肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法与流程

肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法
技术领域
1.本发明涉及药物检测技术领域，具体而言涉及一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法。


背景技术：

2.肝微粒体酶又称肝药酶，该系统中的主要酶系为cyp450，cyp450酶系参与生物体内源性和外源性物质的生物转化，是参与药物代谢的主要酶系，包括cyp1、cyp2、cyp3、cyp4、cyp5、cyp7和cyp8等亚族。cyp3a4是cyp450s酶系的重要亚组，在肝脏和小肠中表达最丰富，参与50％以上临床药物的i相代谢。因此，研究cyp3a4酶代谢对评价药物代谢特征及研究药物-药物之间相互作用起着重要的作用。
3.cyp3a4酶活性的改变，会使经其代谢的药物在体内的代谢减慢或增加，从而导致血药浓度的改变，反映出药物作用效果的强弱的改变甚至是否产生毒性。因此，在评价药物代谢过程中研究cyp3a4酶活性的改变具有十分重要的意义，目前主要利用体外方法进行药物代谢研究，研究代谢酶对底物的选择性代谢和底物对酶的诱导或抑制，预测体内潜在的药物相互作用等，从而可有效缩短药物研发周期。
4.在cyp3a4代谢酶研究中，咪达唑仑经cyp3a4代谢酶m位点代谢，主要代谢产物为1-羟基咪达唑仑。在国内外相关文献咪达唑仑作为cyp3a4的特征性探针底物，通过测定其在肝微粒体中其主要代谢产物1-羟基咪达唑仑的含量变化，对cyp3a4代谢酶的活性进行评价。
5.在体外代谢抑制研究过程中，常用评价酶活性体外方法为探针药物法即cocktail鸡尾酒疗法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，建立药物代谢研究模型。但cocktail法采用同一个孵育体系，统一终止反应时间，不能很好地控制每个酶的反应程度，很容易出现反应过量的现象。
6.目前报道定量检测咪达唑仑代谢物的方法有高效液相色谱，其检测方法大都为梯度洗脱，检测物质多，分离度欠佳，且操作和样品预处理方法较为繁琐，难以实现对人肝微粒体温孵体系中1-羟基咪达唑仑与咪达唑仑及其代谢产物的有效分离，无法对其进行准确定量，且定量下限较高、线性范围窄及灵敏度低等；同时文献报道的还有高效液相串联质谱检测法(lc-ms/ms法)，但方法中为梯度洗脱、分析检测时间较长等，无法实现1-羟基咪达唑仑的单独检测或分析检测时间长等。
7.因此，有必要建立一种更快速、更稳定、灵敏度高及线性范围更大分离检测方法。


技术实现要素：

8.本发明目的在于针对现有提供一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，该检测方法灵敏度高，稳定精确，且提高了分析效率。
9.为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
10.一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，
包括以下具体步骤：
11.s1、建立肝微粒体温孵体系
12.在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物预孵育，之后加入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；
13.s2、标准曲线样品及待测样品的配制
14.根据步骤s1中的肝微粒体温孵体系，配制系列浓度的标准曲线样品、质控样品及空白样品，并进行孵育；其中，底物为系列浓度的1-羟基咪达唑仑；
15.根据s1中的肝微粒体温孵体系，配制待测样品，并进行孵育，其中底物为浓度0.5μm的咪达唑仑。
16.s3、样品进样前处理
17.在步骤s2中孵育后的标准曲线样品和待测样品中加入内标物终止反应，并进行涡旋振荡、离心，之后取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入乙腈水溶液复溶，并进行封膜、摇板；
18.s4、uplc-ms/ms分析检测
19.将步骤s3处理后的样品进行uplc-ms/ms分析检测，其中，
20.uplc检测条件：
21.流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈溶液；
22.洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；
