StSABP2基因及其表达载体在抗早疫病中的应用

stsabp2基因及其表达载体在抗早疫病中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及stsabp2基因及其表达载体在抗早疫病中的应用。


背景技术：

2.马铃薯早疫病是由茄链格孢(alternaria solani)引起的严重危害马铃薯叶片、块茎的死体营养型病原菌，可使马铃薯叶片黄化，严重时可使整个植株坏死，严重影响了马铃薯的产量与品质。
3.目前，对马铃薯早疫病的防治主要采用化学农药进行防治，如多菌灵、百菌清、代森锰锌、苯醚甲环唑等，但过多使用农药会导致病原菌产生耐药性，还会破坏自然环境的生态平衡和影响人类的身体健康。而采用基因工程方法提高植物抗病性是减少农药的使用和提高农作物经济效益的有效途径。但目前并没有有效抗马铃薯早疫病的抗性基因。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了stsabp2(马铃薯水杨酸结合蛋白2)基因及其表达载体在抗早疫病中的应用。本发明提供的stsabp2基因可以抵抗茄链格孢的侵染，从而可以抗早疫病。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了stsabp2基因在抗早疫病中的应用，所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述早疫病的病原菌包括：茄链格孢(alternariasolani)。
8.优选的，所述stsabp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明提供了一种stsabp2基因的表达载体，所述表达载体包括stsabp2基因和基础载体；所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.优选的，所述基础载体包括pcambia3301载体。
11.本发明提供了一种表达stsabp2基因的重组菌，所述重组菌包括上述技术方案所述的表达载体。
12.本发明提供了上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的重组菌在抗早疫病中的应用。
13.优选的，所述早疫病的病原菌包括：茄链格孢。
14.本发明提供了上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的重组菌在构建抗早疫病的转基因植物中的应用。
15.优选的，所述早疫病的病原菌包括：茄链格孢。
16.有益效果：
17.本发明提供了stsabp2基因在抗早疫病中的应用，所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明通过将stsabp2基因导入目的植物中，证明了
stsabp2基因可以抵抗茄链格孢的侵染，利用该特性可以构建抗早疫病的转基因植物，培育抗病品种，对防治马铃薯早疫病具有重要的科学意义和应用价值。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
19.图1为pcambia3301-stsabp2表达载体的部分示意图；
20.图2为转stsabp2基因烟草基因组和pcambia3301-stsabp2质粒的pcr电泳图；
21.图3为转stsabp2基因烟草抗早疫病菌茄链格孢侵染图；
22.图4为转stsabp2基因烟草接种5天后sod、pod和cat酶活性及ntsod、ntpod和ntcat基因表达水平变化；
23.图5为转stsabp2基因烟草接种5天后ntsod、ntpod和ntcat基因表达水平变化；
24.图6为转stsabp2基因烟草接种5天后ntpr1、ntpr2和ntpr5基因表达水平变化。
具体实施方式
25.本发明提供了stsabp2基因在抗早疫病中的应用，所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：meankkqgihfvlvh gaghggwcwyklkplledaghkvtaldlaasgidlrkleqlhtlhdytlpllelmeslpqeekvilvghslggmnlglamekypkkiyaavfltafmpdsihissyvlnqynertpaenwldtqflpygtpeepltsmtfgpkflayklyqlsptedlalglslvrtsslfledlskakyftdegyesvkrvyivctedkgiskefqqwqidnigvteakeikgadhmvmlsmpkklcdtlleiadkyn。
26.本发明所述stsabp2基因的核苷酸序列优选如seq id no.2所示，具体如下：5
’‑
