一种1,6-二炔类化合物在制备线粒体荧光探针中的应用

1.本技术涉及一种1,6-二炔类化合物在制备线粒体荧光探针中的应用，属于生物化学领域。


背景技术：

2.小分子荧光探针广泛用于活细胞成像，从对小信号分子的具体识别到人类健康，可以用来探索生命科学当中的“黑匣子”。由于小分子荧光探针具有结构简单、选择性高、灵敏度高、无创性和适用于活体系统的实时分析等特点，在荧光显微镜、新开发的荧光成像模式和基于超分辨率技术的活细胞成像中越来越重要。其中，荧光素、香豆素、罗丹明、花菁素、bodipys及其衍生物为探索小分子、重要的阳离子、阴离子、金属离子和生物大分子在生物学研究中的复杂作用提供了很大的帮助。这些分子虽然强大但也存在一些缺陷，如光漂白、光毒性和高背景等。现有探针的固有局限性和未来对生物学研究的进一步需求，设计和合成多种多样的荧光探针是十分必要的。
3.线粒体，通常被称为细胞的“能量工厂”，是真核细胞最重要的细胞器之一。线粒体的工作多种多样但相互关联，包括生成三磷酸腺苷(atp)、平衡活性氧(ros)和调节细胞代谢过程、自噬和凋亡等。线粒体功能异常与许多疾病有关，如角膜炎、糖尿病、神经退行性疾病(帕金森病和阿尔兹海默症等)。由于线粒体的重要作用，以线粒体为靶向的荧光探针的活细胞成像已被广泛应用于研究线粒体的结构和功能。虽然这一领域已经取得了很大的进展，但仍存在一些局限性，特别是探针设计策略的局限性。由于阳离子染料的膜电位为负(-180mv)，通常被用来靶向线粒体。然而阳离子染料会变膜电位，改变线粒体和细胞的稳态。因此，非侵入、灵敏的荧光探针仍是人们迫切需要的。


技术实现要素：

4.根据本技术的一个方面，提供了一种1,6-二炔类化合物在制备线粒体荧光探针中的应用。
5.一种1,6-二炔类化合物在制备线粒体荧光探针中的应用，所述1,6-二炔类化合物具有式ⅰ所示的结构式：
[0006][0007]
其中，x选自氮原子、磷原子、砷原子、碲原子、硼原子；
[0008]
r’选自c1–c30
烷基、取代的c1–c30
烷基、c6–c30
芳基、取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳
基、取代的c3–c30
杂芳基、氨基、取代的氨基以及可选地被选自以下的杂原子基团插入任意位置：co、o、s、so、so2、nra、-n＝、＝n-；
[0009]
其中，r
1a
、r
4a
独立地选自氢、氘、c1–c30
烷基、取代的c1–c30
烷基、c6–c30
芳基、取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基、取代的c3–c30
杂芳基、膦基、取代的膦基、硼基、取代的硼基、硅基、取代的硅基、卤素、氨基、取代的氨基以及可选地被选自以下的杂原子基团插入任意位置：co、o、s、so、so2、nra、-n＝、＝n-；
[0010]r2a
选自c6–c30
芳基、取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基、取代的c3–c30
杂芳基、c1–c10
烯基、c1–c10
取代的烯基；
[0011]r3a
为氢、氘、c1–c30
烷基、取代的c1–c30
烷基、c1–c30
烯基、取代的c1–c30
烯基、c1–c30
炔基、取代的c1–c30
炔基、c6–c30
芳基、取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基、取代的c3–c30
杂芳基、c1–c30
环烷基、取代的c1–c30
环烷基、c1–c30
杂环烷基、取代的c1–c30
杂环烷基、膦基、卤素、硅基、硼基、锗、砷、硒以及可选地被选自以下的杂原子基团插入任意位置：co、o、s、so、so2、nra、-n＝、＝n-；
[0012]
ra独立地选自h、烷基或芳基。
[0013]
可选地，取代的c6–c30
芳基、取代的c3–c30
杂芳基中的取代基选自烷基、烯基、醛基、卤素、卤代烷基、酯基插入的烷基、烷氧基、烷硫基、取代的氨基。
[0014]
可选地，取代的c6–c30
芳基、取代的c3–c30
杂芳基中的取代基选自c1–c30
烷基、c1–c30
烯基、c1–c30
醛基、卤素、卤代c1–c30
烷基、酯基插入的c1–c30
的烷基、c1–c30
烷氧基、c1–c30
烷硫基、苯基取代的氨基。
[0015]
可选地，r’选自c6–c30
芳基、c6–c10
的烷基取代的c6–c30
芳基、“卤素取代的c6–c10
的烷基”取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基、c6–c10
的烷基取代的c3–c30
杂芳基、“卤素取代的c6–c10
的烷基”取代的c3–c30
杂芳基；优选地，r’选自c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基。
[0016]
可选地，r
1a
、r
4a
独立地选自氢、芳基、烷基取代的c6–c30
芳基、“s原子插入的烷基”取代的c6–c30
芳基、“o原子插入的烷基”取代的c6–c30
芳基、卤素取代的c6–c30
芳基、芳基取代的c6–c30
芳基、“卤素取代的烷基”取代的c6–c30
芳基、“芳基取代的氨基”取代的c6–c30
芳基、“酯基插入的烷基”取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基。
[0017]
可选地，r
1a
独立地选自苯基、叔丁基取代的苯基、ch3s-取代的苯基、ch3o-取代的苯基、萘基、苯基取代的苯基、至少一个甲基取代的苯基、cf3o-取代的苯基、br取代的苯基、“二苯基取代的氨基”取代的苯基、“酯基插入的甲基”取代的苯基、二苯并噻吩基。
[0018]
可选地，r
2a
选自c6–c30
芳基、“酯基插入的烷基”取代的c6–c30
芳基、烷基取代的c6–c30
芳基、“氧原子插入的烷基”取代的c6–c30
芳基、芳基取代的c6–c30
芳基、c3–c30
杂芳基、醛基取代的c6–c30
芳基、卤素取代的c6–c30