23.色谱柱：acquity uplc hss t3；
24.流速：0.4ml/min
25.保留时间：1-羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；
26.洗脱时间：1.5min
27.色谱洗脱程序为：0～1.5min流动相b的体积百分数为40％；
28.质谱条件为：
29.质谱离子源：turbo spray电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：mrm多反应离子监测；碰撞气：medium；气帘气：35psi；分辨率q1/q3：unit/unit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500v；离子化温度：500℃；采集时长：1.50min；
30.根据检测结果得到1-羟基咪达唑仑的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的1-羟基咪达唑仑浓度。
31.优选的，所述步骤s1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.01mg/ml，氯化镁溶液的孵育浓度为10mm，还原型辅酶ⅱ的孵育浓度为1mm；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。
32.优选的，所述步骤s2中，标准曲线样品浓度范围为0.005μm～5μm。
33.优选的，所述步骤s3中，内标工作溶液为100ng/ml的非那西汀；乙腈水溶液的质量分数为50％，上清液和乙腈水溶液的体积比为1:2；
34.前处理的条件如下：以2500rpm的转速涡旋振荡5min；在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心10min；以300rpm的转速摇板5min。
35.优选的，所述步骤s4中，色谱柱的规格为：长50mm
×
内径2.1μm，填充颗粒1.8μm。
36.优选的，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样量为2μl。
37.优选的，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样时间为1.5min。
38.优选的，所述步骤s4中，uplc检测条件中，柱温为40℃，自动进样器的温度为4℃。
39.优选的，所述步骤s4中，离子监测采集参数如下：
40.1-羟基咪达唑仑：母离子为342.1da；子离子为203.0da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为160volts；碰撞电压为37volts；碰撞池入口电压为12volts；
41.非那西汀：母离子为180.0da；子离子为110.3da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为71volts；碰撞电压为40volts；碰撞池入口电压为12volts。
42.本发明的有益效果在于：
43.1、本发明的uplc-ms/ms分析检测方法，在检测肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度时，通过建立包含人肝微粒体、还原型辅酶ⅱ、氯化镁溶液和pbs缓冲液在内的合理的肝微粒体孵育体系，找到代谢物浓度最高的肝微粒体孵育体系，并通过不断优化质谱检测参数，使质谱响应达到最优化的水平，结合优化不同色谱柱型号、柱温箱温度、流动相a和流动相b的比例，不同梯度及等度方法等色谱检测条件，达到降低检测限及扩大检测线性范围的效果。1-羟基咪达唑仑的最低检测限可达0.005μm，检测线性范围为0.005μm～5μm，提高分析检测的灵敏度。
44.2、本发明通过将复杂的液液提取法优化为直接蛋白沉淀法，缩短样品前处理时间及步骤，并结合优化色谱质谱参数后，缩短生物样品检测时间，极大缩短了生物样品分析检测时间，提高了检测效率。
45.3、本发明中建立的生物分析检测方法快速、专属、精确、可靠且线性范围广，符合2020版《中华人民共和国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则要求，适用于肝微粒体温孵样品中1-羟基咪达唑仑浓度的测定，具有广泛的应用前景。
附图说明
46.图1是实施例1中的uplc-ms/ms法测定人肝微粒体中待测物1-羟基咪达唑仑的标准曲线样品典型回归曲线。