atggaagctaacaagaaacaaggaatacattttgttttggtacatgg tgcagggcatggaggttggtgttggtacaagctaaaaccattgctagaggatgcaggccacaaggttactgctcttgacttagcagcctctggcattgacttgaggaaactagagcaacttcatacacttcatgattacactttgccattgttggaattgatggaatctcttccacaagaggagaaagtcatactagtggggcatagtcttggtggtatgaatttgggacttgctatggaaaaatacccaaaaaagatctatgctgctgttttcttgactgctttcatgcctgattctattcacatctcctcctatgttttgaatcagtacaatgaacggacaccagcagagaattggttagatacccaatttttaccatatggtacccctgaagagccacttacatctatgacttttggtcccaaatttttggcttacaagctctaccagttaagccctactgaggatcttgcattaggattatcattggtgagaacaagttctctgtttctggaagatttgtcgaaggcgaagtatttcacagatgaaggatatgaatcagtgaagagagtttatatagtgtgtacagaggataaaggcatatcaaaagaattccaacaatggcaaattgacaacattggtgtcactgaagcaaaggaaattaaaggtgctgatcatatggtaatgctaagtatgccaaaaaaactttgtgacactctcttggagattgccgataaatacaattga-3’。
27.在本发明中，所述早疫病的病原菌优选包括：茄链格孢(alternaria solani)。
28.本发明将stsabp2基因导入目的植物中，证明了stsabp2基因可以抵抗茄链格孢菌的侵染，利用该特性可以构建抗早疫病的转基因植物。本发明对stsabp2基因的适用植物没有要求，只要待转化的植物适合进行基因的转化操作即可，所述植物优选包括双子叶植物或单子叶植物，进一步优选包括马铃薯或烟草，更优选包括烟草。
29.本发明还提供了一种stsabp2基因的表达载体，所述表达载体包括stsabp2基因和基础载体；所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
30.在本发明中，所述stsabp2基因的核苷酸序列优选如seq id no.2所示；所述基础载体优选包括pcambia3301载体；所述stsabp2基因优选位于基础载体的nco i和bste ii酶切位点之间。
31.本发明还提供了一种表达stsabp2基因的重组菌，所述重组菌包括上述技术方案所述的表达载体。在本发明中，所述重组菌的菌体优选包括农杆菌；所述农杆菌优选包括gv3101农杆菌。
32.本发明还提供了上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的重组菌在抗早疫病中的应用。在本发明中，所述早疫病的病原菌优选包括：茄链格孢。
33.本发明还提供了上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的重组菌在构建抗早疫病的转基因植物中的应用。在本发明中，所述早疫病的病原菌优选包括：茄链格孢；所述植物优选包括双子叶植物或单子叶植物，进一步优选包括马铃薯或烟草，更优选包括烟草。
34.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的stsabp2基因及其表达载体在抗早疫病中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
35.实施例1stsabp2基因的克隆与生物学分析
36.使用trizol试剂，从0.1g马铃薯叶片中提取总rna，采用transcript one-step gdna removal and cdna synthesis supermix transscript反转录得到c dna。设计马铃薯stsabp2基因上游引物stsabp2-f：5
’‑
atggctgtagttt caaaaatgactg-3’(seq id no.3)和下游引物stsabp2-r：5
’‑
ctacttc ttttccattgatcc-3’(seq id no.4)。以马铃薯cdna为模板，进行rt-pcr扩增，扩增反应体系为：25μl 2
×
