再水合缓冲溶液和方法与流程

再水合缓冲溶液和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年12月31日提交的美国临时申请第63/132,482号的权益，该美国临时申请以全文引用的方式并入本文。


背景技术：

3.生物和医疗研究日益转向用于增强生物研究和医学的核酸测序。例如，生物学家和动物学家正转向用以研究动物迁移、物种进化和性状来源的测序。医学团体正使用测序来研究疾病的起因、对药品的敏感性和感染的起因。因此，测序在生物学、治疗学、诊断学、法医学和研究的许多方面都具有广泛适用性。
4.然而，测序的使用会受到测定可用性、测序运行时间、准备时间和成本的限制。另外，质量测序在历史上一直是一种昂贵的过程，因此限制了其实践。
5.特别地，试剂溶液的运输和储存是昂贵的。此外，试剂溶液的组成可影响靶核酸的扩增。
附图说明
6.通过参考附图，可以更好地理解本公开，并且本公开的许多特征和优点对于本领域的技术人员而言变得显而易见。
7.图1包括示出用于扩增核酸的示例方法的方框流程图。
8.图2包括示例性测序系统的图示。
9.图3包括示例性系统的图示，该系统包括传感器阵列。
10.图4包括示例性传感器和相关的孔的图示。
11.图5包括用于制备测序装置的示例性方法的图示。
12.在不同的附图中使用相同的附图标记指示类似或相同的项。
具体实施方式
13.在一个示例中，再水合缓冲液用于再水合核苷酸以形成核苷酸溶液。可向核苷酸溶液中加入其它组分以形成可用于进行扩增反应的扩增溶液。这种扩增溶液在扩增靶核苷酸以形成单克隆群体中特别有用。在一个示例中，此类单克隆群体可在基质上或微孔中形成。
14.在一个示例中，再水合缓冲溶液可以是包含2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(hepes)、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵(dmaps)和三(羟甲基)氨基甲烷(tris)的水性溶液。任选地，再水合缓冲溶液可包含聚乙二醇(peg)。在另一个示例中，它们的再水合缓冲溶液可以包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(tween)。再水合核苷酸之后，可以向核苷酸溶液中加入另外的溶液以形成扩增溶液。特别地，扩增溶液可以包含酶、引物和稳定剂。
[0015]
特别地，可用作再水合缓冲液或扩增溶液的试剂溶液是包含2-[4-(2-羟乙基)哌
嗪-1-基]乙磺酸、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵和三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液。当用作扩增溶液时，试剂溶液还可包含核苷酸、引物和酶。
[0016]
例如，试剂溶液可以包含1mm至200mm的量，诸如10mm至100mm或10mm至50mm的量的2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸。试剂溶液可包含1mm至200mm，例如10mm至150mm或10mm至100mm的量的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵。此外，试剂溶液可以包含1mm至100mm，诸如10mm至100mm或10mm至50mm的量的三(羟甲基)氨基甲烷。
[0017]
在另一个示例中，试剂溶液可以包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(tween)。例如，该聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯可以是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在一个示例中，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯0.001体积％至0.5体积％的量，诸如0.01体积％至0.5体积％或0.05体积％至0.25体积％的量被包含。
[0018]
在另一个示例中，试剂溶液可包含谷氨酸钾。例如，试剂溶液可以包含10mm至500mm的量的谷氨酸钾。例如，谷氨酸钾可以10mm至250mm，诸如50mm至250mm的量被包含。
[0019]
在另一个示例中，试剂溶液包含聚乙二醇。例如，试剂溶液可包含0.1体积％至7体积％的量的聚乙二醇。例如，聚乙二醇可以为0.5体积％至6.1体积％，诸如0.9体积％至4体积％的量被包含。聚乙二醇可具有在10k至50k的范围内，诸如在10k至40k的范围内或在15k至40k的范围内的分子量。在一个具体示例中，试剂溶液包含不同分子量的聚乙二醇。例如，试剂溶液可包含分子量在10k至200k范围内的第一聚乙二醇和分子量在30k至50k范围内的第二聚乙二醇。
[0020]
在另一个示例中，试剂溶液可以包含杀生物剂。例如，杀生物剂可包括甲基异噻唑啉酮或异噻唑啉酮。特别地，杀生物剂可以0.001体积％至0.1体积％的量被包含。
[0021]
在另一个示例中，试剂溶液可以包含乙酸。例如，试剂溶液可以包含1mm至100mm，诸如1mm至50mm的量的乙酸。
[0022]
在另一示例中，试剂溶液可以包含二硫苏糖醇。例如，试剂溶液可以包含0.1mm至20mm，诸如0.1mm至10mm或1mm至10mm的量的二硫苏糖醇。
[0023]
在另一个示例中，试剂溶液可以包含海藻糖。例如，试剂溶液可以包含0.15体积％至20体积％的量，诸如0.1体积％至10体积％的量或1体积％至10体积％的量的海藻糖。
[0024]
在另一个示例中，该溶液可以包含三磷酸腺苷。例如，试剂溶液可以包含0.1mm至50mm的量，诸如0.1mm至20mm或0.9mm至10mm的量的三磷酸腺苷。
[0025]
在另一个示例中，试剂溶液可以包含乙酸镁。例如，试剂溶液可以包含0.1mm至20mm的量的乙酸镁。
[0026]
任选地，试剂溶液还可以包含甲基纤维素。例如，试剂溶液可以包含0.01体积％至10体积％的量，诸如0.01体积％至5体积％或0.1体积％至2体积％的量的甲基纤维素。
[0027]
在另一个示例中，试剂溶液可以包含1mm至200mm，诸如10mm至150mm或10mm至100mm的量的磷酸肌酸。
[0028]
当形成扩增溶液时，试剂溶液可以包含核苷酸。例如，试剂溶液可以包含一定量的a、g、c和t核苷酸中的每一种或任选的通用或修饰的核苷酸。在一个示例中，核苷酸以0.1μm至100μm的量存在于试剂溶液中。在具体示例中，核苷酸以0.1μm至50μm，诸如0.5μm至100μm的量被包含。
[0029]
试剂溶液还可包含引物。例如，这种引物可以与靶核苷酸上的位置互补。在一个示
