D-甘露糖异构酶及D-果糖的制造方法

d-甘露糖异构酶及d-果糖的制造方法
技术领域
1.本发明涉及膜结合型d-甘露糖异构酶(膜结合型d-mannose isomerase)、由d-甘露糖制造d-果糖(果糖)的方法。


背景技术：

2.作为魔芋的主要成分的魔芋甘露聚糖(konjak mannan)是d-甘露糖和d-葡萄糖进行β-1,4-糖苷键合而成的多糖，由于难以消化，因此过去被限定于食用魔芋制造。在这种情况下，本技术的发明人对魔芋的用途赋予附加价值，以魔芋的进一步有效利用为目标进行了研究。而且，公开了由魔芋制造魔芋曲的方法、使用该魔芋曲对魔芋多糖类进行完全水解的技术(参见专利文献1)。利用该魔芋曲实现了将魔芋转变为碳水化合物资源，从而有助于提高日本食物自给率的期待正在升高。另外，该魔芋水解物有望用作食物。
3.对于上述魔芋水解物中包含的d-甘露糖，(1)已知由于其与半乳糖几乎相同程度地被体内的糖酵解系统摄入并消耗，因此作为健康食品来利用；此外，(2)作为肿瘤生长抑制剂的应用(参见非专利文献1)是已知的。
4.另外，在商业上食品、饮料中广泛使用果糖作为甜味剂。通常，该果糖通过对由玉米得到的葡萄糖进行异构化的方法来制造。另一方面，果糖也能够通过对d-甘露糖进行异构化来生成。目前为止，已知有几种包含d-甘露糖在内的糖类的异构酶(isomerase)(参见非专利文献2～4)，但这些均源自细胞质。另外，由于源自细胞质，因此为了进行酶反应，需要将细胞破碎并从细胞提取。而且，糖通常不耐碱，于中性以上的ph会生成着色物质等副产物。因此，例如虽然也进行了对最适反应ph(以下也称为“最适ph”)为4～6的葡萄糖异构酶的探索，但未有发现，而且，曾一直认为从反应机理考虑，可能不存在这样的酶(参见非专利文献5、6)。另外，虽然也可将d-甘露糖化学氧化而得到d-甘露醇、由该d-甘露醇生成果糖，但反应成为2个阶段，存在反应路径复杂化和收率降低的疑虑。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2020-146020号公报
8.非专利文献
9.非专利文献1：pablo sierra gonzalez等，nature,volume 563,pages 719-723(2018),doi:10.1038/s41586-018-0729-3
10.非专利文献2：takasaki等，agr.biol.chem.,vol.28,no.9.601-604(1964)
11.非专利文献3：takasaki等，agr.biol.chem.,vol.28,no.9.605-609(1964)
12.非专利文献4：hirose等，biosci.biotechnol.biochem.,65(3),658-661(2001)
13.非专利文献5：高崎义幸日本农艺化学会志vol.71,no.6,621-624(1997)
14.非专利文献6：高崎义幸日本食品化学工学会志vol.48,no.2,150-156(2001)


技术实现要素：

15.发明所要解决的课题
16.本发明的课题在于提供在酸性域具有最适ph并且为膜结合型的d-甘露糖异构酶。
17.用于解决课题的手段
18.本技术的发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，其中，着眼于在食醋的制造等中使用的醋酸菌(acetic acid bacteria)，从该醋酸菌的细胞膜组分发现d-甘露糖异构酶，从而完成了本发明。
19.即，本发明如下。
20.〔1〕源自醋酸菌的膜结合型d-甘露糖异构酶。
21.〔2〕如上述〔1〕记载的膜结合型d-甘露糖异构酶，其具有以下(a)～(c)的性质：
22.(a)作用于d-甘露糖而生成d-果糖；
23.(b)在50℃的反应条件下，最适反应ph为5.0～6.5；
24.(c)在ph6.0、30分钟的反应条件下，最适反应温度为40～65℃。
25.〔3〕如上述〔1〕或〔2〕记载的膜结合型d-甘露糖异构酶，其特征在于，醋酸菌是属于醋杆菌属(acetobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、或葡糖酸醋杆菌属(gluconacetobacter)的醋酸菌。
26.〔4〕固定化酶，其特征在于，在载体上固定有上述〔1〕～〔3〕中任一项记载的膜结合型d-甘露糖异构酶。
27.〔5〕膜结合型d-甘露糖异构酶的制造方法，其特征在于，具备下述工序：在营养培养基中培养醋酸菌的工序；接下来，得到菌体、或者由所得到的菌体制备细胞膜组分的工序。
28.〔6〕d-果糖的制造方法，其特征在于，使上述〔1〕～〔3〕中任一项记载的d-甘露糖异构酶或上述〔4〕记载的固定化酶作用于含有d-甘露糖的溶液。
29.发明效果
30.本发明的膜结合型d-甘露糖异构酶是结合于细胞膜的酶，并且在酸性域具有最适ph，因此能够稳定地、且抑制产生着色为褐色的副产物而生成果糖。另外，通过将本发明的膜结合型d-甘露糖异构酶作为固定化催化剂使用，从而能够容易地提取或者回收作为异构化反应后的反应产物的果糖。而且，由于上述酶源自醋酸菌，因此能够安心地将作为反应产物的果糖用于食品。