47.图2是实施例1的uplc-ms/ms法测定咪达唑仑在人肝微粒体孵育中待测物1-羟基咪达唑仑的色谱图。
48.图3是实施例1的uplc-ms/ms法测定咪达唑仑在人肝微粒体孵育中内标化合物非那西汀的色谱图。
具体实施方式
49.为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
50.在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。
51.本发明提供一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，通过建立合理的肝微粒体孵育体系，结合特定的样品前处理，以及色谱和质谱条件，提高检测的灵敏度。
52.作为本发明一个示例性实施例，提供一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，包括以下具体步骤：
53.s1、建立肝微粒体温孵体系
54.在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物预孵育，之后加入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；
55.s2、标准曲线样品及待测样品的配制
56.根据步骤s1中的肝微粒体温孵体系，配制系列浓度的标准曲线样品、质控样品及空白样品，并进行孵育；其中，底物为系列浓度的1-羟基咪达唑仑；
57.根据s1中的肝微粒体温孵体系，配制待测样品，并进行孵育；其中底物为浓度0.5μm的咪达唑仑；
58.s3、样品进样前处理
59.在步骤s2中孵育后的标准曲线样品和待测样品中加入内标物终止反应，并进行涡旋振荡、离心，之后取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入乙腈水溶液复溶，并进行封膜、摇板；
60.s4、uplc-ms/ms分析检测
61.将步骤s3处理后的样品进行uplc-ms/ms分析检测，其中，
62.uplc检测条件：
63.流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈溶液；
64.洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；
65.色谱柱：acquity uplc hss t3；
66.流速：0.4ml/min
67.保留时间：1-羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；
68.色谱洗脱程序为：0～1.5min流动相b的体积百分数为40％；
69.质谱条件为：
70.质谱离子源：turbo spray电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：mrm多反应离子监测；碰撞气：meidum；气帘气：35psi；分辨率q1/q3：unit/unit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500v；离子化温度：500℃；采集时长：1.50min；
71.根据检测结果得到1-羟基咪达唑仑的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的1-羟基咪达唑仑浓度。
72.在优选的实施例中，所述步骤s1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.01mg/ml，氯化镁溶液的孵育浓度为10mm，还原型辅酶ⅱ的孵育浓度为1mm；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。
73.在人肝微粒体孵育体系中，在一定酶活性范围内，代谢物浓度高说明对应的酶活性越强，说明肝微粒体孵育体系设置的越合理。
74.因此，建立包含人肝微粒体、还原型辅酶ⅱ、氯化镁溶液和pbs缓冲液的肝微粒体孵育体系，找到代谢物浓度最高的肝微粒体孵育体系，优化方式是采用正交设计原则，针对体系中物质改变浓度检测代谢物浓度生成量。
75.具体优化过程如下：肝微粒体浓度(优化浓度0.01,0.05,0.1,0.2,0.5,1mg/ml)、氯化镁溶液(优化浓度1,10,25,50,100mm)、还原型辅酶ⅱ的浓度(优化浓度0.1,0.5,1,2,
5mm)、咪达唑仑浓度(优化孵育浓度为：0.5,1,5,10,50μm)及孵育时间(优化孵育时间为：5,10,15,30,60min)，找到代谢物浓度最高的肝微粒体孵育体系，最终确认孵育体系。