例中，引物是具有10至100个碱基的多核苷酸。任选地，引物可以包含接头部分。例如，引物可以与生物素、链霉亲和素、中性亲和素或亲和素等偶联。
[0030]
此外，试剂溶液可以包含酶。示例酶包括重组酶、聚合酶、焦磷酸酶、激酶或它们的任何组合。
[0031]
试剂溶液还可以包含稳定剂，诸如蛋白质稳定剂。
[0032]
在一个具体示例中，该试剂溶液还包含迁移抑制剂。示例迁移抑制剂包括增稠剂或捕获分子。
[0033]
这种试剂溶液在再水合用于扩增靶多核苷酸的核苷酸中特别有用。如图1所示，方法10包括用再水合缓冲溶液再水合核苷酸以形成核苷酸溶液，如框12所示。在一个示例中，上述再水合缓冲溶液的实施方案例如可以包含2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵和三(羟甲基)氨基甲烷。任选地，再水合缓冲液可包含peg和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0034]
如方框14所示，第一扩增溶液可以来源于一部分核苷酸溶液。任选地，将添加剂溶液加入到核苷酸溶液中。在一个示例中，第一扩增溶液包含与接头部分偶联的引物。
[0035]
任选地，可由核苷酸溶液的另一部分制备第二扩增溶液，如框16所示。特别地，可以将不同组的引物或不含接头部分的引物加入到第二扩增溶液中。
[0036]
在一个示例中，可以使用第一扩增溶液进行靶多核苷酸的第一扩增，如框18所示。特别地，可以根据rpa或pcr进行扩增，如下文更详细描述的。
[0037]
任选地，可使用第二扩增溶液进行靶多核苷酸的第二次扩增，如框20所示。另选地，第一扩增溶液可用于第一扩增和第二扩增两者。
[0038]
上述试剂溶液和方法在制备用于测序的单克隆群体中特别有用。例如，这种单克隆群可在平板上形成，并可用于光学测序。在另一个示例中，可将此类单克隆群体设置于孔中，并且可使用半导体或固态传感器进行测序。在图2中示出其它实施例。
[0039]
在图2中，含有流体回路102的系统100通过入口连接到至少两个试剂储存器(104，106，108，110或112)、连接到废液储存器120，并且通过将流体节点130与生物传感器134的入口138连接以实现流体连通的流体通路132连接到生物传感器134。来自储存器(104、106、108、110或112)的试剂可以通过包含压力、泵(诸如注射泵、重力进料等)多种方法被驱动到流体回路102，并且通过控制阀114来加以选择。来自流体回路102的试剂可以通过从控制系统118接收信号的阀114而被驱动到废液容器120。来自流体回路102的试剂也可以通过生物传感器134而被驱动到废液容器136。控制系统118包括用于阀114的控制器，该控制器生成用于通过电连接件116断开和闭合的信号。
[0040]
控制系统118还包括用于系统的其它组件的控制器，诸如通过电连接件122连接到控制器系统的洗涤溶液阀124和参考电极128。控制系统118还可以包含用于生物传感器134的控制和数据采集功能。在一种操作模式中，流体回路102在控制系统118的经编程控制下，将一系列所选试剂1、2、3、4或5递送到生物传感器134，使得在所选试剂流之间，流体回路102得到灌注和洗涤，并且生物传感器134得到洗涤。进入生物传感器134的流体通过出口140离开并且通过对夹紧阀调节器144的控制沉积在废液容器136中。阀144与生物传感器134的传感器流体输出140流体连通。
[0041]
包含对由第一入口和第二入口形成的孔进行限定并且暴露传感器垫的介电层的
装置尤其适用于检测化学反应和副产物，诸如检测响应于核苷酸并入的氢离子的释放，可用于遗传测序等其它应用。在特定实施方案中，测序系统包含其中设置有传感阵列的流通池，包含与传感阵列电子连通的通信电路，并且包含与流通池流体连通的容器和流体控制器。在一个示例中，图3示出流通池200的扩大的横截面图并且示出了流动室206的一部分。试剂流208流过池阵列202的表面，其中试剂流208流过池阵列202的池的开口端。孔阵列202和传感器阵列205一起可形成形成流通池200的下壁(或底板)的集成单元。参考电极204可以流动地联接到流动室206。进一步地，流通池盖230包封流动室206以将试剂流208容纳在限定区域内。
[0042]
图4展示了如图3的210处所示的孔301和传感器314的扩展视图。孔的体积、形状、纵横比(诸如基板宽度与孔深度之比)和其它尺寸特征可基于所发生的反应的性质以及所采用的试剂、副产物或标记技术(如果有的话)来选择。传感器314可以是化学场效应晶体管(chemfet)，更具体来说离子敏感fet(isfet)，其具有浮动栅极318，该浮动栅极具有任选地通过材料层316与孔内部分离的传感器板320。传感器314可响应于与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量(并且生成与该量相关的输出信号)。材料层316可为陶瓷层，诸如锆、铪、钽、铝或钛等的氧化物，或钛的氮化物。或者，材料层316可由诸如钛、钨、金、银、铂、铝、铜或它们的组合的金属形成。在一个示例中，材料层316的厚度可在5nm至100nm范围内，诸如10nm至70nm范围内，15nm至65nm范围内或甚至20nm至50nm范围内。
[0043]
尽管材料层316被示出为延伸超过所示出的fet组件的界限，但材料层316可沿孔301的底部延伸以及任选地沿孔301的壁延伸。传感器314可响应于与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量(并且生成与该量相关的输出信号)。电荷324的变化可能引起chemfet中的源极321与漏极322之间的电流的变化。进而，chemfet可以直接使用以提供基于电流的输出信号，或间接与额外的电路系统一起使用以提供基于电压的输出信号。反应物、洗涤溶液和其它试剂可通过扩散机构340进入和离开孔。
[0044]
孔301可由壁结构界定，该壁结构可由一个或多个材料层形成。在一个示例中，壁结构可具有从孔的下表面延伸到上表面，0.01微米至10微米范围，诸如0.05微米至10微米范围、0.1微米至10微米范围、0.3微米至10微米范围或0.5微米至6微米范围内的厚度。特别地，厚度可以在0.01微米至1微米的范围内，诸如0.05微米至0.5微米的范围内，或0.05微米至0.3微米的范围内。阵列202的孔301的特征直径可以不大于5微米，诸如不大于3.5微米、不大于2.0微米、不大于1.6微米、不大于1.0微米、不大于0.8微米或甚至不大于0.6微米，该特征直径定义为4乘以横截面积(a)除以π的平方根(例如，sqrt(4*a/π))。在一个示例中，孔301可具有至少0.01微米的特征直径。在另一个示例中，孔301可界定0.05fl至10pl范围内的体积，诸如0.05fl至1pl范围、0.05fl至100fl范围、0.05fl至10fl范围或甚至0.1fl至5fl范围内的体积。
[0045]