附图说明
31.[图1]为示出实施例1中将d-甘露糖作为底物与细胞、细胞膜组分、细胞质组分、或来自细胞膜组分的可溶化酶反应，对相关的各反应液进行tlc分析的结果的图。
[0032]
[图2]为示出实施例4中纯化的d-甘露糖异构酶的基于sds-page的分子质量的测定结果的图。
[0033]
[图3]为示出实施例4中纯化的d-甘露糖异构酶的基于凝胶过滤的分子质量的测定结果的图。
[0034]
[图4]为示出实施例5中研究最适ph的结果的图。
[0035]
[图5]为示出实施例6中研究最适反应温度(以下也称为“最适温度”)的结果的图。
[0036]
[图6]为示出实施例7中研究底物特异性的结果(底物：c5糖类)的图。
[0037]
[图7]为示出实施例7中研究底物特异性的结果(底物：c6糖类)的图。
[0038]
[图8]为实施例10中得到的固定化细胞的照片。
具体实施方式
[0039]
本发明的膜结合型d-甘露糖异构酶是源自醋酸菌的膜结合型d-甘露糖异构酶(ec5.3.1.7)，以下也称为“本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶”。本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶是可逆地催化由d-甘露糖向果糖的异构化反应的酶。另外，作为本发明的固定化酶，只要是特征在于在载体上固定有本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶的固定化酶，则没有特别限制，以下也称为“本技术的固定化酶”。并且，作为本发明的膜结合型d-甘露糖异构酶的制造方法，只要是具备：在营养培养基中培养醋酸菌的工序；接下来，得到菌体、或者由所得到的菌体制备细胞膜组分的工序的方法，则没有特别限制，以下也称为“本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶的制造方法”。另外，作为本发明的d-果糖(果糖)的制造方法，只要是使本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶或本技术的固定化酶作用于含有d-甘露糖的溶液来制造果糖的方法，则没有特别限制，以下也称为“本技术的果糖的制造方法”。
[0040]
(膜结合型d-甘露糖异构酶)
[0041]
本说明书中的“膜结合型”是指结合于细胞膜。另外，“源自醋酸菌的膜结合型d-甘露糖异构酶”是指结合于醋酸菌的细胞膜的、或者由醋酸菌的细胞膜分离或纯化而来的d-甘露糖异构酶。由于是膜结合型酶，因此即使不破坏醋酸菌，也能够使醋酸菌自身、或由醋酸菌得到的膜组分作用于d-甘露糖而生成果糖。并且，由于是膜结合型酶，因此能够维持长期稳定的酶活性。
[0042]
在50℃的反应条件下，本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶的最适ph为ph5.0～6.5，优选为ph5.5～6.0，更优选为ph6.0。需要说明的是，以往方法的葡萄糖的异构化中，使用在碱性域具有活性的异构酶，但若ph大于8.0，则由于美拉德反应等而生成褐色的副产物。因此，根据作为目标的产品而需要除去褐色的副产物。另一方面，若使用本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶，则不必担心生成上述褐色的副产物，不需要除去该副产物的工序。
[0043]
而且，如上述非专利文献5所述，以前在酸性域进行糖化，然后为了使葡萄糖的异构化适合于异构酶的最适ph而在来自玉米的异构糖的制造中于碱性域进行反应。若像这样根据反应工序来改变ph，则每当中和操作时会在糖液中生成盐，因此需要通过使用离子交换树脂的方法、利用活性炭的方法等除去盐的工序。另一方面，若使用本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶，则在酸性域进行糖化，能够直接在几乎不改变ph的情况下进行异构化反应，因此能够减少盐的生成。
[0044]
在ph6.0、30分钟的反应条件下，本技术的d-甘露糖异构酶的最适温度为35～65℃，优选为40～60℃，更优选为45～55℃。
[0045]
本技术的d-甘露糖异构酶是基于sds-page分析及凝胶过滤测定的、由约45kda的相同的4个亚基构成的酶。
[0046]
作为本说明书中的醋酸菌，可以举出属于醋杆菌属(acetobacter)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、葡糖酸醋杆菌属(gluconacetobacter)、酸单胞菌属(acidomonas)、亚细亚菌属(asaia)、柯扎克氏菌属(kozakia)、saccharibacter属、granulibacter属、驹形杆菌
