一种耐高温且高甲醇转化率的毕赤酵母菌株及其应用

1.本发明属于微生物领域和生物技术领域，具体涉及一种耐高温高甲醇转化率的毕赤酵母菌株及其应用。


背景技术：

2.为了满足全球对动物源性蛋白质的需求，世界每年将需要生产12.5亿吨肉类和乳制品。然而，由于将饲料转化为肉类和奶制品的效率低下，增加肉类和奶制品的生产将无法持续满足人类对蛋白质日益增长的需求。虽然人造肉和植物性肉类替代品目前发展迅速，但较高的生产成本和较差的口感使它们不如传统畜牧业生产的动物性蛋白质具有竞争力。因此，寻找和开发新的蛋白质资源仍然是必要的。由藻类（蛋白质含量约为60-70%），真菌（蛋白质含量约为30-50%）和细菌（蛋白质含量约为50-80%）产生的单细胞蛋白（scp）是一个潜在的蛋白替代途径。这些微生物独特的底物（如co2或甲烷）利用能力和高生长速率使得scp的生产比传统农业更有效和可持续性。
3.co2在全球大气中的浓度正以惊人的速度增加，气候和温室效应已经严重影响到人类的生存和发展。日益严重的环境危机加剧了从传统石化经济向可持续原料转变的必要性。微生物的一碳（c1）化合物同化已经成为缓解气候变化的一种有前途的方法。甲醇被认为是化学工业和生物制造业的理想c1资源，因为它不仅可以从低质煤中生产，而且还可以通过电催化co2和氢（电解水）大量生产。与气态c1化合物相比，甲醇作为液体更容易运输和储存。此外，甲醇具有很高的还原度，可以为产品生物合成提供更大的驱动力。因此，便宜和丰富的来源、灵活的生产工艺、与目前运输和发酵基础设施的兼容性、以及高还原潜力使得甲醇成为scp生物合成的极具吸引力的碳源。
4.巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）是自然界中存在的一种能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的微生物，是甲醇生物转化的理想宿主。特别是，p. pastoris是一种重要的工业甲醇酵母，通过美国食品和药物管理局（fda）的gras（通常被认为是安全的）认证，广泛用于生产重组蛋白质。几十年来，研究者一直使用p. pastoris发酵甲醇来生产scp，但是p. pastoris甲醇转化率低是限制scp高效生产的关键问题。此外，由于p. pastoris的发酵温度实际上要高于其生长温度（28-30
°
c），对较高温度的不耐受性通常会降低工业生产过程中底物的转化效率并增加冷却成本。因此，构建一个耐高温、高效利用甲醇的p. pastoris菌株是实现以甲醇为原料经济性生产scp的关键所在。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术不足，本发明提供了一株耐高温高甲醇转化率的巴斯德毕赤酵母菌株shtx-33。shtx-33菌株是通过将高甲醇利用菌株p. pastorishtx-33（cgmcc no.25207）与来自宁夏银川源石酒庄葡萄园的腐木中筛选得到的耐高温的曼氏毕赤酵母菌株p.manshurica进行融合得到的。p. pastoris shtx-33能够在37℃条件下，以甲醇为唯一碳源实现高生物量生长以及高甲醇利用，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等
优势。
6.本发明提供一种耐高温且高甲醇转化率的毕赤酵母菌株（pichia pastoris） shtx-33，其保藏号为cgmcc no.27346。该菌株于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其分类命名为巴斯德毕赤酵母pichia pastoris。
7.本发明进一步提供所述的毕赤酵母菌株在微生物蛋白或饲料生产中的应用。
8.优选地，其中用甲醇作为唯一碳源和能量来源发酵所述毕赤酵母菌株。
9.具体地，所述培养基中甲醇添加量体积比0.3-0.6%。
10.具体实施方式中，所述培养基以delft基本盐培养基作为基础培养基，其组分：7.5 g/l硫酸铵、14.4 g/l磷酸二氢钾、0.5 g/l七水硫酸镁，培养基初始ph值为6.5，使用之前在121℃下灭菌20 min。
11.在一个实施方式中，发酵的培养条件为30-40℃。优选地，发酵的培养条件为37℃、200-240 rpm。
12.本发明提供一种培养所述的毕赤酵母菌株的方法，以甲醇作为碳源和能量来源发酵所述毕赤酵母菌株。
13.具体地，发酵的培养条件为30-40℃。优选地，发酵的培养条件为37℃、200-240 rpm。
14.本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明提供的p. pastoris shtx-33具有鲁棒性，能够实现在37℃条件下进行高甲醇转化。实验结果表明，本发明提供的p. pastoris shtx-33在33℃-37℃、delft+0.5%（v/v）甲醇下的生长明显优于亲本p. pastoris htx-33，且在在摇瓶培养条件下，本发明提供的p. pastoris shtx-33在35℃或37℃、delft+0.5%（v/v）甲醇下的甲醇利用率明显优于亲本p. pastoris htx-33，其甲醇利用率较p. pastoris htx-33提高18.45%，24.1%。因此，本发明菌株培养方法简单，后期生长迅速，适应性强，耐受性高。可解决目前工业发酵过程中甲醇利用率低、菌株不耐高温，降低发酵成本，具有良好的工业应用化前景。