在一个实施方案中，在孔301中进行的反应可以是用来标识或确定所关注的分析物的特性或性质的分析反应。这些反应可以直接或间接生成影响邻近传感器板320的电荷量的副产物。如果这类副产物少量产生或快速衰减或与其它成分反应，那么可同时在池301中分析相同分析物的多个副本，以便增加所产生的输出信号。在一个实施方案中，分析物的多个拷贝可以在沉积到孔301中之前或之后连接到固相载体312上。固相载体312可以是包括凝胶或类似物的微粒、纳米颗粒、珠粒、固体或多孔。为了简单和易于解释，固相载体312
在本文中也称为颗粒或珠粒。对于核酸分析物，可以通过滚环扩增(rca)、指数rca或类似技术制备多个连接的拷贝，以产生扩增子而不需要固体载体。
[0046]
特别地，诸如珠粒载体的固相载体可以包含多核苷酸的拷贝。在图5所展示的特定示例中，聚合物颗粒在测序技术期间可用作多核苷酸的载体。例如，此类亲水性颗粒可固定用于使用荧光测序技术测序的多核苷酸。在另一个示例中，亲水性颗粒可固定用于使用离子传感技术测序的多核苷酸的多个拷贝。可替代地，上文所描述的处理可提高聚合物基质与传感器阵列表面的粘合。聚合物基质可以捕获分析物，诸如用于测序的多核苷酸。
[0047]
珠粒载体可包括有机聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及它们的共聚物和接枝物。载体也可是无机的，诸如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(cpg)或反相二氧化硅。载体的构型可以是珠粒、球、颗粒、细粒、凝胶或表面形式。载体可以是多孔的或非多孔的，并且可以具有溶胀或非溶胀特征。在一些实施方案中，载体是离子球体颗粒。在标题为“亲水性聚合物颗粒及其制备和使用方法”的us 9,243,085和标题为“由羧基官能丙烯酰胺形成的聚合物基板”的us 9,868,826中公开了珠粒载体的示例，其各自通过引用并入本文。
[0048]
在一些实施方案中，固体载体是“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”等，(形状任选地但未必是球形)，其具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1微米、0.2微米、0.3微米或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1纳米至10纳米、约10纳米至100纳米或约100纳米至500纳米)。在一个示例中，载体为至少0.1微米。微粒或珠粒载体可由多种无机或有机材料制成，该无机或有机材料包括但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、胶乳、聚苯乙烯等。磁化可以促进扩增后微粒连接的试剂(例如多核苷酸或连接酶)的收集和浓缩，并且还可以促进附加的步骤(例如洗涤、试剂移除等)。在某些实施方案中，使用具有不同形状大小和/或颜色的微粒群体。微米颗粒可任选地例如用量子点进行编码，使得每一微粒或微米颗粒组可分别或独特地识别。
[0049]
磁性珠粒(例如，来自dynal、oslo、norway的dynabeads)可具有1微米至100微米范围内的大小，该范围诸如2微米至100微米。磁性珠粒可以由无机或有机材料形成，包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚苯乙烯或它们的组合。
[0050]
在一些实施方案中，珠粒载体被官能化以连接第一引物群体。在一些实施方案中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。例如，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施方案中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施方案中，珠粒的最小横截面长度(例如，直径)是约50微米或更小、或约10微米或更小、或约3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1微米、0.2微米、0.3微米或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1纳米-10纳米、约10纳米-100纳米或约100纳米-500纳米)。
[0051]
一般来说，可以将珠粒载体处理成包含生物分子，包含核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂质或它们的衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可以结合或连接到生物分子上。生物分子的末端或任何内部部分可与聚合物颗粒结合或连接。使用连接化学方法，聚合物颗粒可与生物分子结合或连接。连接化学方法包含共价或非共价键，包含离子键、氢键、亲和力键、偶极-偶极键、范德华键(van der waals bond)和疏水性键。
连接化学包括结合配偶体之间的亲和力，例如：亲和素部分和生物素部分；抗原表位和抗体或它们的免疫学活性片段；抗体和半抗原；地高辛配基部分和抗地高辛配基抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏物；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白a；或者寡核苷酸或多核苷酸以及它们相应的互补序列。
[0052]
如图5所展示，可以将多个珠粒载体404以及多个多核苷酸402(靶多核苷酸或模板多核苷酸)置于溶液中。可以将多个珠粒载体404活化或以其它方式制备以与多核苷酸402结合。例如，珠粒载体404可以包含与多个多核苷酸402中的多核苷酸的一部分互补的寡核苷酸(捕获引物)。在另一个示例中，使用技术，诸如生物素-抗生蛋白链菌素结合，珠粒载体404可以被修饰具有靶多核苷酸402。
[0053]
在一些实施方案中，模板核酸分子(模板多核苷酸或靶多核苷酸)可以衍生自可来自天然或非天然来源的样品。样品中的核酸分子可以是来源于活生物体或细胞。可使用任何核酸分子，例如样品可以包含覆盖来自活生物体或细胞的部分或全部基因组、mrna或mirna的基因组dna。在其它实施方案中，模板核酸分子可以是合成的或重组的。在一些实施方案中，样品含有具有基本上一致序列或具有不同序列的混合物的核酸分子。通常使用在活细胞内生成并且由活细胞生成的核酸分子来进行说明性实施方案。此类核酸分子通常是直接从天然来源，诸如细胞或体液分离，无需任何活体外扩增。因此，样品核酸分子直接用于后续步骤中。在一些实施方案中，样品中的核酸分子可以包含具有不同序列的两种或更多种核酸分子。
[0054]