属(komagataeibacter)、endobacter属、bombella属的醋酸菌，优选属于醋杆菌属、葡糖杆菌属、或葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌。
[0047]
作为属于醋杆菌属的醋酸菌，例如可以举出巴氏醋杆菌(acetobacter pasteurianus)、醋化醋杆菌(acetobacter aceti)、acetobacter altoacetigenes等。
[0048]
作为属于葡糖杆菌属的醋酸菌，可以举出泰国葡糖杆菌(gluconobacter thailandicus)、氧化葡糖杆菌(gluconobacter oxydans)、gluconobacter sphaericus、蜡状葡糖杆菌(gluconobacter cerinus)、弗托氏葡糖杆菌(gluconobacter frateurii)、浅井氏葡糖杆菌(gluconobacter asaii)等。
[0049]
作为属于葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌，可以举出中间葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter intermedius)、木葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter xylinus)、gluconacetobacter europaeus、固氮葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter diazotrophicus)、gluconacetobacter entanii、液化葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacter liquefaciens)等。
[0050]
(固定化酶)
[0051]
本发明的膜结合型d-甘露糖异构酶也可以固定化于载体而成为固定化酶。作为用于固定化的载体，只要是用于微生物、酶的固定化的载体，则均能够使用，例如可以举出海藻酸、k-卡拉胶、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、琼脂糖等多糖类、硅藻土(celite)、硅藻土(diatomaceous earth)、高岭石、硅胶、分子筛、多孔玻璃、活性炭、碳酸钙、陶瓷等无机载体、陶瓷粉末、聚乙烯醇、聚丙烯、丙烯酰胺、离子交换树脂、疏水吸附树脂、螯合树脂、合成吸附树脂等有机高分子、活性炭等，也可以将它们组合使用。作为微生物(细胞)、酶等向前述载体的固定化的方法，可以举出凝胶固定化法、吸附法、离子键合法、共价键合法、生物化学特异性键合法等已知的方法。另外，作为上述载体的形状，可以举出凝胶状、粉体状、纤维状等。
[0052]
本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶是膜结合的，因此可以直接将醋酸菌的培养细胞作为d-甘露糖异构酶使用，也可以根据需要使用由醋酸菌制备的膜组分。而且，也可以使用从醋酸菌的细胞膜使膜结合型d-甘露糖异构酶可溶化而得的物质、将可溶化的膜结合型d-甘露糖异构酶进一步纯化后的物质。得到膜组分的方法、从细胞膜进行可溶化的方法、纯化可溶化的酶的方法见后述。需要说明的是，本说明书中，有时也将将醋酸菌自身作为本发明的膜结合型d-甘露糖异构酶固定化于上述载体的固定化酶称为“固定化细胞”。
[0053]
(膜结合型d-甘露糖异构酶的制造方法)
[0054]
本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶的制造方法中，通过得到菌体、或者由菌体制备细胞膜组分，能够制造膜结合型d-甘露糖异构酶。如上所述，本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶结合于细胞膜，因此能够在不破碎细胞的情况下，使菌体自身、细胞膜组分作为膜结合型d-甘露糖异构酶作用于作为底物的d-甘露糖。作为得到菌体的方法，例如可以举出离心分离、过滤。
[0055]
作为培养醋酸菌的营养培养基，可使用能够培养醋酸菌的已知的培养基。例如可以举出在酵母抽提物及蛋白胨中加入葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类、乙醇、正丙醇、正丁醇等醇、甘油、葡萄糖酸钠等的培养基。培养可在振荡培养等好氧条件下通过液体培养来进行。而且，也可进行曝气(通气)。集菌可通过对菌体进行过滤或离心分离等进行。另外，作为培
养醋酸菌的条件，例如可以举出25～35℃、36～48小时。
[0056]
作为得到醋酸菌的细胞膜组分的方法，可使用已知的手法。例如可以举出下述方法：将细胞用规定的缓冲液悬浮，使用弗氏压碎器、研磨珠均质器、超声波破碎机或玻璃珠等进行物理破碎，通过以4000rpm进行离心分离并回收上清液来除去未破碎细胞。接下来，通过将得到的上清液以40000rpm进行超速离心分离并回收上清液来除去细胞质组分，得到沉淀作为细胞膜组分。