芳基、烯基取代的c6–c30
芳基。
[0019]
可选地，r
2a
、r5相同或不同；r
2a
、r5独立地选自苯基、萘基、“酯基插入的甲基”取代的苯基、丙基取代的苯基、菲基、“氧原子插入的甲基”取代的苯基、联苯基、噻吩基、甲醛基取代的苯基、cl取代的苯基、乙烯基取代的苯基。
[0020]
可选地，r
3a
选自氢原子、氘原子、c6–c30
芳基、“酯基插入的烷基”取代的c6–c30
芳基、至少一个烷基取代的c6–c30
芳基。
[0021]
可选地，r
3a
选自氢原子、氘原子、苯基、“酯基插入的甲基”取代的苯基、至少一个甲基取代的苯基。
[0022]
可选地，式i所示的化合物的结构式选自以下化合物：
[0023]
[0024][0025]
可选地，1,6-二炔类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0026]
含有式ⅳ和式
ⅴ
所示的化合物的原料进行反应ⅰ，得到1,6-二炔类化合物
[0027][0028]
可选地，式ⅳ和式
ⅴ
所示的化合物的摩尔比为1:1～5。
[0029]
可选地，反应ⅰ在酸试剂的存在下进行。
[0030]
可选地，所述酸试剂包括对甲基苯磺酸、苯基磺酸、对硝基苯磺酸、甲基磺酸、三氯化铁、三氯化铝；
[0031]
可选地，反应ⅰ的温度为25℃～100℃；
[0032]
反应ⅰ的时间为0.1h～48h。
[0033]
可选地，式ⅳ所示的化合物的制备方法包括以下步骤：
[0034]
含有式ⅵ和式ⅶ所示的化合物的原料进行反应ⅳ，得到式ⅳ所示的化合物
[0035][0036]
可选地，式ⅵ和式ⅶ所示的化合物的摩尔比为1:1～5。
[0037]
可选地，所述反应ⅳ在亲核取代试剂的存在下进行反应；所述亲核取代试剂包括正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂、甲基锂、二异丙基氨基锂、双三甲基硅基胺基锂。
[0038]
可选地，反应ⅳ的温度为-78℃～50℃；所述反应的时间为0.1h～24h。
[0039]
可选地，将含有所述1,6-二炔类化合物、小鼠成纤维细胞的培养皿，孵育。
[0040]
可选地，所述1,6-二炔类化合物的溶液体积为1μl～1000μl。
[0041]
可选地，所述1,6-二炔类化合物的溶液浓度为1μm～1000μm。
[0042]
可选地，孵育的条件如下：
[0043]
温度为5℃～50℃；
[0044]
时间为0.1h～48h。
[0045]
可选地，所述1,6-二炔类化合物在制备小鼠成纤维细胞的线粒体荧光探针中的应用。
[0046]
可选地，所述1,6-二炔类化合物在制备小鼠单核巨噬细胞白血病细胞或her2-乳腺癌过表达细胞或人肝癌细胞株的线粒体荧光探针中的应用。
[0047]
根据本技术的第二个方面，提供了一种苯并异吲哚二聚化合物作为线粒体荧光探针的应用。
[0048]
一种苯并异吲哚二聚化合物作为线粒体荧光探针的应用；
[0049]
所述苯并异吲哚二聚化合物由上述任一项所述1,6-二炔类化合物在细胞孵育中产生。
[0050]
可选地，所述苯并异吲哚二聚化合物选自具有式ii所述的结构式：
[0051][0052]
可选地，式ii中r1、r4同式ⅰ中r
4a
；
[0053]
式ii中r7、r8同式ⅰ中r
3a
；
[0054]
式ii中r3、r6同式ⅰ中r
2a
；
[0055]
式ii中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8满足以下任意一个或者多个条件：
[0056]
(i)r1、r4相同；
[0057]
(ii)r2、r5相同；
[0058]
(iii)r3、r6相同；
[0059]
(iv)r7、r8相同。
[0060]
可选地，所述苯并异吲哚二聚化合物的激发波长为220nm～1000nm。
[0061]
可选地，所述苯并异吲哚二聚化合物的发射波长为400nm～800nm。
[0062]
可选地，细胞孵育的条件如下：
[0063]
温度为5℃～50℃；
[0064]
时间为0.1h～48h。
[0065]
根据本技术的第三个方面，提供了1,6-二炔类化合物在检测呼吸链中酶的缺失的应用。
[0066]
一种1,6-二炔化合物在检测呼吸链中酶缺失的应用。
[0067]
可选地，式i所示的化合物的核磁共振测试结果如下表：
[0068]
[0069]
[0070][0071]
1、mp-1探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0072]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0073]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0074]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-1(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550-600nm。
[0075]
2、mp-2探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0076]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0077]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0078]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-2(20μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为488nm，发射波长为500nm-540nm。
[0079]