附图说明
15.图1为本发明提供的p. pastorisshtx-33菌株的原生质体融合与筛选过程简图。
16.图2为本发明提供的p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在33℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下的生长曲线图。
17.图3为本发明提供的p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在35℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下的生长曲线图。
18.图4为本发明提供的p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在37℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下的生长曲线图。
19.图5为本发明提供的p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在33℃、35℃、37℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下的最大od
600
值。
20.生物材料保藏信息
21.菌株htx-33，其保藏编号为cgmcc no.25207，分类命名为巴斯德毕赤酵母pichia pastoris，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称
cgmcc），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
22.菌株shtx-33，其保藏编号为cgmcc no.27346，分类命名为巴斯德毕赤酵母pichia pastoris，于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
23.实施例1：p. pastorisshtx-33的亲本来源耐高温的亲本来源：自宁夏银川源石酒庄葡萄园的腐木中，收集腐木样品。将样品分装于装有3 mlypd培养基的试管中，在40℃、220 rpm条件下振荡培养48 h，将所得菌液稀释涂布于ypd平板中，在40℃培养箱中继续培养48 h后，获得单克隆菌株。从中挑选酵母单克隆菌株并将所得酵母单克隆菌株分别接种于装有100 mlypd培养基的250 ml摇瓶中，在40℃、220 rpm条件下振荡培养24 h，制备种子液。通过低温低速离心（4℃，5000 rpm，5 min）的方式收集菌体，用ypd培养基重悬菌体，以初始od
600
=0.25，接入48孔板，每个样品做8个平行，每孔添加1 ml。用ypd培养基为空白对照，于40℃、800 rpm条件下使用全自动微生物生长曲线分析仪测定菌株的生长曲线。对挑取单克隆菌株进行生长评价，筛选得到的耐40℃酵母菌株，经菌种鉴定，该菌株为曼氏毕赤酵母p.manshurica（简称pm）。
24.高甲醇利用的亲本来源：挑取单克隆野生型p. pastoris x-33接种于装有100 mldelft+2%（w/v）甘油培养基的250 ml摇瓶中，在30℃、220 rpm条件下振荡培养24 h，制备种子液。通过低温低速离心（4℃，5000 rpm，5 min）的方式收集菌体，用delft培养基重悬菌体，以初始od
600
=0.01接种于装有100 ml delft+0.5%（v/v）甲醇培养基的250 ml摇瓶中，于33℃、220 rpm条件下继续培养。每次于对数期进行1:100转接至新鲜的delft+0.5%（v/v）甲醇培养基，每次转接3个平行。重复上述过程约350代（约100d），驯化出稳定、高甲醇转化率的菌群。经稀释涂板和生长验证后筛选得到一株高甲醇利用的毕赤酵母菌株，最终命名为htx-33。
25.实施例2：p. pastorisshtx-33菌株的原生质体融合与筛选p. pastorisshtx-33菌株的融合过程与筛选过程如图1所示，在好氧条件下，将p. pastorishtx-33与pm分别挑取单克隆菌株接种于装有100 ml ypd培养基的250 ml摇瓶中，分别在33℃、220 rpm转速和40℃、220 rpm转速下进行富集培养，于对数中期进行取样。各取1ml样品于10ml无菌离心管中，室温条件下3000 rpm离心5 min，弃上清液。用无菌水洗涤离心2次，加入等体积的巯基乙醇，于28℃处理10 min，在室温下2000 rpm离心10 min去除上清液，再加入2 ml 2%浓度的蜗牛溶菌酶，于38℃进行酶解2 h通过低温低速离心（4℃，2000 rpm，10 min）的方式收集原生质体-菌体混合物，去除上清液并用st高渗缓冲液洗涤两次，在4℃下用stc高渗缓冲液悬液重悬原生质体。取p. pastorishtx-33原生质体的菌悬液于70℃条件下灭活40 min；pm原生质体的菌悬液在垂直距离为25 cm的 20 w紫外灯下照射30min，进行亲本灭活。将灭活后的两亲本原生质体等体积均匀混合，经低温低速离心（4℃，2000 rpm，10 min）后，用stc高渗缓冲液洗涤两次后加入等体积的peg助溶剂，于30℃下水浴30 min。经离心（4℃，2000 rpm，10 min），重悬（用stc高渗缓冲液悬液重悬）后，涂布于ypd高渗再生平板上，于37℃培养箱培养5-7 d后，从中挑选出菌落大且饱满的200个单克隆菌株转接于以甲醇为唯一碳源的delft基本盐培养基中，于37℃、700 rpm转速下进行高通