[0057]
而且，本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶也可以由细胞膜进行可溶化来使用。作为可溶化的方法，可使用已知的手法，例如可以举出通过将由菌体的破碎物或者菌体制备的细胞膜组分利用非离子性表面活性剂处理、超声波处理、乙二胺四乙酸(edta)、kcl等化学处理等以从细胞膜分离而可溶化的方法。另外，可溶化的酶也可以通过离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等色谱法、离心分离等进行纯化。
[0058]
(果糖的制造方法)
[0059]
作为本技术的果糖的制造方法，只要使本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶或本技术的固定化酶作用于含有作为底物的d-甘露糖的溶液即可，作为含有d-甘露糖的溶液，可以使用ph5.0～6.5的缓冲液。对于溶液的种类、反应时间、反应温度等反应条件而言，可通过预先使用纸色谱法等确认果糖的生成量来适当选择最适的条件。例如，将制备成10～20mg/ml的膜浓度的细胞膜组分在ph5.0～6.5的乙酸缓冲液(10～100mm)中加入d-甘露糖，以数小时～二晚、40～65℃的条件进行静置反应或缓慢搅拌反应、例如以50～80rpm搅拌，能够制造果糖。
[0060]
需要说明的是，也可以利用柱色谱法等从所得到的反应液分离d-甘露糖和果糖，通过该方法能够使果糖的浓度上升。另外，也可以在上述中从反应液分离果糖，将残留的未反应的d-甘露糖再次作为底物用于上述本技术的果糖的制造方法来制造果糖。
[0061]
以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围不限定于这些例示。
[0062]
[实施例1]d-甘露糖异构酶的局部存在
[0063]
已知以往的糖质异构酶局部存在于细胞质。因此，研究了醋酸菌的d-甘露糖异构酶的局部存在。使用细胞、细胞膜组分、细胞质组分、来自细胞膜组分的可溶化酶作为酶。
[0064]“细胞”的制备如下。在含有2％葡萄糖酸钠、0.5％葡萄糖、0.3％酵母抽提物、0.2％蛋白胨、0.3％甘油的培养基中培养(约36～40小时)醋酸菌(泰国葡糖杆菌nbrc 3257)至稳定期为止。通过将得到的培养液(klett光度计、350～400)离心分离并集菌，用0.01m乙酸缓冲液(ph 6.0)清洗，进一步用0.01m乙酸缓冲液(ph6.0)悬浮，从而得到“细胞”。
[0065]“细胞膜组分”的制备如下。首先，使上述细胞通过弗氏加压细胞破碎机(amicon公司)来破坏细胞，通过以4000rpm离心分离10分钟左右，分离为未破碎的细胞(沉淀)和破碎的细胞膜碎片及细胞质(上清液)，回收上清液，从而除去未破碎的细胞。接下来，通过以40000rpm超速离心分离60分钟左右，分离为细胞膜组分(沉淀)和细胞质组分(上清液)，除去上清液，从而除去细胞质。然后，通过使沉淀悬浮于0.01m乙酸缓冲液(ph6.0)，进行均质化，调节为30mg/ml，从而得到细胞膜组分。
[0066]
作为“细胞质组分”，使用上述超速离心分离后除去的上清液。
[0067]“来自细胞膜组分的可溶化酶”的制备如下。首先，在上述细胞膜组分(30mg/ml)中
加入1.0％(v/v)的表面活性剂mydol 10(花王公司)，于4℃缓慢搅拌一晚。然后，通过以40000rpm超速离心分离60分钟左右，分离为可溶化酶组分(上清液)和细胞膜残渣组分(沉淀)，回收上清液，从而得到来自细胞膜组分的可溶化酶。
[0068]
将0.5m d-甘露糖作为底物，使细胞、细胞膜组分、细胞质组分、或来自细胞膜组分的可溶化酶在0.1m乙酸缓冲液(ph6.0)溶液中，于室温(20～25℃)分别反应18小时。然后，对反应后的溶液进行薄层色谱法(tlc)分析。显色使用氯化三苯基四氮唑。结果示于图1。图1中，f泳道为标准果糖、1泳道为细胞与d-甘露糖的反应液、2泳道为细胞膜组分与d-甘露糖的反应液、3泳道为细胞质组分与d-甘露糖的反应液、4泳道为来自细胞膜组分的可溶化酶与d-甘露糖的反应液。如图1所示，细胞、细胞膜组分及来自细胞膜组分的可溶化酶有果糖生成，但细胞质组分没有果糖生成。因此，确认到本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶是细胞膜结合型、即结合于细胞膜并且在细胞的周质空间中发挥功能的酶。以往已知的源自细菌的异构酶无一例外地存在于细胞质，因此需要破坏细胞，但本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶是膜结合型的d-甘露糖异构酶，因此能够在不破坏细胞的情况下作为酶来利用。
[0069]
[实施例2]d-甘露糖异构酶的生成
[0070]
接下来，使用包含4种糖类的培养基对是否存在诱导生成膜结合型d-甘露糖异构酶的底物进行研究。
[0071]