76.在优选的实施例中，所述步骤s2中，标准曲线样品浓度范围为0.005μm～5μm。
77.在优选的实施例中，所述步骤s3中，内标工作溶液为100ng/ml的非那西汀；乙腈水溶液的质量分数为50％，上清液和乙腈水溶液的体积比为1:2。
78.前处理的条件如下：以2500rpm的转速涡旋振荡5min；在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心10min；以300rpm的转速摇板5min。
79.具体前处理步骤为：孵育一定时间后，加入浓度为100ng/ml的非那西汀内标工作溶液终止反应，立即涡旋振荡(2500rpm，5min)，离心(4℃，12000rpm，10min)。之后，取上清液50μl至96孔板中，每孔加入100μl 50％乙腈水溶液复溶，封膜，摇板(300rpm，5min)，准备进行uplc-ms/ms分析。
80.在优选的实施例中，所述步骤s4中，色谱柱的规格为：长50mm
×
内径2.1μm，填充颗粒1.8μm。
81.在优选的实施例中，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样量为2μl。
82.在优选的实施例中，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样时间为1.5min。
83.在优选的实施例中，所述步骤s4中，uplc检测条件中，柱温为40℃，自动进样器的温度设定为4℃。
84.在优选的实施例中，所述步骤s4中，离子监测采集参数为：
85.1-羟基咪达唑仑：母离子为342.1da；子离子为203.0da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为160volts；碰撞电压为37volts；碰撞池入口电压为12volts。
86.非那西汀：母离子为180.0da；子离子为110.3da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为71volts；碰撞电压为40volts；碰撞池入口电压为12volts。
87.在另一个示例性的实施例中，建立生物分析方法学及验证，具体为：按照前述s1-s4的实验步骤，考察1-羟基咪达唑仑在肝微粒体中批内与批间的准确度和精密度、选择性、提取回收率、基质效应、均一性、残留、重进样重现性、样品稳定性、储备液和工作液稳定性。
88.本发明的测试方法中，在样品前处理步骤中，将复杂的液液提取法(如乙酸乙酯提取、乙醚提取等)优化为直接蛋白沉淀法(含内标的乙腈溶液)，缩短样品前处理时间及步骤，提高工作效率；在优化色谱质谱参数后，使生物样品检测时间缩短为1.5min，极大缩短生物样品分析检测时间。
89.建立包含人肝微粒体、还原型辅酶ⅱ、氯化镁溶液和pbs缓冲液的肝微粒体孵育体系，找到代谢物浓度最高的肝微粒体孵育体系，并通过不断优化cad参数、curtain gas、ion source gas1、ion source gas2等质谱检测参数，使质谱响应达到最优化水平；优化不同色谱柱型号、柱温箱温度、流动相a/流动相b的比例，不同梯度及等度方法等色谱检测条件；合理的肝微粒体孵育体系，结合优化的色谱、质谱条件，降低检测限及扩大检测线性范围。
90.为了便于更好的理解，下面结合具体实例对本发明进行进一步说明，但检测方法不限于此，且本发明内容不限于此。
91.如无特别说明，以下实施例中的原料均通过商业途径购买。
92.【实施例1】
93.1、标准品及内标
94.标准品：1-羟基咪达唑仑，分子量341.8，纯度98.8％，cayman chemical company(0589923)
95.内标物：非那西汀，分子量179.22，纯度≥98％，sigma-aldrich(bcbk9256v)。
96.2、主要仪器
97.主要仪器如表1所示
98.表1
[0099][0100]
3、分析软件
[0101]
试验所用主要软件：analyst 1.7.0uplc/ms/ms数据采集及浓度计算。
[0102]
4、建立肝微粒体孵育体系
[0103]
肝微粒体孵育体系主要从3个方面进行优化，分别是肝微粒体浓度、氯化镁溶液和还原型辅酶ⅱ的浓度，通过设计正交试验，将肝微粒体、氯化镁溶液和还原型辅酶ⅱ稀释不同浓度，比较代谢物1-羟基咪达唑仑响应确定最佳孵育条件。
[0104]
首先将氯化镁溶液和还原型辅酶ⅱ浓度固定在1mm和0.1mm，将肝微粒体稀释不同浓度梯度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.5,1mg/ml)进行孵育，确定肝微粒体最适孵育浓度为0.01mg/ml。