方法任选地可包括在文库制备之前、期间或之后并且在预接种反应之前的靶标富集步骤。可以例如通过多重核酸扩增或杂交来富集包含靶基因座或所关注区域的靶核酸分子。多种方法可用于进行多重核酸扩增以生成诸如多重pcr的扩增子，并且该多种方法可用于实施方案中。在将模板核酸分子加入到预接种反应混合物中之前，可以在通过任何方法富集后进行通用扩增反应。本发明教导的任一实施方案可以包含富集多个至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个靶核酸分子、靶基因座或所关注区域。在任一所公开的实施方案中，靶基因座或所关注区域可以为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1,000个核苷酸长，并且包含模板核酸分子的一部分或全部。在其它实施方案中，靶基因座或所关注区域的长度可以在约1至10,000个核苷酸之间，例如长度在约2至5,000个核苷酸之间、在约2至3,000个核苷酸之间或在约2至2,000个核苷酸之间。在本发明教导的任一实施方案中，多重核酸扩增可以包含生成至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个各靶核酸分子、靶基因座或所关注区域的拷贝。
[0055]
在一些实施方案中，在文库制备和任选的富集步骤之后，可以将模板核酸分子文库模板化到一个或多个载体上。一个或多个载体可以在两个反应中模板化，即生成预接种固体载体的接种反应和使用一个或多个预接种载体进一步扩增连接的模板核酸分子的模
板化反应。预接种反应通常是扩增反应，并且可使用各种方法进行。例如，预接种反应可以在rpa反应、模板步移反应或pcr中进行。在rpa反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白来扩增模板核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离至少一部分的双链模板核酸分子，以允许引物杂交，随后聚合酶可结合以启动复制。在一些实施方案中，重组酶辅助蛋白可以是防止解离的模板核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-stranded binding protein；ssb)。通常，rpa反应可在等温温度下进行。在模板步移反应中，在允许双链模板核酸分子的至少一部分解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以开始复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在pcr中，通过热循环使双链模板核酸分子解离。冷却后，引物与互补序列结合并可以用于聚合酶的复制。在本发明教导的任一个方面中，可以在预接种反应混合物中进行预接种反应，该预接种反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在任何公开的方面中，预接种反应混合物可以包含以下的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种固体载体、核苷酸以及诸如二价阳离子的辅因子。在一些实施方案中，预接种反应混合物可以进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施方案中，模板核酸分子群体包括与同第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施方案中，如在乳液rpa或乳液pcr中，反应混合物可以形成乳液。在通过rpa反应进行的预接种反应中，预接种反应混合物可以包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
[0056]
在接种的特定实施方案中，使亲水性颗粒和多核苷酸经受聚合酶链式反应(pcr)扩增或重组酶聚合酶扩增(rpa)。在一个示例中，颗粒404包含与模板多核苷酸402的一部分互补的捕获引物。模板多核苷酸可以与捕获引物杂交。捕获引物可以延伸以形成包含与其连接的靶多核苷酸的珠粒406。其它珠粒可以保持不与靶核酸连接，并且其它模板多核苷酸可自由浮动于溶液中。
[0057]
在一个示例中，包含靶多核苷酸的珠粒载体406可以与磁性珠粒410连接以形成珠粒组装件412。具体地，通过双链多核苷酸连接，将磁性珠粒410与珠粒载体406连接。在一个示例中，包含接头部分的另外的探针可以与珠粒载体406上的靶多核苷酸的一部分杂交。接头部分可以与磁性珠粒410上的互补接头部分连接。在另一个示例中，用于形成与珠粒406连接的靶核酸的模板多核苷酸可以包含与磁性珠粒410连接的接头部分。在另一个示例中，从修饰具有与磁性珠粒410连接的接头的引物，可以生成与和珠粒载体406连接的靶多核苷酸互补的模板多核苷酸。
[0058]
连接于多核苷酸的接头部分和连接于磁性珠粒的接头部分可以彼此互补和连接。在一个示例中，接头部分具有亲和力并且可以包括：亲和素部分和生物素部分；抗原表位和抗体或它们的免疫学活性片段；抗体和半抗原；地高辛配基部分和抗地高辛配基抗体；荧光素部分和抗荧光素抗体；操纵子和阻遏物；核酸酶和核苷酸；凝集素和多糖；类固醇和类固醇结合蛋白；活性化合物和活性化合物受体；激素和激素受体；酶和底物；免疫球蛋白和蛋白a；或者寡核苷酸或多核苷酸以及它们相应的互补序列。在一个特定示例中，与多核苷酸连接的接头部分包含生物素，并且与磁性珠粒连接的接头部分包含链霉抗生物素蛋白。
[0059]
珠粒组装件412可以施加在包含孔418的测序装置的基板416之上。在一个示例中，可向基板416施加磁场以将珠粒组装件412的磁性珠粒410牵拉向孔418。珠粒载体406进入
孔418。例如，磁体可平行于基板416的表面移动，由此使得将珠粒载体406置放于418孔中。
[0060]
可以使珠粒组装件412变性，以移除磁性珠粒410，将珠粒载体406留在孔418中。例如，可使用热循环或离子性溶液使珠粒组装件412的杂交的双链dna变性，以释放磁性珠粒410和具有与磁性珠粒410连接的接头部分的模板多核苷酸。例如，可以用低离子含量水溶液诸如去离子水处理双链dna，以使链变性和分离。在一个示例中，泡沫洗涤可以用于移除磁性珠粒。
[0061]
任选地，可以扩增靶多核苷酸406(在本文称为模板化)，同时在孔418中，提供具有靶多核苷酸的多个拷贝的珠粒载体414。具体地，珠粒414具有靶多核苷酸的单克隆群体。这种扩增反应可以使用聚合酶链式反应(pcr)扩增、重组聚合酶扩增(rpa)或它们的组合进行。可替代地，可以在将珠粒载体414沉积在孔中之前进行扩增。
[0062]