利用以下表1中记载的培养基1～4培养醋酸菌(泰国葡糖杆菌nbrc 3257)45小时。培养后，测定培养基的ph，以8000rpm、10分钟的离心分离进行集菌，用0.01m乙酸缓冲液(ph6.0)清洗，使其通过弗氏加压细胞破碎机(amicon公司)来破坏细胞，通过与实施例1相同的方法制备细胞膜组分。
[0072]
[表1]
[0073]
培养基10.5％葡萄糖、2.0％葡萄糖酸钠、0.3％酵母抽提物、0.2％蛋白胨培养基21％甘露糖、0.3％酵母抽提物、0.2％蛋白胨培养基31％果糖、0.3％酵母抽提物、0.2％蛋白胨培养基41％山梨糖醇、0.3％酵母抽提物、0.2％蛋白胨
[0074]
使该细胞膜组分的一部分(5mg/ml)与包含d-甘露糖(最终浓度0.1m)的0.1m乙酸缓冲液(ph6.0)5ml于室温以50rpm缓慢地反应3小时左右。
[0075]
对于酶活性而言，通过使用最适合果糖微量定量的、利用ameyama等人的方法(ameyama等人，j.bacteriol，145，814-23，1981)得到的果糖脱氢酶(fdh)对作为酶反应产物的果糖进行定量来评价。首先，用三氯乙酸处理细胞膜组分与d-甘露糖的反应液，沉淀除去蛋白质，在上清液50μl中加入0.5ml乙酸缓冲液(ph4.5)、1个单位的果糖脱氢酶(fdh)，使总量为0.9ml，加入0.1ml的0.1m铁氰化钾，开始反应。反应后，通过添加0.5ml dupanol试剂来停止反应，加入3.5ml水后，在20分钟后于660nm测定吸光度。在该条件下，相当于吸光度4.0＝1μmol f(＝180μg：其中，f表示果糖)。将每单位时间催化生成1μmol果糖的酶量设为1个单位。
[0076]
上述培养45小时后的利用klett光度计测定的培养基的浊度、培养基的ph，以及使用细胞膜组分5mg与d-甘露糖反应后、利用fdh测定的反应液的660nm的吸光度示于表2。
[0077]
[表2]
[0078] 浊度phe660nm/5mg细胞膜组分
培养基13624.40.429(＝2.14μmolf)培养基2824.60.255(＝1.27μmolf)培养基34954.60.408(＝2.04μmolf)培养基45504.80.426(＝2.13μmolf)
[0079]
由表2的结果可知，使用含有葡萄糖、甘露糖、果糖、山梨糖醇中的任一种作为碳源的培养基，均以相同水平观测到了d-甘露糖异构酶活性。因此，本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶不是通过特定的底物诱导生成，而是只要醋酸菌能够生长、则普遍地在醋酸菌的细胞膜上生成。基于这一点，本技术的膜结合型d-甘露糖异构酶区别于需要特别的诱导底物的以往的戊糖(木糖)异构酶(j.patrick&n.lee，methods in enzymol.，41，453-458(1975)、k.yamanaka，methods in enzymol.，41，459-461(1975).、k.yamanaka&k.izumori，methods in enzymol.，41，462-465(1975).、k.yamanaka，methods in enzymol.，41，466-471(1975))。
[0080]
[实施例3]醋酸菌中的d-甘露糖异构酶活性的分布
[0081]
实施例1及2中使用泰国葡糖杆菌nbrc 3257作为醋酸菌，此处对在其它醋酸菌中的d-甘露糖异构酶活性的分布进行研究。
[0082]
对在由2％山梨糖醇、0.3％酵母抽提物构成的培养基中培养至稳定期为止的培养液于600nm测定吸光度，以吸光度值成为0.7的方式用水稀释来制备细胞。在该细胞0.5ml中加入0.1ml的0.5m甘露糖、0.4ml的0.2m乙酸缓冲液(ph6.0)来制备反应液，使其反应。使用3个单位的fdh，通过与实施例2相同的方法使该反应液10μl反应，于660nm测定吸光度。表3示出表示所使用的菌种的生长度的培养后的600nm的吸光度测定结果、及反应后的660nm的吸光度测定结果。
[0083]
[表3]
[0084]
醋酸菌生长e600nmfdh，660nm氧化葡糖杆菌nbrc 32723.350.181泰国葡糖杆菌nbrc 32572.540.205氧化葡糖杆菌nbrc 32923.370.152弗托氏葡糖杆菌nbrc 32852.520.181弗托氏葡糖杆菌nbrc 32863.020.154弗托氏葡糖杆菌nbrc 32713.650.164氧化葡糖杆菌nbrc 32942.880.194氧化葡糖杆菌nbrc 32933.010.251氧化葡糖杆菌nbrc 125282.950.488泰国葡糖杆菌nbrc 32544.350.202泰国葡糖杆菌nbrc 32552.880.225泰国葡糖杆菌nbrc 32562.940.326巴氏醋杆菌sku 11082.340.227罗旺醋杆菌nbrc 32842.740.15巴氏醋杆菌nbrc 32833.150.125弗托氏葡糖杆菌chm 11.420.991