量筛选。发现仅有4株单克隆菌株可在甲醇培养基中进行生长。将这4株单克隆菌株分别接种于100 ml delft+0.5%（v/v）甲醇培养基的250 ml摇瓶中，在37℃、220 rpm转速下振荡培养48 h，制备种子液。用新鲜的delft+0.5%（v/v）甲醇培养基稀释至初始od
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=0.01接种至装有100 ml delft+0.5%（v/v）甲醇培养基中，在37℃、220 rpm转速下进行振荡培养，每组设置3个平行，测定其生长状况。经比较，最终筛选获得一株耐37℃、高甲醇转化率的菌株，菌种鉴定为巴斯德毕赤酵母菌株，命名为shtx-33。
26.实施例3：p. pastorisshtx-33生长的测定在本实验中，使用全自动微生物生长曲线分析仪对p. pastorisshtx-33进行生长评价。测定的方法与实施例1相同。将p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33分别挑取单克隆菌落接种于装有100 ml delft+0.5%（v/v）甲醇培养基的250 ml摇瓶中，分别在37℃、220 rpm转速和33℃、220 rpm转速下振荡培养24 h，制备种子液。用新鲜的delft+0.5%（v/v）甲醇培养基稀释至初始od
600
=0.25，随后接入48孔板，每个样品设置8个平行，每孔添加1 ml。用delft培养基为空白对照，分别测定33℃、35℃、37℃条件下菌株的生长曲线（见图2，3，4）。
27.从结果可以看出，随着温度的升高p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在delft+0.5%（v/v）甲醇培养基中的生长均受到抑制。但在同一温度条件下shtx-33的生长均明显优于亲本htx-33。在生长曲线中表示为shtx-33的生长曲线始终高于亲本htx-33（见图2，3，4）。且随着温度升高shtx-33与亲本htx-33在delft+0.5%（v/v）甲醇培养基中的延滞期均表现为逐渐缩短，而在同一温度下shtx-33生长过程中的延滞期均较htx-33的延滞期短，并且较早开始进入对数生长期。对比shtx-33与亲本htx-33的最大od
600
（见图5），发现随着温度的升高shtx-33与亲本htx-33在delft+0.5%（v/v）甲醇培养基中的最大od
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均逐渐降低，但在同一温度条件下shtx-33的最大od
600
均明显高于亲本htx-33。具体表现为，在33℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下，shtx-33对比亲本htx-33，其最大od
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提高19.67%；在35℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下，shtx-33对比亲本htx-33，其最大od
600
提高25.25%；在37℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下，shtx-33对比亲本htx-33，其最大od
600
提高9.18%。以上结果表明，p. pastoris shtx-33具有鲁棒性，对于温度的耐受性高，在同等条件下能够实现较高生物量的生长，并且后期生长迅速，适应性强。可解决目前工业发酵过程中菌株不耐高温的问题，降低发酵成本，具有良好的工业应用化前景。但采用48孔板测定生长存在甲醇挥发的可能性，并且随着温度升高甲醇挥发量也会随之增高，因此使用48孔板只能定性分析p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在同一条件下的生长状况以及对温度的耐受性，并不能真实地反映其甲醇到生物量的转化率。故而在后续进行p. pastorisshtx-33甲醇到生物量的转化率的测定实验中我们将采用摇瓶实验并用密封膜覆盖摇瓶进行测定，避免甲醇的挥发对实验结果造成影响。