[0105]
再将肝微粒体和还原型辅酶ⅱ浓度固定为0.01mg/ml和0.1mm，将氯化镁溶液稀释不同浓度梯度(1,10,25,50,100mm)进行孵育，确定氯化镁溶液最适孵育浓度为10mm。
[0106]
最后通过已经确定的肝微粒体和氯化镁溶液浓度，将还原型辅酶ⅱ稀释不同浓度梯度(0.1,0.5,1,2,5mm)进行孵育，确定还原型辅酶ⅱ最适孵育浓度为1mm。
[0107]
底物咪达唑仑孵育浓度和孵育时间的选择：通过确定相关参数进行孵育，梯度设置底物咪达唑仑孵育浓度(0.05,0.1,0.5,1,2,5,10μm)和孵育时间(优化孵育时间为：5,10,15,30,60,120min)，比较代谢物1-羟基咪达唑仑浓度，在线性范围内满足最低检测需求，选择了0.5μm和25min。
[0108]
确认最优肝微粒体孵育体系为：45μl pbs缓冲溶液、5μl混合人肝微粒体(孵育浓度为0.01mg/ml)、20μl氯化镁溶液(孵育浓度为10mm)、以及底物咪达唑仑(孵育浓度为0.5μm)在37℃恒温水浴锅中预孵育5min后，加入10μl还原型辅酶ⅱ(孵育浓度为1mm)启动反应，在37℃恒温水浴锅中温孵25min。
[0109]
5、优化质谱参数
[0110]
根据1-羟基咪达唑仑的性质确定离子源模式和极性，选择合适浓度的1-羟基咪达唑仑标准品工作液，在质谱以tuning(调谐)模式下扫描分析。
[0111]
1)离子对扫描
[0112]
母离子扫描：扫描模式：q1 ms，根据1-羟基咪达唑仑相对分子质量(
±
100da)进行全扫描，选择响应较高且稳定的母离子(m/z 342.1)。
[0113]
子离子扫描：扫描模式：product ion scan，输入母离子(m/z 342.1)在m/z 50～350之间扫描，选择响应较高且稳定的子离子(m/z 203.0)。
[0114]
2)离子源优化
[0115]
离子源参数会影响待测物包括出峰时间、峰形、响应高低等，优化的参数包括去簇电压、入口电压、碰撞电压及碰撞池出口电压等质谱检测参数，其他质谱如参数碰撞气、气帘气、喷雾气、辅助加热气、喷雾电压、离子化温度参照质谱使用说明书及经验值调节，最终通过调节离子源参数，使喷雾平稳，使离子丰度提高，总灵敏度相应提高，具体优化过程如下：
[0116]
dp(去簇电压)：设定扫描范围50～400volts，设定step:20volts，扫描显示去簇电压的改变整体对离子丰度的改变不是很明显，为维护仪器最佳状态，选择dp为160volts作为最终的参数设定。
[0117]
ep(入口电压)：设定扫描范围2～40volts，设定step:5volts，扫描结果显示在ep值的改变整体上对离子丰度改变不是很明确，但在10volts时响应较高，选择入口电压10volts作为最终的参数设定。
[0118]
ce(碰撞电压)：设定扫描范围10～70volts，设定step:5volts，扫描结果显示碰撞电压(ce)值的改变对离子丰度的影响最大，呈现抛物线形式。表现在为刚开始随ce值增加离子丰度逐渐突然增加，后会突然降低。，在碰撞电压在30～40volts时响应最高，选择离子丰度最高的对应的碰撞电压37volts作为最终的参数设定。
[0119]
cxp(碰撞池出口电压)：设定扫描范围2～25volts，设定step：1volts，扫描结果显示出口电压整体对离子丰度的改变不是很明显。碰撞池出口电压为12volts时响应较高且稳定，故碰撞池出口电压参数选择12volts。
[0120]
最终使质谱响应、峰形达到最优化的水平，最优参数如表2和表3所示
[0121]
表2
[0122][0123]
表3
[0124][0125]
6、优化液相参数
[0126]
1)色谱流动相的选择
[0127]
流动相包括水和作为改性剂的乙腈、甲醇或异丙醇，通过测试进行确定，首先选用常用的超纯水作为流动相a相，甲醇作为流动相b相，色谱图峰形不佳且响应较低，且保留时间比较靠后；为优化色谱峰及保留时间，在流动相a/b相中增加甲酸，增加响应改善峰性。结果显示流动相a相为0.1％甲酸水溶液，流动相b相为0.1％甲酸乙腈溶液后峰型与基线分离较好，杂峰干扰较少，且无出现拖尾及前延。
[0128]
2)色谱柱的选择
[0129]
1-羟基咪达唑仑水溶性较好且极性较大，且，选择acquity uplc hss t3,1.8μm,2.1*50mm色谱柱。
[0130]
3)洗脱方式的选择
[0131]
通过优化液相参数包括等度洗脱、梯度洗脱以及流动相a/流动相b的比例调整待测物出峰时间、峰形及响应高低，具体优化过程如下：
[0132]