弗托氏葡糖杆菌chm 81.810.764弗托氏葡糖杆菌chm 434.750.097泰国葡糖杆菌nbrc 32573.120.231液化葡糖酸醋杆菌nbrc 1132623.110.181氧化葡糖杆菌nbrc 32442.480.175泰国葡糖杆菌nbrc 32585.590.215
[0085]
由表3的结果可知，在调查的葡糖杆菌属、醋杆菌属、及葡糖酸醋杆菌属醋酸菌中的任一种中均观测到了d-甘露糖异构酶活性。因此，明确了在醋酸菌的广泛的属中，d-甘露糖异构酶局部存在于细胞膜。
[0086]
[实施例4]d-甘露糖异构酶的纯化
[0087]
通过实施例1中记载的方法培养泰国葡糖杆菌nbrc 3257，从细胞膜将d-甘露糖异构酶可溶化后，将可溶化酶放入透析膜中，使其浸没于砂糖粉中进行浓缩。通过放置一晚使水分、盐分转移至透析膜外。将其用2mm磷酸缓冲液(ph 6.0)及0.1％mydol 10透析(3l、3次)。透析后，对不溶性物质进行离心分离，将除去的上清液加入用2mm磷酸缓冲液(ph6.0)及0.1％ mydol 10平衡化的deae-纤维素色谱柱(2.5
×
20cm)，吸附d-甘露糖异构酶。用相同的缓冲液清洗色谱柱后，用加入0.3m kcl的相同缓冲液从色谱柱洗脱d-甘露糖异构酶。对洗脱的d-甘露糖异构酶进行与上述相同的操作(用砂糖粉浓缩)，得到酶液。使该酶液吸附于用1mm磷酸缓冲液(ph6.0)及0.1％ mydol 10平衡化的羟基磷灰石色谱柱(3
×
5cm)。所包含的杂质大多直接通过色谱柱。在磷酸浓度0.1m的磷酸缓冲液中加入1％ mydol 10，从色谱柱洗脱d-甘露糖异构酶。向其中加入65％饱和(430g硫酸铵/l)硫酸铵，利用离心机以沉淀的形式收集d-甘露糖异构酶。溶解于少量的2mm磷酸缓冲液(ph 6.0)及0.1％mydol 10，通过用相同的缓冲液平衡化的sephadex g-200色谱柱(1
×
125cm)进行色谱分离。通过该纯化工序，d-甘露糖异构酶几乎完全被纯化。
[0088]
纯化的d-甘露糖异构酶的基于sds-page的分子质量的测定结果示于图2。d-甘露糖异构酶在分子质量45kda处显示染色条带。
[0089]
接下来，通过凝胶过滤利用以下方法求出d-甘露糖异构酶的分子质量。首先，将填充有作为凝胶过滤剂的sephadex g-200的玻璃色谱柱(1.2
×
120cm)用包含0.1％ mydol 10的10mm乙酸缓冲液(ph6.0)平衡化。接下来，与纯化的d-甘露糖异构酶一起，加入包含过氧化氢酶(230kda)、nadp-gdh(150kda)、血清白蛋白的二聚体(bsa-二聚体：130kda)、及蓝色葡聚糖(2mda)作为标准物质的试样液(0.3ml)，以每150滴(约1.8ml)进行等分。其结果为，蓝色葡聚糖于第23根、过氧化氢酶于第28根、纯化的d-甘露糖异构酶于第31根、nadp-gdh于第36根、血清白蛋白的二聚体(bsa-二聚体)于第38根从色谱柱洗脱。将蓝色葡聚糖的洗脱位置设为vo，根据各标准蛋白的洗脱位置(ve)求出ve/vo。将ve/vo设为纵轴、将各标准物质的分子质量的对数设为横轴时，几乎排列在直线上(图3)。基于图3的图，纯化的d-甘露糖异构酶的ve/vo为1.45，因此其分子质量估算为180～190kda。
[0090]
虽然未测定细胞膜中的d-甘露糖异构酶的分子质量，但根据sds-page及凝胶过滤的结果，推定纯化的d-甘露糖异构酶是由45～46kda的相同的4个亚基构成、整体的分子质量由180～190kda形成的酶。需要说明的是，纯化酶的纯度也几乎为100％。
[0091]
[实施例5]d-甘露糖异构酶的最适ph
[0092]
对本技术的d-甘露糖异构酶的最适ph进行了研究。以0.1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(mcllvaine buffer：ph3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、0.05ml 0.5m甘露糖、实施例1中制备的20μl细胞膜组分或实施例4中制备的纯化酶、及水使总量为0.2ml，缓慢搅拌，于50℃进行反应。添加5μl 100％三氯乙酸并离心分离，使用上清液(例如50μl)，依照实施例2，通过660nm的吸光测定来研究果糖生成量。结果示于图4。图中，
●
为使用细胞膜组分的情况、
○
为使用纯化酶的情况。
[0093]
如图4所示，可知本技术的d-甘露糖异构酶的最适ph在细胞膜组分、纯化酶中均为5.0～6.5。糖质水溶液通常不耐碱性，碱性时会生成着色物质，因此不能说是适合制造异构糖的条件。若使用本技术的d-甘露糖异构酶制造异构糖，则能于ph5.0～6.5进行全程反应，因此能够抑制由反应副产物引起的着色生成。
[0094]
[实施例6]d-甘露糖异构酶的最适温度
[0095]