在一个特定实施方案中，酶(诸如聚合酶)存在、结合于或紧密靠近于颗粒或珠粒。在一个示例中，聚合酶存在于溶液中或孔中以促进多核苷酸的复制。多种核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在示例实施方案中，聚合酶可以包含可催化多核苷酸复制的酶、其片段或亚基。在另一实施方案中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变体聚合酶、变异聚合酶、融合或其它工程聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子，或它们的类似物、衍生物或片段。示例性酶、溶液、组合物和扩增方法可见于wo2019/094,524，标题为“用于操纵核酸的方法和组合物”，其通过引用整体并入本文。
[0063]
尽管珠粒载体414的多核苷酸示出为在表面上，但多核苷酸可延伸在珠粒载体414内。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可以包含珠粒载体414的内部上和整个中的多核苷酸区段，或多核苷酸可存在于孔和其它开口中。具体地，珠粒载体414可以允许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物扩散。每个颗粒的大量多核苷酸产生更好的信号。
[0064]
在一个示例性实施方案中，珠粒载体414可以用于测序装置中。例如，测序装置416可以包含孔418的阵列。
[0065]
在一个示例中，可以将测序引物添加到孔418中，或者可以在将珠粒载体414放置在孔418中之前将其预暴露于引物。具体地，珠粒载体414可以包含结合的测序引物。测序引物和多核苷酸形成包含与测序引物杂交的多核苷酸(例如模板核酸)的核酸双螺旋。核酸双螺旋是至少部分地双链多核苷酸。可以向孔418提供酶和核苷酸以促进可检测的反应，诸如核苷酸并入。
[0066]
可以通过检测核苷酸添加来进行测序。可以使用诸如荧光发射法或离子检测法的方法检测核苷酸添加。例如，一组荧光标记的核苷酸可以被提供给系统416并且可以迁移到孔418。还可以向孔418提供激发能。当核苷酸被聚合酶捕获并加入到延伸引物的末端时，核苷酸的标记可以发荧光，指示加入了哪种类型的核苷酸。
[0067]
在一个替代的示例中，可以依次加入包含单一类型核苷酸的溶液。响应于核苷酸添加，孔418的局部环境内的ph可改变。这种ph的变化可以通过离子敏感场效应晶体管(isfet)检测。因此，ph改变可用于生成指示与颗粒410的多核苷酸互补的核苷酸的次序。
[0068]
具体地，测序系统可以包括安置在离子传感器诸如场效应晶体管(fet)的传感器垫上的一个孔或多个孔。在各实施方案中，系统包含装载到设置在离子传感器(例如，fet)的传感器垫上的孔中的一种或多种聚合物颗粒，或装载到设置在离子传感器(例如，fet)的
传感器垫上的多个孔中的一种或多种聚合物颗粒。在各实施方案中，fet可以是chemfet或isfet。“chemfet”或化学场效应晶体管包括一种用作化学传感器的场效应晶体管。chemfet的结构类似于mosfet晶体管，其中通过化学工艺施加栅电极上的电荷。“isfet”或离子敏感场效应晶体管可用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(诸如h+)改变时，通过晶体管的电流也相应地改变。
[0069]
在各实施方案中，fet可以是fet阵列。如本文所使用的，“阵列”是诸如传感器或孔的元件的平面布置。阵列可以是一维或二维的。一维阵列可以是在第一维度中具有一列(或行)元素并且在第二维度中具有多个列(或行)元件的阵列。第一维度和第二维度中的列(或行)的数量可以相同或不同。fet或阵列可以包括102、103、104、105、106、107或更多fet。
[0070]
在各实施方案中，可以在fet传感器阵列上方制造一个或多个微流体结构，以提供生物或化学反应的容纳或约束。例如，在一个实施方案中，微流体结构可以被配置成设置于阵列的一个或多个传感器上方的一个或多个孔(或孔，或反应室，或反应孔，如本文中可互换地使用的术语)，使得其上设置既定孔的一个或多个传感器检测和测量既定孔中的分析物存在、水平或浓度。在各实施方案中，fet传感器和反应孔之间可存在1:1对应。
[0071]
返回到图5，在另一个示例中，可以将孔阵列的孔418可操作地连接到测量装置。例如，对于荧光发射法，可将孔418可操作地联接到光检测装置。在离子性检测的情况下，孔418的下表面可安置于离子性传感器(诸如场效应晶体管)的传感器垫上。
[0072]
一种涉及通过检测核苷酸并入的离子性副产物测序的示例系统是ion torrent pgm
tm
,proton
tm
、s5
tm
或genexus
tm
测序仪(thermo fisher scientific)，其是通过检测作为核苷酸并入的副产物产生的氢离子来对核酸模板进行测序的离子类测序系统。通常，氢离子作为使用聚合酶的模板依赖性核酸合成期间发生的核苷酸并入的副产物释放。ion torrent pgm
tm
、proton
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、s5
tm
或genexus
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测序仪通过检测核苷酸并入的氢离子副产物来检测核苷酸并入。ion torrent pgm
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、proton
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、s5
tm
或genexus
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测序仪可以包含待测序的多个模板多核苷酸，各模板设置在阵列中的各个测序反应孔内。阵列的孔各自与至少一个离子传感器联接，该离子传感器可以检测h+离子的释放或作为核苷酸并入的副产物产生的溶液ph的变化。离子传感器包括联接到离子敏感检测层的场效应晶体管(fet)，其可以感测h+离子的存在或溶液ph的变化。离子传感器可提供指示核苷酸并入的输出信号，其可以表示为电压变化，其大小与各自的孔或反应室中的h+离子浓度相关。不同的核苷酸类型可连续流入反应室，并且可以通过聚合酶以模板序列确定的顺序并入延伸引物(或聚合位点)中。每个核苷酸并入可以伴随着反应孔中h+离子的释放，以及局部ph的变化。h+离子的释放可由传感器的fet记录，该fet产生指示核苷酸并入发生的信号。在特定核苷酸流动期间未并入的核苷酸可能不产生信号。来自fet的信号的振幅也可以与并入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量相关，从而准许均聚物区被解析。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室同时并入，通过多个孔或反应室监测可以允许仪器同时解析许多核酸模板的序列。
[0073]