洗脱方式：分为梯度洗脱和等度洗脱，当洗脱方式为梯度洗脱时，出峰时间较靠后、基线稍微有点漂移，且因初始和最后洗脱时时间较长，采集时间较长。采用等度洗脱峰形较好、出峰时间较好且采集时间较短，选择等度洗脱。
[0133]
最优参数如下所示：
[0134]
流动相：a：0.1％甲酸水溶液；b：0.1％甲酸乙腈溶液
[0135]
洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水(10/30/30/30，v/v/v/v)
[0136]
色谱柱：acquity uplc hss t3,1.8μm,2.1*50mm
[0137]
流速：0.4ml/min
[0138]
保留时间：1-羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；
[0139]
柱温：40℃
[0140]
进样体积：2μl
[0141]
洗脱时间：1.50min
[0142]
保留时间：1-羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；
[0143]
自动进样器温度：4℃
[0144]
梯度洗脱程序如表4所示
[0145]
表4
[0146][0147]
7、方法学验证
[0148]
按照4中确认最优肝微粒体孵育体系，配制系列浓度(std1～std8)的标准曲线样品，如表5所示，并进行孵育30min；其中，底物为系列浓度的1-羟基咪达唑仑。
[0149]
表5
[0150][0151][0152]
配制质控样品(qc1～qc3)，如表6所示。
[0153]
表6
[0154][0155]
按照4中确认最优肝微粒体孵育体系，配制待测样品并进行孵育：将5μl人肝微粒体(孵育为0.01mg/ml)、20μl氯化镁溶液、20μl咪达唑仑(孵育浓度为0.5μm)工作溶液及45μlpbs加入孵育管中37℃预孵育5min，然后向管中加入10μl还原型辅酶ⅱ启动反应，37℃孵育25min。
[0156]
取孵育后标准曲线样品(std)、质控样品(qc)、试验样品20μl至对应ep管中，各加入100μl内标工作溶液(100.00ng/ml)；涡旋振荡(约2500rpm)5min，4℃条件下12000rpm离心10min。
[0157]
取上清液50μl至96孔板中，每孔加入100μl 50％乙腈水溶液复溶，封膜，摇板(300rpm，5min)，按照5和6中的最优参数进行uplc-ms/ms分析。
[0158]
所得标准曲线如图1所示，其方程为y＝1.08x+0.000189(r＝0.9979)，其中，y为待测物峰面积比内标峰面积的比值，x为测试样品的浓度。
[0159]
待测样与内标样的测试图谱分别如图2和图3所示，代入上述回归方程，得到咪达
唑仑在人肝微粒体孵育后生成代谢产物1-羟基咪达唑仑浓度为3.74μm。
[0160]
通过以上孵育体系、色谱、质谱条件的优化，降低检测限、扩大检测线性范围及优化检测步骤和时间。
[0161]
检测1-羟基咪达唑仑的最低检测限0.005μm，检测线性范围为0.005μm～5μm，生物分析时间为1.5min。
[0162]
8、1-羟基咪达唑仑在人肝微粒体中方法学验证结果
[0163]
分别考察了本发明检测方法的选择性、基质效应、线性和范围、批内和批间准确度与精密度、稳定性、回收率、残留和均一性。具体如下：
[0164]
8.1选择性
[0165]
选择性的考察为三方面：1)样品为空白基质+空白溶剂，考察空白基质是否有影响到待测物和内标的干扰峰；2)样品为空白基质+内标，考察内标化合物是否会影响待测物的检测；3)样品为最高浓度的待测物+空白溶剂，考察待测物是否会影响到内标化合物的检测。
[0166]
空白样本中内源性物质的干扰不应超过待测物定量下限(lloq)的20％和内标响应的5％。
[0167]
对应上述需考察的三个方面，制备以下样品进行测试：
[0168]
(1)i-dbk(空白肝微粒体孵育样品)样品，共重复配制6个样品
[0169]
100μl空白肝微粒体孵育液(含有5μl灭活的肝微粒体(终浓度为0.01mg/ml)，20μl氯化镁溶液(终浓度为10mm)，10μl还原型辅酶ⅱ(终浓度为1mm)，20μl 5％乙腈水溶液，用pbs补齐至100μl)中加入100μl乙腈溶液，涡旋振荡(约2500rpm)5min，4℃条件下12000rpm离心10min。取上清液50μl至96孔板中，每孔加入100μl 50％乙腈水溶液，封膜，摇板(300rpm)5min，进样分析。
[0170]
(2)i-bk样品，配制3个样品
[0171]