28.实施例4：p. pastorisshtx-33甲醇到生物量的转化率的测定如实施例3所述，为了避免甲醇蒸发，我们采用密封膜覆盖摇瓶的方法进行甲醇利用率的测定。将p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33分别挑取单克隆菌落接种于装有100 ml delft+0.5%（v/v）甲醇培养基的250 ml摇瓶中，分别在37℃、220 rpm转速和33℃、220 rpm转速下振荡培养24 h，制备种子液。用新鲜的delft+0.5%（v/v）甲醇培养基稀释至初始od
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=0.05，接种于装有100 ml delft+0.5%（v/v）甲醇培养基的250 ml摇瓶中，
均在33℃、35℃、37℃、220 rpm条件下继续培养，每组设置3个平行，待甲醇消耗完后离心菌体，经洗涤、离心、烘干后获得其干重（dcw），并计算其甲醇利用率。结果如表1所示。
29.表1、p. pastoris shtx-33与亲本p. pastoris htx-33在不同温度、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下甲醇到生物量的转化率
30.从表中可知，p. pastoris shtx-33的甲醇利用率均高于亲本p. pastoris htx-33，且随着温度的升高，差异越发明显。经分析，在33℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下，p. pastoris shtx-33对比亲本p. pastoris htx-33，其甲醇利用率无明显差异；在35℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下，p. pastoris shtx-33对比亲本p. pastoris htx-33，其甲醇利用率提高18.45%；在37℃、delft+0.5%（v/v）甲醇条件下，p. pastoris shtx-33对比亲本p. pastoris htx-33，其甲醇利用率提高24.1%。这些数据表明p. pastoris shtx-33具有鲁棒性和高甲醇转化率，在同等条件下能够实现较高的甲醇到生物量的转化率，可解决目前工业发酵过程中菌株甲醇转化率低的问题，具有良好的工业应用化前景。

技术特征：
1.一种耐高温且高甲醇转化率的巴斯德毕赤酵母菌株（pichia pastoris）shtx-33，其特征在于，其保藏号为cgmcc no.27346。2.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株在微生物蛋白或饲料生产中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其中用甲醇作为唯一碳源和能量来源发酵所述毕赤酵母菌株。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵用的培养基中甲醇添加量体积比0.3-0.6%。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养基以delft基本盐培养基作为基础培养基，其组分：7.5 g/l硫酸铵、14.4 g/l磷酸二氢钾、0.5 g/l七水硫酸镁，培养基初始ph值为6.5，使用之前在121℃下灭菌20 min。6.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，发酵的培养条件为30-40℃。7.如权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，发酵的培养条件为37℃、200-240 rpm。8.一种培养如权利要求1所述的毕赤酵母菌株的方法，其特征在于以甲醇作为碳源和能量来源发酵所述毕赤酵母菌株。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵的培养条件为30-40℃。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵的培养条件为37℃、200-240 rpm。

技术总结
本发明属于微生物领域和生物技术领域，提供了一株耐高温高甲醇转化率的毕赤酵母菌株。在本发明中，利用原生质体融合的方法，将高甲醇利用菌株Pichia pastorisHTX-33（CGMCC NO.25207）与来自宁夏银川源石酒庄葡萄园的腐木中筛选得到的耐高温的曼氏毕赤酵母（Pichia manshurica）菌株进行融合，得到一株耐高温且高效利用甲醇的杂合子，菌种鉴定为巴斯德毕赤酵母菌株，即为本发明的菌株，其能够在37℃条件下，以甲醇为唯一碳源实现高生物量生长以及高甲醇利用，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。以及成本低等优势。以及成本低等优势。


技术研发人员：吴信 刘书帆 孟娇 刘曙光 鲍彤彤
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/9/9