3、mp-3探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0080]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0081]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0082]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入100微升探针mp-3(50μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为488nm，发射波长为600nm-650nm。
[0083]
4、mp-4探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0084]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0085]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0086]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入20微升探针mp-4(100μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0087]
5、mp-5探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0088]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0089]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0090]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-5(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0091]
6、mp-6探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0092]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0093]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0094]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-6(10um)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0095]
7、mp-7探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0096]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0097]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉
素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0098]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-7(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0099]
8、mp-8探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0100]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0101]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0102]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-8(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0103]
9、mp-9探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0104]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0105]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0106]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲盐溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-9(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0107]
10、mp-1探针分子对l292细胞线粒体共定位荧光效果测试：
[0108]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0109]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0110]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-1(10μm)和线粒体定位染料(mitotracker green)5μm与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。经测试并计算，得出皮尔逊相关系数大于0.9。表明本发明的探针分子能很好的定位线粒体。
[0111]
11、mp-3探针分子对l292细胞线粒体共定位荧光效果测试：
[0112]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0113]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0114]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细
胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-3(10μm)和线粒体定位染料(mitotracker green)5μm与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。经测试并计算，得出皮尔逊相关系数大于0.9。表明本发明的探针分子能很好的定位线粒体。
[0115]
12、mp-1探针分子对其他细胞线粒体荧光效果测试：
[0116]
细胞系：raw 264.7cell(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)；skbr3 cell(her2-乳腺癌过表达细胞)；huh-7cell(人肝癌细胞株)。
[0117]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0118]
细胞成像实验：我们将以上三种细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在不同细胞培养皿中分别加入200微升探针mp-1(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。该实验表明本发明的荧光探针在大多数微环境中具有良好的适应性。
[0119]
13、细胞静默实验1
[0120]
将细胞在成像培养皿中培养6h，然后用cytc-290(设计的静默sirna)或者非靶向rna处理细胞作用一定时间后，在共聚焦激光扫描显微镜下进行活细胞成像。经过ctyc-290处理12小时以后hoechst 33342和mtg染色良好，但大约有10％的细胞不能被mp-1所标记。在用ctyc-290处理18小时以后大约有30％的细胞不能被mp-1所标记。相比之下，用非靶向rna所做的对照组mp-1的染色效果依旧良好。该结果表明，探针mp-1可以有效反映呼吸链的活性，用于检测呼吸链中酶的缺失。
[0121]
14、细胞静默实验2
[0122]
将细胞在成像培养皿中培养6h，然后用cytc-436(设计的静默sirna)或者非靶向rna处理细胞作用一定时间后，在共聚焦激光扫描显微镜下进行活细胞成像。经过ctyc-436处理6小时以后hoechst 33342和mtg染色良好，但大约有5％的细胞不能被mp-1所标记。相比之下，用非靶向rna所做的对照组mp-1的染色效果依旧良好。该结果表明，探针mp-1可以有效反映呼吸链的活性，用于检测呼吸链中酶的缺失。
[0123]
本技术能产生的有益效果包括：
[0124]
1)本技术对1,6-二炔类化合物发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域。
[0125]
2)本技术的苯并异吲哚二聚化合物，具有不同的激发波长和发射波长，可应对不同细胞线粒体荧光探针的需要。
[0126]
3)本技术的苯并异吲哚二聚化合物，作为探针分子能很好的定位线粒体。
[0127]
4)本技术的苯并异吲哚二聚化合物，作为探针分子在大多数微环境中具有良好的适应性。
附图说明
[0128]
图1为苯并吲哚二聚物的质谱谱图。
[0129]
图2为细胞裂解提取物的质谱谱图。
具体实施方式
[0130]
下面结合实施例详述本技术，但本技术并不局限于这些实施例。
[0131]
如无特别说明，本技术的实施例中的原料均通过商业途径购买。
[0132]
本技术的实施例中分析方法如下：
[0133]
利用共聚焦荧光显微镜lsm 780蔡司仪器进行荧光分析。
[0134]
利用thermo fisher scientific ltq fticr-ms仪器进行质谱分析。
[0135]
hank’s缓冲溶液为1.26mm cacl2,0.49mm mgcl2,0.41mm mgso4,5.33mm kcl,0.44mm kh2po4,4.17mm nahco3,138mm nacl,0.34mm na2hpo4,5.55mm葡萄糖,ph＝7.4。
[0136]
静默sirna(cytc-290、cytc-436)购买于苏州吉玛基因股份有限公司。
[0137]
实施例1
[0138]
mp-1探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0139]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0140]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0141]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-1(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550-600nm。
[0142]
实施例2
[0143]
mp-2探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0144]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0145]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0146]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-2(20μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为488nm，发射波长为500nm-540nm。
[0147]
实施例3
[0148]