super pfx mastermix、2.5μl stsabp2-f、2.5μl stsabp2-r、1μl cdna和19μl ddh2o，共50μl体系；扩增反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min。扩增得到的pcr产物由生工生物工程股份有限公司的胶回收试剂盒进行纯化，操作步骤按照说明书进行，得到纯化后的pcr产物。将纯化后的pcr产物送至生工生物工程股份有限公司进行测序验证，得到了全长795bp的基因序列。经过与其他物种的脱氧核苷酸进行序列比对，得到了序列为马铃薯stsabp2基因的orf序列(seq id no.2)。通过ncbi网站(ht tps://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索genbank登录号(oq561748)，获得stsab p2全长cdna序列信息。
37.实施例2stsabp2基因的植物表达载体构建
38.在马铃薯stsabp2基因序列的5’端和3’分别加入了nco i和bste ii酶切位点。加入酶切位点的引物序列分别为：bp2-f：f：(seq id no.5)和bp2-r：r：(seq id no.6)。下划线ccatgg为nco i酶切位点，下划线ggtacc为bste ii酶切位点，加粗的和为保护碱基。扩增的反应体系和反应程序同实例1。使用nco i和bste ii限制性内切酶对stsabp2基因和植物过表达载体pcambia3301进行酶切，对酶切后的产物进行纯化，使用t4连接酶将stsabp2基因与pcambia3301进行连接，得到含有stsabp2基因的植物过表达载体pcambia3301-stsabp2，载
体的部分示意图见图1。
39.实施例3stsabp2基因转化农杆菌
40.农杆菌感受态菌株为gv3101，实施例2构建的重组质粒pcambia3301-stsabp2带有卡那霉素筛选抗性，重组菌的构建方法如下：
41.将农杆菌感受态置于冰上，吸取2μl重组质粒pcambia3301-stsabp2于50μl农杆菌感受态中，冰上静止30min，静止完成后置于液氮中2min，37℃热激2min，液氮2min，冰上静置2min，加入300μl lb液体培养基，28℃，200r/min摇晃3h，8000r/min离心2min收集菌体，将其均匀涂布在带有卡那霉素(浓度为50mg/l)抗性的lb固体培养皿中，置于28℃培养箱中2～3d，筛选出转化成功的转化用农杆菌单菌落。
42.实施例4农杆菌侵染液的制备
43.将实施例3构建的含有重组质粒pcambia3301-stsabp2的农杆菌菌液在带有kan抗性的lb培养皿中划线复苏，挑取白色单菌落于50ml lb液体培养基中，28℃，200r/min培养od
600
至0.6～0.8，4000r/min离心20min，去除上清，使用ms液体培养基进行重悬，得到农杆菌侵染液。
44.实施例5转基因stsabp2烟草的获得
45.本实验所用烟草种子为市售种子，所用培养基为：ms培养基购自北京索莱宝科技有限公司；共培培养基的配方为：以ms培养基为基础培养基，还仅含有naa 2mg/l和6-ba 0.5mg/l，ph值为5.8；愈伤组织诱导培养基的配方为：以ms培养基为基础培养基，还仅含有naa 2mg/l、6-ba 0.5mg/l和timentin 200mg/l，ph值为5.8；抗性苗生根培养基的配方为：以ms培养基为基础培养基，还仅含有timentin 200mg/l，ph值为5.8；lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l、nacl 10g/l和酵母粉5g/l，ph值为7.0。
46.在超净工作台中使用灭菌剪刀将组培苗烟草叶片剪成1
×
1cm大小的叶块，将叶块放入农杆菌侵染液中轻轻摇晃10min，使用无菌水冲洗4次，将侵染液冲洗干净后置于灭菌滤纸上晾干。将晾干后的叶块放入共培培养基中，28℃，黑暗培养3天。培养完成后将叶块转移至愈伤组织诱导培养基中，28℃，16h光照，8h黑暗交替培养，每20d更换一次培养基，直至长出愈伤组织。待愈伤组织分化出芽后，将分化出的芽移栽至抗性苗生根培养基中，直至抗性苗生根。
47.使用ctab法提取抗性苗与野生型烟草叶片的dna。根据重组质粒pcambia3301-stsabp2设计basta抗性基因特异性引物，上游引物basta-f：5
’‑
atgagcccagaacgacgcccggccgacatc-3’(seq id no.7)，下游引物basta-r：5
’‑