对本技术的d-甘露糖异构酶的最适温度进行了研究。以0.1m乙酸缓冲液(ph6.0)、0.05ml 0.5m甘露糖、实施例1中制备的20μl细胞膜组分或实施例4中制备的纯化酶、及水使总量为0.2ml，缓慢搅拌，于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、及75℃反应30分钟。添加5μl 100％三氯乙酸并离心分离，使用上清液(例如50μl)，依照实施例2，通过660nm的吸光测定来研究果糖生成量。结果示于图5。图中，
●
为使用细胞膜组分的情况、
◆
为使用纯化酶的情况。左侧纵轴为细胞膜组分情况的od660nm、右侧纵轴为纯化酶情况的od660nm。
[0096]
如图5所示，可知本技术的d-甘露糖异构酶的最适温度为40～60℃。另外，已知以往的糖质异构酶的最适ph为8.0～9.0，酶生成需要诱导底物、及0.5～1mm的锰等金属离子(j.patrick&n.lee,methods in enzymol.,41,453-458(1975)、k.yamanaka,methods in enzymol.,41,459-461(1975).、k.yamanaka&k.izumori,methods in enzymol.,41,462-465(1975).、k.yamanaka,methods in enzymol.,41,466-471(1975))，多为对于热而言不稳定的酶。与此相对，由图4、5的结果可知，本技术的d-甘露糖异构酶在酸性侧ph具有活性，在70℃也维持活性，并且也不需要锰等金属离子，因此具有能够在广泛条件下稳定地进行异构化反应的优点。
[0097]
[实施例7]d-甘露糖异构酶的底物特异性
[0098]
使用实施例4中制作的纯化酶研究本技术的d-甘露糖异构酶的底物特异性。使用作为c5糖类的d-木糖、d-阿拉伯糖、d-核酮糖、作为c6糖类的葡萄糖、甘露糖、半乳糖作为底物，与上述纯化酶反应，通过tlc研究异构化产物。需要说明的是，木糖进行异构化时生成木酮糖，阿拉伯糖进行异构化时生成核酮糖。另外，甘露糖进行异构化时生成果糖，半乳糖进行异构化时生成塔格糖。各tlc的结果示于图6、7。显色使用氯化三苯基四氮唑。
[0099]
首先，在图6的1～3泳道中，确认到本技术的d-甘露糖异构酶未生成木酮糖，未与木糖发生反应。另外，在图6的4～6泳道中，本技术的d-甘露糖异构酶即使与阿拉伯糖进行反应也未生成核酮糖，确认到其未与核酮糖发生反应。并且，在图6的泳道7、8中，本技术的d-甘露糖异构酶即使与核糖进行反应也未观察到相对于标准核糖的斑点变化，确认到其未与核糖发生反应。
[0100]
接下来，在图7的1～3泳道中，本技术的d-甘露糖异构酶即使与葡萄糖进行反应也未观察到相对于标准葡萄糖的斑点变化，确认到其未与葡萄糖发生反应。另外，在图7的3～
5泳道中，本技术的d-甘露糖异构酶与d-甘露糖进行反应而生成果糖，确认到其与d-甘露糖发生反应。并且，在图7的泳道6～8中，本技术的d-甘露糖异构酶即使与半乳糖进行反应也未生成塔格糖，确认到其未与半乳糖发生反应。需要说明的是，5泳道中的标准甘露糖基于所使用的氯化三苯基四氮唑显色不鲜明，因此在图7中未拍摄到斑点，但通过目视确认到淡影。
[0101]
根据图6、7的结果，确认到本技术的d-甘露糖异构酶针对d-甘露糖的底物特异性高。需要说明的是，图6、7中示出了使用实施例4中制作的纯化酶的结果，而对细胞膜组分进行同样的tlc分析时，在与纯化酶相同的位置观察到斑点(未图示)。
[0102]
[实施例8]反应平衡及km值
[0103]
反应平衡的检验使用0.2m乙酸缓冲液(ph6.0)进行。与实施例2同样地使用fdh对使用d-甘露糖作为底物、使用实施例1中记载的细胞膜组分进行异构化而得到的果糖进行定量。另外，通过使用nadp-依赖性且仅与葡萄糖和甘露糖发生反应的葡萄糖脱氢酶的方法(adachi等，agric.biol.chem.,44,301-308(1980))对使用果糖作为底物、使用上述酶进行异构化而得到的d-甘露糖进行定量。其结果为，从d-甘露糖向果糖的转换为75％、从果糖向d-甘露糖的转换为22～25％。另外，本技术的d-甘露糖异构酶无论是使用膜组分还是使用纯化酶，针对d-甘露糖的km值均为75mm。
[0104]
[实施例9]d-甘露糖与葡萄糖的混合液的反应
[0105]
本技术的发明人之前公开了对魔芋进行水解而得到以甘露糖和葡萄糖为主要糖分的魔芋水解液的方法(专利文献1)。将通过该方法得到的魔芋水解液(19％糖浓度10％甘露糖/9％葡萄糖(基于hplc分析))中包含的多酚性物质利用amberlite等离子交换树脂除去后的物质作为底物，使本技术的d-甘露糖异构酶在0.1m的乙酸缓冲液(ph6.0)中于50℃作用3天后，甘露糖以80％的转换率转换成果糖。根据该结果可知，即使葡萄糖以高浓度存在，本技术的d-甘露糖异构酶也能够将d-甘露糖异构化。另外，通过利用得到上述魔芋水解液的方法和本技术的d-甘露糖异构酶，能够将魔芋进一步应用于食品产业，具体而言，通过对魔芋进行水解而得到包含甘露糖和葡萄糖的糖液，然后将甘露糖异构化为果糖，从而能够制作果糖和葡萄糖的混合液。而且，本发明使用在食品中长年使用的醋酸菌，可以认为是安全性优异的糖液的制造方法。