mp-3探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0149]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0150]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0151]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入100微升探针mp-3(50μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去
除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为488nm，发射波长为600nm-650nm。
[0152]
实施例4
[0153]
mp-4探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0154]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0155]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0156]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入20微升探针mp-4(100μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0157]
实施例5
[0158]
mp-5探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0159]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0160]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0161]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-5(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0162]
实施例6
[0163]
mp-6探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0164]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0165]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0166]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-6(10um)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0167]
实施例7
[0168]
mp-7探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0169]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0170]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0171]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入
200微升探针mp-7(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0172]
实施例8
[0173]
mp-8探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0174]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0175]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0176]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-8(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0177]
实施例9
[0178]
mp-9探针分子对l292细胞线粒体荧光效果测试：
[0179]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0180]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0181]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲盐溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-9(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。激发波长为543nm，发射波长为550nm-600nm。
[0182]
实施例10
[0183]
mp-1探针分子对l292细胞线粒体共定位荧光效果测试：
[0184]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0185]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0186]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-1(10μm)和线粒体定位染料(mitotracker green)5μm与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。经测试并计算，得出皮尔逊相关系数大于0.9。表明本发明的探针分子能很好的定位线粒体。
[0187]
实施例11
[0188]
mp-3探针分子对l292细胞线粒体共定位荧光效果测试：