tcaaatctcggtgacgggcaggaccggacg-3’(seq id no.8)。以烟草叶片dna为模板，进行pcr扩增，反应体系为：12.5μl 2xes taq mastermix、0.5μl basta-f、0.5μl basta-r、1μl dna和10.5μl ddh2o，共25μl体系；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30，70℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。如图2所示，泳道m为dna 2000marker，泳道1(即h2o)为阴性对照，泳道2(wt)为野生型对照，泳道3(p)为质粒pcambia3301阳性对照，泳道4～11(即图2中的1～8)为转基因植株。pcr检测结果表明，泳道4～11的转基因烟草植株，stsabp2基因已经成功整合入烟草植物基因组中，表明成功获得了转stsabp2基因烟草植株。
48.实施例6
49.将实施例5构建得到的转stsabp2基因烟草植株根部的培养基冲洗干净，保持根系完整，种植在营养土和蛭石的培养土中，定期浇水、施肥，直至收获转stsabp2基因烟草植株种子；所述营养土和蛭石的体积比为3：1。
50.将收获的转stsabp2的转基因和野生型烟草种子种植在育苗盆中，所述育苗盆中营养土与蛭石的体积比为3：1，待种子萌发后，挑选根系健壮、叶片舒展的烟草幼苗移栽至单独的育苗盆中，定期浇水，培养30天。
51.将生长30天的烟草叶片接种茄链格孢菌孢悬液，所述茄链格孢菌孢悬液的活菌数为1
×
105个/ml，以同龄苗野生型烟草作为对照，在接种5天后，如图3所示，转stsabp2基因烟草的病斑面积显著低于野生型烟草的病斑面积。可以证明stsabp2基因对植物抵抗茄链格孢菌的侵染具有明显抗性。
52.以同龄苗野生型烟草作为对照，在接种5天后，分别测定抗氧化酶sod、pod和cat酶活性，测定方法如下：称取用茄链格孢孢悬液侵染5天后的野生型和转stsabp2基因烟草叶片分别于预冷的研钵中，加入1ml 0.05m ph值为7.8的磷酸缓冲液在冰浴下研磨成匀浆，加缓冲液终体积为5ml，4℃，10000rpm离心10min，上清液即为sod、pod和cat粗酶液。
53.sod酶活性测定：取4ml sod反应液，加入50μl粗酶液，加入50μl核黄素溶液，立即置于4000lx的荧光灯下进行光还原反应，反应时间为15min，反应结束后立即用锡纸遮光，终止反应。以磷酸缓冲液代替粗酶液作为对照；以磷酸缓冲液作为空白调零点，在560nm波长下比色皿测定od值；根据公式计算，sod活性(u/g
·
fw)＝[(ack-ae)
×
vt]/(1/2ack
×w×
vs)。其中ack为对照管的吸光值，ae为样品管的吸光值，vt为酶液总体积(ml)，w为样品鲜重(g)，vs为测定时酶液用量(ml)。
[0054]
pod酶活性测定：取2.9ml pod反应液和0.1ml酶液于试管中，充分混合后，34℃水浴反应3min，反应完毕后加入20μl 20％三氯乙酸终止酶活性，测定od
470
在40s的变化。以pbs代替酶液为对照调零；根据公式计算，pod活性(u/g
·
fw)＝(
△
od470
×
vt)/(w
×
vs
×
0.01
×
t)；其中
△
od
470
为反应时间内的吸光度变化，vt为酶液总体积(ml)，w为样品鲜重(g)，vs为测定时酶液用量(ml)，t为反应时间(min)。
[0055]
cat酶活性测定：取2.8ml cat反应液于试管中，加入0.2ml粗酶液，充分混合后，测定od
240
在40s内的变化，以pbs为对照调零；根据公式计算，cat活性(u/g
·
fw)＝(
△
od240
×
vt)/(w
×
vs
×
0.01
×
t)；其中
△
od
240
为反应时间内的吸光度变化，vt为酶液总体积(ml)，w为样品鲜重(g)，vs为测定时酶液用量(ml)，t为反应时间(min)。测定结果如图4所示，转stsabp2基因烟草的sod、pod和cat酶活性显著高于对照植株。
[0056]
以同龄苗野生型烟草作为对照，在接种5天后，分别测定抗氧化酶相关基因ntsod、ntpod和ntcat的表达水平，测定方法如下：使用trizol法提取野生型与转stsabp2基因烟草叶片的rna，使用cdna合成试剂盒反转录为cdna(购自北京全式金生物技术有限公司)。设计烟草ntactin基因引物，上游引物：5
’‑
ggaaacatagtgctcagtggtg-3’(seq id no.9)，下游引物basta-r：5
’‑
gctgagggaagccaagatag-3’(seq id no.10)；ntsod基因引物：上游引物：5
’‑
tggacttacacctggacttcatg-3’(seq id no.11)，下游引物basta-r：5
’‑
gcatgacggatttcatcttcagg-3’(seq id no.12)；ntpod基因引物：上游引物：5
’‑
ggatcaaaggcaacgtactgatg-3’(seq id no.13)，下游引物basta-r：5
’‑
tctcagtttgagtcccatctgtg-3’(seq id no.14)；ntcat基因引物：上游引物：5