[0106]
[实施例10]细胞的固定化和利用固定化细胞的甘露糖的异构
[0107]
为了在产业上利用本技术的d-甘露糖异构酶，尝试了固定化。将泰国葡糖杆菌nbrc 3257的细胞以成为约200mg/ml的方式悬浮于10mm乙酸缓冲液(ph6.0)。另外准备2％海藻酸钠(na-alginate)，以细胞悬浮液:海藻酸钠＝1:3的方式混合。使用蠕动泵将该混合溶液从细的喷嘴滴加至5％氯化钙溶液。一边搅拌一边将细胞固定至海藻酸钙凝胶中。在搅拌数小时后，将微珠移至10mm乙酸缓冲液(ph6.0)来除去氯化钙。10mm乙酸缓冲液(ph6.0)最少更换3次。得到的固定化细胞的照片示于图8。
[0108]
图8中，左侧为刚刚制备后的固定化细胞的照片，右侧为在减压下、在硅胶粒子上干燥2～3天而得的干燥固定化细胞的照片。另外，将干燥固定化细胞再次悬浮于适量的水中，使其与d-甘露糖反应后，确认到果糖的生成。因此，该固定化细胞在不使用时通过用加入硅胶的干燥器等进行保存，从而几乎不会丧失酶活性，能够使其作为具有活性的固定化细胞复活。
[0109]
[实施例11]使用固定化细胞的与d-甘露糖和葡萄糖的混合液的反应
[0110]
使用实施例10中得到的干燥固定化细胞，使其与d-甘露糖和葡萄糖的混合液反应，尝试果糖的制造。
[0111]
在密闭容器中加入实施例10中得到的干燥固定化细胞5mg，和(1)0.5m d-甘露糖、(2)0.5m d-甘露糖+0.5m葡萄糖、(3)0.5md-甘露糖+0.5m果糖，以总量成为3.5ml的方式用0.2m乙酸缓冲液(ph 5.0)调节，于50℃进行3天左右的反应。结果示于表4。
[0112]
[表4]
[0113][0114]
由表4的结果可知，所加入的d-甘露糖的约80％以上在2天以内转换为果糖，反应达到平衡。另外，以往已知的异构酶中，有由于存在葡萄糖等规定的糖、成为产物的糖而导致反应被抑制的酶是已知的。但是，根据表4的结果，确认到即使在反应液中除d-甘露糖以外还含有葡萄糖、作为产物的果糖，对于基于干燥固定化细胞的从d-甘露糖向果糖的转换也没有影响。另外，在反应第2天至第3天，果糖的量几乎没变，可以认为基于干燥固定化细胞的异构化反应结束。而且，即使在同时包含d-甘露糖和果糖的情况下，也会进行从d-甘露糖向果糖的转换，这表明可以从反应液纯化果糖，将残留液(包含少量果糖的液体)再次作为含有底物的溶液使用，使得果糖的生产效率提高。
[0115]
接下来，使用魔芋水解液代替d-甘露糖，使其与上述同样地与干燥固定化细胞反应。具体而言，在密闭容器中加入实施例9中得到的魔芋水解液(以糖的含量计，最终浓度为205mg/ml或150mg/ml)、和实施例10中得到的干燥固定化细胞5mg，以总量成为3.5ml的方式用0.2m乙酸缓冲液(ph 5.0)调节，于50℃进行3天左右的反应。结果示于表5。需要说明的是，在魔芋水解液中以约为1:1.5的比例包含葡萄糖和d-甘露糖。
[0116]
[表5]
[0117][0118]
由表5的结果可知，利用干燥固定化细胞，从魔芋水解液中包含的d-甘露糖也生成了果糖，在从反应开始起经过2天，向果糖的反应几乎达到平衡。
[0119]
产业上的可利用性
[0120]
由于能够使难以转变为富有营养的食用资源的魔芋成为与甘蔗、甜菜同等的碳水化合物资源，因此能够在制糖业、食品加工业、食品制造业中得到利用。

技术特征：
1.源自醋酸菌的膜结合型d-甘露糖异构酶。2.如权利要求1所述的膜结合型d-甘露糖异构酶，其具有以下(a)～(c)的性质：(a)作用于d-甘露糖而生成d-果糖；(b)在50℃的反应条件下，最适反应ph为5.0～6.5；(c)在ph6.0、30分钟的反应条件下，最适反应温度为40～65℃。3.如权利要求1或2所述的膜结合型d-甘露糖异构酶，其特征在于，醋酸菌是属于醋杆菌属、葡糖杆菌属、或葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌。4.固定化酶，其特征在于，在载体上固定有权利要求1～3中任一项所述的膜结合型d-甘露糖异构酶。5.膜结合型d-甘露糖异构酶的制造方法，其特征在于，具备下述工序：在营养培养基中培养醋酸菌的工序；接下来，得到菌体、或者由所得到的菌体制备细胞膜组分的工序。6.d-果糖的制造方法，其特征在于，使权利要求1～3中任一项所述的d-甘露糖异构酶或权利要求4所述的固定化酶作用于含有d-甘露糖的溶液。

技术总结
本发明的课题在于提供在酸性域具有最适反应pH并且为膜结合型的D-甘露糖异构酶。制造源自醋酸菌的膜结合型D-甘露糖异构酶。醋酸菌优选属于醋杆菌属、葡糖杆菌属、或葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌。另外，利用源自上述醋酸菌的膜结合型D-甘露糖异构酶由D-甘露糖制造果糖。甘露糖制造果糖。甘露糖制造果糖。


技术研发人员：足立收生 药师寿治 片冈尚也 松下一信
受保护的技术使用者：国立大学法人山口大学
技术研发日：2021.12.28
技术公布日：2023/9/9