用于每只小鼠，并使用前述“超声方法方案2”中描述的方法应用超声。
[0323][0324][0325]
治疗后2分钟或24小时在皮肤中检测到bsa。前述a6至e6组的结果如图20所示。根据实施例20(ex 20)和实施例21(ex 21)的颗粒向皮肤递送相似量的蛋白质。收获经处理的皮肤。将皮肤样品切成小块，并将荧光素酶细胞培养裂解5x试剂(promega)添加到皮肤样品中至200pl/25mg皮肤的浓度。样品经历冻融循环，然后在c管(miltenyi biotec)中用gentlemacs解离器(miltenyi biotec,德国)均质化。然后使用牛血清白蛋白(bsa)elisa试剂盒(abbexa，美国)对bsa的量进行定量。
[0326]
24小时后蛋白质没有明显清除。
[0327]
进一步空化剂的颗粒合成
[0328]
超声响应的凹痕颗粒，由一系列免疫调节和非免疫调节蛋白合成，根据方案d的修改版本制备如下:
[0329]
将6ml浓度如下所示的蛋白质溶液用2ml 50/50的己烷/环己烷混合物覆盖，形成双相溶液。
[0330]
采用高剪切混合器形成预乳液，然后在20000psi(138mpa)的压力下通过流体动力剪切微流控器装置。
[0331]
然后将颗粒冷冻干燥48小时，然后再次悬浮在水中。
[0332]
制备了以下颗粒:
[0333]
实施例编号合成方案蛋白质浓度31d胃蛋白酶15mg/ml32d木瓜蛋白酶20mg/ml33d血红蛋白20mg/ml34d透明质酸酶10mg/ml35d球蛋白20mg/ml36d溶菌酶25mg/ml37d胰岛素15mg/ml38d胰蛋白酶50mg/ml
39d伴刀豆球蛋白a5mg/ml
[0334]
对于上述例31至39的实施例，体外证明了惯性空化现象。颗粒在1.4mpa峰值压力下暴露30秒，通过pcd检测空化能(图21)。

技术特征：
1.用于在暴露于超声时诱导空化的多肽颗粒，其中所述颗粒包含：-核，其包含一种或多种治疗剂或诊断剂，以及任选的水不混溶液体；和-多肽壳；其中所述颗粒具有一个或多个表面凹痕。2.根据权利要求1所述的多肽颗粒，其中所述多肽壳包含交联的多肽颗粒。3.根据权利要求1或2所述的多肽颗粒，其中所述多肽壳包含一种或多种非免疫调节多肽，优选地，所述多肽壳包含至少95重量％的非免疫调节多肽，更优选地，其中所述多肽壳是人血清白蛋白壳。4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽颗粒，其中所述颗粒的粒度为100nm至1000nm，优选200nm至700nm。5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽颗粒，其中至少一个表面凹痕的横截面形成圆锥截面；和/或其中至少一个表面凹痕的深度为至少10nm；和/或其中所述颗粒包含一或两个凹痕，其开口尺寸为粒度的20％或更大。6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽颗粒，其中，当所述颗粒悬浮于水中并受到1.2mpa和265khz的超声时能够产生惯性空化，优选地，当所述颗粒悬浮于水中并受到1mpa和500khz的超声时能够产生惯性空化，更优选地，颗粒尺寸为450nm或更小，并且当所述颗粒悬浮于水中并受到1.5mpa和500khz的超声时能够产生惯性空化。7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽颗粒，其中所述颗粒具有包含一种或多种治疗剂的核，所述治疗剂选自小分子药物，包括化疗剂、抗血栓药物、抗炎药物、类固醇、心血管药物和用于治疗癌症、皮肤疾病、脑部疾病或病症的治疗剂，以及用于疼痛管理的治疗剂。8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽颗粒，其中所述核是水不混溶液体核，其包含水不混溶液体和一种或多种治疗剂或诊断剂。9.组合物，其包含一种或多种如前述权利要求中任一项所述的多肽颗粒以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。10.制备如权利要求1至8中任一项所述的多肽颗粒的方法，包括：-提供水不混溶相，其包含一种或多种挥发性组分、一种或多种治疗剂或诊断剂、以及任选的一种或多种非挥发性组分，任选地，其中水不混溶相中挥发性组分与非挥发性组分的比例为1:20至20:1；-将所述水不混溶相与至少一种包含至少两个半胱氨酸残基的多肽的水溶液混合；-交联半胱氨酸残基以产生具有包含水不混溶相的核和包含至少一种多肽的壳的颗粒；以及-通过使所述颗粒处于减压条件下以从核中去除挥发性组分，从而在颗粒中产生一个或多个凹痕；以及任选地，-纯化颗粒。11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括：-干燥所述颗粒；和-任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中；并且其中所述方法还可以进一步包括：-冻干所述颗粒；和
‑
任选地将颗粒重新悬浮在液体介质中；其中优选地，在干燥颗粒并将颗粒重新悬浮在液体介质中之后进行冻干和任选的重新悬浮。12.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽颗粒或根据权利要求9所述的组合物，用于诊断或治疗方法，优选地，其中所述方法包括施用所述多肽颗粒或组合物、施加超声和诱导惯性空化；任选地，其中多肽颗粒或组合物通过肠胃外或透皮给药来施用。13.根据权利要求12所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中超声以100至3000khz的频率和0.5至7.0mpa的峰值负压递送；优选地，其中(a)透皮施用多肽颗粒或组合物并且以100至500khz的频率和0.5mpa至2.0mpa的峰值负压递送超声；或者(b)通过肠胃外注射施用多肽颗粒或组合物并以200至3000khz的频率和1.0mpa至7.0mpa的峰值负压递送超声。14.根据权利要求12或13任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，其中所述方法用于将治疗剂或诊断剂递送至体内靶位点，优选地其中所述多肽颗粒或组合物用于将治疗剂或诊断剂递送到肿瘤、心脏、大脑或皮肤。15.根据权利要求12至14中任一项所述的多肽颗粒或组合物的用途，用于治疗或预防肿瘤、心血管疾病、感染或神经疾病或病症。16.根据权利要求12至14中任一项使用的多肽颗粒或组合物的用途，用于治疗或预防皮肤疾病或病症。

技术总结
本发明描述了具有包含一种或多种治疗剂或诊断剂的核和多肽壳的超声响应颗粒。颗粒的表面有一个或多个凹痕，所述凹痕通常能够捕获气泡。所述颗粒在暴露于超声时能够产生惯性空化。颗粒的惯性空化特性可用于增强治疗剂或诊断剂向体内靶位点的递送。断剂向体内靶位点的递送。断剂向体内靶位点的递送。


技术研发人员：布莱恩
受保护的技术使用者：牛津大学创新有限公司
技术研发日：2022.01.31
技术公布日：2023/9/9