’‑
gctgtcaagttctacaccagaga-3’(seq id no.15)，下游引物basta-r：5
’‑
cctccaattctcctggatatggg-3’(seq id no.16)。以烟草叶片cdna为模板，以烟草ntactin基因为内参进行qrt-pcr扩增，反应体系为：5μl 2
×
magicsybr mastermix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、4μl cdna，共10μl体系；反应程序为：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环。测定结果如图5所示，转stsabp2基因烟草的ntsod、ntpod和ntcat表达水平显著高于对照植株。
[0057]
以同龄苗野生型烟草作为对照，在接种5天后，测定sa信号通路相关抗病基因ntpr1、ntpr2和ntpr5基因的表达，测定方法如下：设计烟草ntpr1基因引物，上游引物：5
’‑
acctggaggatcatagttgcaag-3’(seq id no.17)，下游引物basta-r：5
’‑
gtgtggacactatactcaggtgg-3’(seq id no.18)；ntpr2基因引物，上游引物：5
’‑
agggatcttagcgaataccaacc-3’(seq id no.19)，下游引物basta-r：5
’‑
agacattggctaagagtggaagg-3’(seq id no.20)；ntpr5基因引物，上游引物：5
’‑
tctctcatcagtccttttggtgg-3’(seq id no.21)，下游引物basta-r：5
’‑
attcttcatcttcctcgtctccg-3’(seq id no.22)。测定方法、反应程序及反应体系同ntsod、ntpod和ntcat基因表达水平的测定。测定结果如图6所示，转stsabp2基因烟草中的ntpr1、ntpr2和ntpr5表达水平显著高于对照植株。可以证明stsabp2基因可激活植物抗氧化系统，并提高sa信号通路相关抗病基因的表达，从而提高植物对茄链格孢的抗性。
[0058]
综上所述，本发明证明了stsabp2基因可以抵抗茄链格孢的侵染，利用该特性可以构建抗早疫病的转基因植物，培育抗病品种，对防治马铃薯早疫病具有重要的科学意义和应用价值。
[0059]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.stsabp2基因在抗早疫病中的应用，所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述早疫病的病原菌包括：茄链格孢(alternariasolani)。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述stsabp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。4.一种stsabp2基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括stsabp2基因和基础载体；所述stsabp2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述基础载体包括pcambia3301载体。6.一种表达stsabp2基因的重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求4或5所述的表达载体。7.权利要求4或5所述的表达载体或权利要求6所述的重组菌在抗早疫病中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述早疫病的病原菌包括：茄链格孢。9.权利要求4或5所述的表达载体或权利要求6所述的重组菌在构建抗早疫病的转基因植物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述早疫病的病原菌包括：茄链格孢。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及StSABP2基因及其表达载体在抗早疫病中的应用。本发明通过将StSABP2基因导入目的植物中，证明了StSABP2基因可以抵抗茄链格孢的侵染，利用该特性可以构建抗早疫病的转基因植物，培育抗病品种，对防治马铃薯早疫病具有重要的科学意义和应用价值。学意义和应用价值。学意义和应用价值。


技术研发人员：李倩 朱杰华 杨志辉 赵冬梅 张岱 潘阳 王金辉 赵益 段晓晔 刘士鹏
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/9