上述试剂溶液和方法提供了期望的技术和优点，特别是当用于在单克隆群体之前扩增多核苷酸时。已发现此类溶液减少靶多核苷酸的高gc富集区域的扩增中的偏倚。
[0074]
实施例
[0075]
实施例1
[0076]
使用genexus测序仪和可商购获得的genexus测序试剂盒以及gx5芯片和偶联剂对提取的核苷酸样品进行测序。使用可商购获得的oncomine
tm
髓样测定gx(第一版)或其中用测试溶液代替再水合缓冲液的oncomine
tm
髓样测定gx制备文库。测试溶液包含2.5体积％的peg 20k、0.055体积％的neolone m-10、60mm谷氨酸钾、80mm hepes、80mm dmap、45mm tris和0.10体积％的tween，并且具有7.45的ph。
[0077]
使用测试溶液的测序运行平均显示在有效读数％方面至少4％的改善、更长的平均读数长度和改善的原始读数准确度。
[0078]
表1.测序性能的改善
[0079] 标准测定试剂盒测试测定试剂盒有效读数％61.2％66.9％平均读段长度207bp210bp原始读段准确性99.0299.13
[0080]
实施例2
[0081]
使用genexus测序仪和可商购获得的genexus测序试剂盒以及gx5芯片和偶联剂对提取的核苷酸样品进行测序。使用可商购获得的oncomine
tm
髓样测定gx(第一版)或其中用上述测试溶液代替再水合缓冲液的oncomine
tm
髓样测定gx制备文库。结果集中于cebpa覆盖范围。
[0082]
使用测试溶液的测序运行平均显示更好的cebpa碱基覆盖率和均匀性。cebpa扩增子读段的数目提高至少50％。
[0083]
在第一实施方案中，试剂溶液包括水性溶液，该水性溶液含有1mm至200mm的量的2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸；1mm至200mm的量的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵；和1mm至200mm的量的三(羟甲基)氨基甲烷。
[0084]
在第二个实施方案中，用于扩增核酸的方法包括用再水合缓冲溶液再水合核苷酸以形成核苷酸溶液，再水合缓冲溶液包含2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵和三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液。该方法还包括使用核苷酸溶液，并添加酶和引物来制备扩增溶液；以及在扩增的存在下进行扩增。
[0085]
在第一实施方案和第二实施方案的一个示例中，2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸以10mm至100mm的量被包含。例如，2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸以10mm至50mm的量被包含。
[0086]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵以10mm至150mm的量被包含。例如，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵以10mm至100mm的量被包含。
[0087]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，三(羟甲基)氨基甲烷以1mm至100mm的量被包含。例如，三(羟甲基)氨基甲烷以10mm至100mm的量或10mm至50mm的量被包含。
[0088]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。例如，该聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯是聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在另一个示例中，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯以0.001体积％至0.5体积％的量，诸如0.01体积％至0.5体积％的量或0.05体积％至0.25体
积％的量被包含。
[0089]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含10mm至500mm的量的谷氨酸钾。例如，谷氨酸钾以10mm至250mm的量，诸如50mm至250mm的量被包含。
[0090]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.1体积％至7体积％的量的聚乙二醇。例如，聚乙二醇以0.5体积％至6体积％的量，诸如0.9体积至4体积％的量被包含。在一个示例中，聚乙二醇具有在10k至50k的范围，诸如10k至40k的范围或15k至40k的范围内的分子量。在一个具体示例中，聚乙二醇包含分子量在10k至29k范围内的第一聚乙二醇和分子量在30k至50k范围内的第二聚乙二醇。
[0091]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含杀生物剂。例如，杀生物剂包括甲基异噻唑啉酮或异噻唑啉酮。在一个示例中，杀生物剂以0.001体积％至0.1体积％的量被包含。
[0092]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.1μm至100μm的量的核苷酸。例如，核苷酸以0.1μm至50μm的量，诸如0.5μm至10μm的量被包含。
[0093]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含1mm至100mm的量的乙酸。例如，乙酸以1mm至50mm的量被包含。
[0094]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.01mm至20mm的量的二硫苏糖醇。例如，二硫苏糖醇以0.1mm至10mm的量，诸如1mm至10mm的量被包含。
[0095]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.1体积％至20体积％的量的海藻糖。例如，海藻糖以0.1体积％至10体积％，诸如1体积％至10体积％的量被包含。
[0096]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.1mm至50mm的量的三磷酸腺苷。例如，三磷酸腺苷以0.1mm至20mm的量，诸如0.9mm至10mm的量被包含。
[0097]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.1mm至50mm的量，诸如0.1mm至20mm的量的乙酸镁。