[0189]
细胞系：l929细胞(小鼠成纤维细胞)。
[0190]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0191]
细胞成像实验：我们将细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在培养皿中加入200微升探针mp-3(10μm)和线粒体定位染料(mitotracker green)5μm与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。经测试并计算，得出皮尔逊相关系数大于0.9。表明本发明的探针分子能很好的定位线粒体。
[0192]
实施例12
[0193]
mp-1探针分子对其他细胞线粒体荧光效果测试：
[0194]
细胞系：raw 264.7cell(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)；skbr3 cell(her2-乳腺癌过表达细胞)；huh-7cell(人肝癌细胞株)。
[0195]
细胞培养：细胞在在co2培养箱(37℃，5％co2)中培养，培养基为dmem培养基(青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml))。
[0196]
细胞成像实验：我们将以上三种细胞培养在15mm级底部细胞培养皿上。在使用探针标记细胞之前先除去培养基，再用hank’s缓冲溶液清洗两次，除去残留的培养基。在不同细胞培养皿中分别加入200微升探针mp-1(10μm)与细胞在黑暗中孵育30分钟。用hank’s缓冲溶液洗涤细胞两次，去除残留探针培养皿中加入1毫升hank’s溶液。在激光共聚焦显微镜100倍物镜下观察细胞。该实验表明本发明的荧光探针在大多数微环境中具有良好的适应性。
[0197]
实施例13
[0198]
细胞静默实验1
[0199]
将细胞在成像培养皿中培养6h，然后用cytc-290(设计的静默sirna)或者非靶向rna处理细胞。作用一定时间后，在共聚焦激光扫描显微镜下进行活细胞成像。经过ctyc-290处理12小时以后hoechst 33342和mtg染色良好，但大约有10％的细胞不能被mp-1所标记。在用ctyc-290处理18小时以后大约有30％的细胞不能被mp-1所标记。相比之下，用非靶向rna所做的对照组mp-1的染色效果依旧良好。该结果表明，探针mp-1可以有效反映呼吸链的活性，用于检测呼吸链中酶的缺失。
[0200]
实施例14
[0201]
细胞静默实验2
[0202]
将细胞在成像培养皿中培养6h，然后用cytc-436(设计的静默sirna)或者非靶向rna处理细胞作用一定时间后，在共聚焦激光扫描显微镜下进行活细胞成像。经过ctyc-436处理6小时以后hoechst 33342和mtg染色良好，但大约有5％的细胞不能被mp-1所标记。相比之下，用非靶向rna所做的对照组mp-1的染色效果依旧良好。该结果表明，探针mp-1可以有效反映呼吸链的活性，用于检测呼吸链中酶的缺失。
[0203]
质谱分析
[0204]
取上述实施例1的l292细胞，把培养基全部吸掉，加8毫升去离子水，1小时后，让细胞吸水涨破。然后收集破碎液，20khz超声10分钟再拿去2500转每分钟，涡旋振荡10分钟，最后用二氯甲烷萃取。取出有机相，然后加1/1000的三氟乙酸进行质谱分析。
[0205]
由图1可得苯并吲哚二聚物的分子量为483.26(c
36h23n2+
)，由图2可得细胞裂解物中可得分子量为483.22。该实验结果表明1,6-二炔化合物在细胞中转化成线粒体探针苯并
吲哚二聚化合物。
[0206]
以上所述，仅是本技术的几个实施例，并非对本技术做任何形式的限制，虽然本技术以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本技术，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

技术特征：
1.一种1,6-二炔类化合物在制备线粒体荧光探针中的应用，所述1,6-二炔类化合物具有式ⅰ所示的结构式：其中，x选自氮原子、磷原子、砷原子、碲原子、硼原子；r’选自c1–
c
30
烷基、取代的c1–
c
30
烷基、c6–
c
30
芳基、取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基、取代的c3–
c
30
杂芳基、氨基、取代的氨基以及可选地被选自以下的杂原子基团插入任意位置：co、o、s、so、so2、nr
a
、-n＝、＝n-；其中，r
1a
、r
4a
独立地选自氢、氘、c1–
c
30
烷基、取代的c1–
c
30
烷基、c6–
c
30
芳基、取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基、取代的c3–
c
30
杂芳基、膦基、取代的膦基、硼基、取代的硼基、硅基、取代的硅基、卤素、氨基、取代的氨基以及可选地被选自以下的杂原子基团插入任意位置：co、o、s、so、so2、nr
a
、-n＝、＝n-；r
2a
选自c6–
c
30
芳基、取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基、取代的c3–
c
30
杂芳基、c1–
c
10
烯基、c1–
c
10
取代的烯基；r
3a
为氢、氘、c1–
c
30
烷基、取代的c1–
c
30
烷基、c1–
c
30
烯基、取代的c1–
c
30
烯基、c1–
c
30
炔基、取代的c1–
c
30
炔基、c6–
c
30
芳基、取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基、取代的c3–
c
30
杂芳基、c1–
c
30
环烷基、取代的c1–
c
30
环烷基、c1–
c
30
杂环烷基、取代的c1–
c
30
杂环烷基、膦基、卤素、硅基、硼基、锗、砷、硒以及可选地被选自以下的杂原子基团插入任意位置：co、o、s、so、so2、nr