[0098]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含0.01体积％至10体积％的量的甲基纤维素。例如，甲基纤维素以0.01体积％至5体积％的量，诸如0.1体积％至2体积％的量被包含。
[0099]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含1mm至200mm的量的磷酸肌酸。例如，磷酸肌酸以10mm至150mm的量，诸如10mm至100mm的量被包含。
[0100]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含酶。
[0101]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含稳定剂。
[0102]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含
引物。在一个示例中，引物包含接头部分。
[0103]
在第一实施方案和第二实施方案的另一个示例以及上述示例中，试剂溶液还包含迁移抑制剂。
[0104]
在第二实施方案的另一个示例和上述示例中，该方法还包括使用核苷酸溶液并添加酶和第二引物来制备第二扩增溶液。
[0105]
需注意，并非以上在一般描述或示例中描述的所有活动都是必需的，特定活动的一部分可以不是必需的，并且除了所描述的那些之外还可以进行一种或多种另外的活动。更进一步地，列出活动的顺序不一定是执行这些活动的顺序。
[0106]
在前述说明书中，已经参考具体实施方案描述了概念。然而，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离如所附权利要求中阐述的本发明的范围的情况下，可以进行各种修改和改变。因此，说明书和附图应当被认为是例示性的而不是限制性的，并且所有此类修改旨在被包括在本发明的范围内。
[0107]
如本文所用，术语“包括(“comprises”、“comprising”、“includes”、“including”)”、“具有”(“has”、“having”)或其任何其他变型旨在涵盖非排他性的包括。例如，包括一系列特征的过程、方法、制品或装置不必仅限于那些特征，而是可包括未明确列出的或此类过程、方法、制品或装置所固有的其他特征。此外，除非另有明确的相反陈述，否则“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件a或b符合以下任一项：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，并且a和b均为真(或存在)。
[0108]
此外，使用“一”或“一个”来描述本文所述的元件和部件。这样做仅仅是为了方便并且给出本发明范围的一般含义。该描述应被理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非很明显另有含义。
[0109]
上文已关于特定实施方案描述了益处、其他优点及问题的解决方案。然而，益处、优点、问题的解决方案以及可导致任何益处、优点或解决方案发生或变得更显著的任何特征不应被解释为任何或所有权利要求的关键的、必需的或必要的特征。
[0110]
在阅读本说明书之后，本领域的技术人员将理解，为了清楚起见，本文在分开的实施方案的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的各种特征也可以单独地或以任何子组合来提供。此外，对范围内所述值的引用包括该范围内的每个值。

技术特征：
1.一种试剂溶液，所述试剂溶液包括：水性溶液，所述水性溶液包含：1mm至200mm的量的2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸；1mm至200mm的量的[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵；和1mm至200mm的量的三(羟甲基)氨基甲烷。2.根据权利要求1所述的试剂溶液，其中所述2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸以10mm至100mm的量被包含。3.根据权利要求2所述的试剂溶液，其中所述2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸以10mm至50mm的量被包含。4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂溶液，其中所述[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵以10mm至150mm的量被包含。5.根据权利要求4所述的试剂溶液，其中所述[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵以10mm至100mm的量被包含。6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂溶液，其中所述三(羟甲基)氨基甲烷以1mm至100mm的量被包含。7.根据权利要求6所述的试剂溶液，其中所述三(羟甲基)氨基甲烷以10mm至100mm的量被包含。8.根据权利要求7所述的试剂溶液，其中所述三(羟甲基)氨基甲烷以10m至50m的量被包含。9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。10.根据权利要求9所述的试剂溶液，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯为聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯。11.根据权利要求9所述的试剂溶液，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯以0.001体积％至0.5体积％的量被包含。12.根据权利要求11所述的试剂溶液，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯以0.01体积％至0.5体积％的量被包含。13.根据权利要求12所述的试剂溶液，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯以0.05体积％至0.25体积％的量被包含。14.根据权利要求1至13中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含10mm至500mm的量的谷氨酸钾。15.根据权利要求14所述的试剂溶液，其中所述谷氨酸钾以10mm至250mm的量被包含。16.根据权利要求15所述的试剂溶液，其中所述谷氨酸钾以50mm至250mm的量被包含。17.根据权利要求1至16中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.1体积％至7体积％的量的聚乙二醇。18.根据权利要求17所述的试剂溶液，其中所述聚乙二醇以0.5体积％至6体积％的量被包含。19.根据权利要求18所述的试剂溶液，其中所述聚乙二醇以0.9体积％至4体积％的量被包含。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的试剂溶液，其中所述聚乙二醇具有在10k至50k范围内的分子量。21.根据权利要求20所述的试剂溶液，其中所述聚乙二醇具有在10k至40k范围内的分子量。22.根据权利要求21所述的试剂溶液，其中所述聚乙二醇具有在15k至40k范围内的分子量。23.根据权利要求20所述的试剂溶液，其中所述聚乙二醇包含分子量在10k至29k范围内的第一聚乙二醇和分子量在30k至50k范围内的第二聚乙二醇。24.根据权利要求1至23中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含杀生物剂。25.根据权利要求24所述的试剂溶液，其中所述杀生物剂包括甲基异噻唑啉酮或异噻唑啉酮。26.根据权利要求24所述的试剂溶液，其中所述杀生物剂以0.001体积％至0.1体积％的量被包含。27.根据权利要求1至26中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.1μm至100μm的量的核苷酸。28.根据权利要求27所述的试剂溶液，其中所述核苷酸以0.1μm至50μm的量被包含。29.根据权利要求28所述的试剂溶液，其中所述核苷酸以0.5μm至10μm的量被包含。30.根据权利要求1至29中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含1mm至100mm的量的乙酸。31.根据权利要求30所述的试剂溶液，其中所述乙酸以1mm至50mm的量被包含。32.根据权利要求1至31中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.01mm至20mm的量的二硫苏糖醇。33.根据权利要求32所述的试剂溶液，其中所述二硫苏糖醇以0.1mm至10mm的量被包含。34.根据权利要求33所述的试剂溶液，其中所述二硫苏糖醇以1mm至10mm的量被包含。35.根据权利要求1至34中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.1体积％至20体积％的量的海藻糖。36.根据权利要求35所述的试剂溶液，其中所述海藻糖以0.1体积％至10体积％的量被包含。37.根据权利要求36所述的试剂溶液，其中所述海藻糖以1体积％至10体积％的量被包含。38.根据权利要求1至37中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.1mm至50mm的量的三磷酸腺苷。39.根据权利要求38所述的试剂溶液，其中所述三磷酸腺苷以0.1mm至20mm的量被包含。40.根据权利要求39所述的试剂溶液，其中所述三磷酸腺苷以0.9mm至10mm的量被包含。41.根据权利要求1至40中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.1mm至50mm的量的乙酸镁。
42.根据权利要求41所述的试剂溶液，其中所述乙酸镁以0.1mm至20mm的量被包含。43.根据权利要求1至42中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含0.01体积％至10体积％的量的甲基纤维素。44.根据权利要求43所述的试剂溶液，其中所述甲基纤维素以0.01体积％至5体积％的量被包含。45.根据权利要求44所述的试剂溶液，其中所述甲基纤维素以0.1体积％至2体积％的量被包含。46.根据权利要求1至45中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含1mm至200mm的磷酸肌酸。47.根据权利要求46所述的试剂溶液，其中所述磷酸肌酸以10mm至150mm的量被包含。48.根据权利要求47所述的试剂溶液，其中所述磷酸肌酸以10mm至100mm的量被包含。49.根据权利要求1至48中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含酶。50.根据权利要求1至49中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含稳定剂。51.根据权利要求1至50中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含引物。52.根据权利要求1至51中任一项所述的试剂溶液，所述试剂溶液还包含迁移抑制剂。53.一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：用再水合缓冲溶液再水合核苷酸以形成核苷酸溶液，所述再水合缓冲溶液包含2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵和三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液；使用所述核苷酸溶液并添加酶和引物来制备扩增溶液；以及在所述扩增的存在下进行扩增。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述扩增溶液是根据权利要求1至52中的一项所述的试剂溶液。55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述引物包含接头部分。56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，所述方法还包括使用所述核苷酸溶液并添加酶和第二引物来制备第二扩增溶液。

技术总结
酸、1mM至200mM的量的2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氢氧化铵和1mM至200mM的量的三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液。200mM的量的三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液。200mM的量的三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液。


技术研发人员：K
受保护的技术使用者：生命技术公司
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2023/9/9