a
、-n＝、＝n-；r
a
独立地选自h、烷基或芳基。2.根据权利要求1所述的1,6-二炔类化合物，其特征在于，取代的c6–
c
30
芳基、取代的c3–
c
30
杂芳基中的取代基选自烷基、烯基、醛基、卤素、卤代烷基、酯基插入的烷基、烷氧基、烷硫基、取代的氨基；优选地，取代的c6–
c
30
芳基、取代的c3–
c
30
杂芳基中的取代基选自c1–
c
30
烷基、c1–
c
30
烯基、c1–
c
30
醛基、卤素、卤代c1–
c
30
烷基、酯基插入的c1–
c
30
的烷基、c1–
c
30
烷氧基、c1–
c
30
烷硫基、苯基取代的氨基；优选地，r’选自c6–
c
30
芳基、c6–
c
10
的烷基取代的c6–
c
30
芳基、“卤素取代的c6–
c
10
的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基、c6–
c
10
的烷基取代的c3–
c
30
杂芳基、“卤素取代的c6–
c
10
的烷基”取代的c3–
c
30
杂芳基；优选地，r’选自c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基；优选地，r
1a
、r
4a
独立地选自氢、芳基、烷基取代的c6–
c
30
芳基、“s原子插入的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、“o原子插入的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、卤素取代的c6–
c
30
芳基、芳基取代的c6–
c
30
芳基、“卤素取代的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、“芳基取代的氨基”取代的c6–
c
30
芳基、“酯基插入的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基；
优选地，r
1a
独立地选自苯基、叔丁基取代的苯基、ch3s-取代的苯基、ch3o-取代的苯基、萘基、苯基取代的苯基、至少一个甲基取代的苯基、cf3o-取代的苯基、br取代的苯基、“二苯基取代的氨基”取代的苯基、“酯基插入的甲基”取代的苯基、二苯并噻吩基；优选地，r
2a
选自c6–
c
30
芳基、“酯基插入的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、烷基取代的c6–
c
30
芳基、“氧原子插入的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、芳基取代的c6–
c
30
芳基、c3–
c
30
杂芳基、醛基取代的c6–
c
30
芳基、卤素取代的c6–
c
30
芳基、烯基取代的c6–
c
30
芳基；优选地，r
2a
、r5相同或不同；r
2a
、r5独立地选自苯基、萘基、“酯基插入的甲基”取代的苯基、丙基取代的苯基、菲基、“氧原子插入的甲基”取代的苯基、联苯基、噻吩基、甲醛基取代的苯基、cl取代的苯基、乙烯基取代的苯基；优选地，r
3a
选自氢原子、氘原子、c6–
c
30
芳基、“酯基插入的烷基”取代的c6–
c
30
芳基、至少一个烷基取代的c6–
c
30
芳基；优选地，r
3a
选自氢原子、氘原子、苯基、“酯基插入的甲基”取代的苯基、至少一个甲基取代的苯基。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式i所示的化合物的结构式选自以下化合物：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，制备线粒体荧光探针的方法包括以下步骤：将含有所述1,6-二炔类化合物、小鼠成纤维细胞的培养皿，孵育。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述1,6-二炔类化合物的溶液体积为1μl～1000μl；优选地，所述1,6-二炔类化合物的溶液浓度为1μm～1000μm；优选地，孵育的条件如下：温度为5℃～50℃；时间为0.1h～48h。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述1,6-二炔类化合物在制备小鼠成纤维细胞的线粒体荧光探针中的应用；优选地，所述1,6-二炔类化合物在制备小鼠单核巨噬细胞白血病细胞或her2-乳腺癌过表达细胞或人肝癌细胞株的线粒体荧光探针中的应用。7.一种苯并异吲哚二聚化合物作为线粒体荧光探针的应用；所述苯并异吲哚二聚化合物由权利要求1至6任一项所述的1,6-二炔类化合物在细胞孵育中产生。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述苯并异吲哚二聚化合物选自具有式ⅱ所述的结构式：
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述苯并异吲哚二聚化合物的激发波长为220nm～1000nm；优选地，所述苯并异吲哚二聚化合物的发射波长为400nm～800nm。10.一种1,6-二炔化合物在检测呼吸链中酶缺失的应用。

技术总结
本申请公开了一种1,6-二炔类化合物作为线粒体荧光探针的应用。本申请对1,6-二炔类化合物发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域；本申请的苯并异吲哚二聚化合物，具有不同的激发波长和发射波长，可应对不同细胞线粒体荧光探针的需要；本申请的苯并异吲哚二聚化合物，作为探针分子能很好的定位线粒体；本申请的苯并异吲哚二聚化合物，作为探针分子在大多数微环境中具有良好的适应性。数微环境中具有良好的适应性。数微环境中具有良好的适应性。


技术研发人员：鲍红丽 叶长青 黄蕊 朱能波
受保护的技术使用者：中国科学院福建物质结构研究所
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2023/9/12