100μl空白肝微粒体孵育液(含有5μl灭活的肝微粒体(终浓度为0.01mg/ml)，20μl氯化镁溶液(终浓度为10mm)，10μl还原型辅酶ⅱ(终浓度为1mm)，20μl 5％乙腈水溶液，用pbs补齐至100μl)中加入100μl内标溶液(100.00ng/ml非那西汀)，涡旋振荡(约2500rpm)5min，4℃条件下12000rpm离心10min。取上清液50μl至96孔板中，每孔加入100μl 50％乙腈水溶液，封膜，摇板(300rpm)5min，进样分析。
[0172]
(3)i-uloq样品，共重复配制3个样品
[0173]
100μl定量上限微粒体孵育液(含有5μl灭活的肝微粒体(终浓度为0.01mg/ml)，20μl氯化镁溶液(终浓度为10mm)，10μl还原型辅酶ⅱ(终浓度为1mm)，20μl sol 8工作液，用pbs补齐至100μl)中加入100μl乙腈溶液，涡旋振荡(约2500rpm)5min，4℃条件下12000rpm离心10min。取上清液50μl至96孔板中，每孔加入100μl 50％乙腈水溶液，封膜，摇板(300rpm)5min，进样分析。
[0174]
其结果如表7所示：
[0175]
表7
[0176]
[0177][0178]
注：
“‑”
表示无数据。
[0179]
结果可知，空白基质中内源性物质对待测物和内标的干扰(i-dbk)测得干扰组分的峰面积占待测物峰面积最高3.20％，占内标峰面积最高为0.01％；内标对待测物的干扰(i-bk)测得干扰组分的峰面积占待测物峰面积2.02％；待测物对内标的干扰(i-uloq)测得干扰组分的峰面积最高为0.01％。试验结果表明：该分析方法能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中的其他组分。
[0180]
8.2基质效应
[0181]
制备空白肝微粒体温孵体系样本，分别加入低、中、高三个浓度水平待测物工作液和内标，同时制备不含基质样品，通过计算基质存在下的峰面积与不含基质的相应峰面积比值，计算分析物和内标的基质因子，以分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，总的内标归一化基质因子变异系数不大于15％。
[0182]
待测物1-羟基咪达唑仑及内标非那西汀在人肝微粒体中的基质效应考察结果见表8。
[0183]
表8
[0184][0185]
注：mf＝待测物或内标峰面积均值(含基质)/待测物或内标峰面积均值(不含基质)，
“‑”
表示无数据。
[0186]
由结果可知，低(qc 1，0.015μm)和高(qc 3，4μm)两个浓度水平待测物1-羟基咪达
唑仑检测的内标归一化基质效应因子mf变异系数(％cv)分别为1.05％和1.98％，符合接受标准。
[0187]
8.3标准曲线和范围
[0188]
标准曲线：配制一定浓度梯度的待测物标准曲线样品，以待测物与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，经加权最小二乘法(w＝1/x2)回归计算线性方程。
[0189]
标准曲线接受标准：1)每个分析批的标准曲线相关系数(r)应大于0.99；2)标准曲线样品浓度的测得值与标示值的偏差不超过
±
15％的范围，定量下限浓度样品的浓度测得值与标示值的偏差不超过
±
20％的范围；3)标准曲线至少75％的非零点样品符合接受标准，但两条标准曲线的定量下限浓度和定量上限浓度样品至少有一个样本符合接受标准。
[0190]
1-羟基咪达唑仑在人肝微粒体中的标准曲线验证范围为0.005μm～5μm，标准曲线样品测定结果与统计数据见表9。
[0191]
表9
[0192][0193]
注：slope表示斜率，intercept表示截距，r表示相关系数。％bias(偏差)＝100
×
(检测值
–
标示值)/标示值，表示准确度。
[0194]
结果表明，本发明检测方法在0.005μm～5μm范围内，符合接受标准且线性关系良好。
[0195]
8.4批内和批间准确度与精密度
[0196]
分析方法的准确度描述待测物测得值与标示值之间的接近程度，准确度以测得值与标示值的偏差(％bias)表示，精密度描述待测物重复测定的接近程度，以变异系数(％cv)表示。
[0197]
采用定量下限(lloq)、低浓度(qc1)、中(qc2)、高(qc3)四个浓度的质控样品来评估精密度准确度，质控样品的准确度应在
±
15％以内，lloq的准确度应在
±
20％，统一浓度样品至少50％的样品应满足上述标准，至少67％的全部样品满足上述标准。
[0198]
每个浓度平行配制6份，以当批标准曲线计算其浓度，准确度和精密度分析批定量下限样品(lloq)及质控样品(qc 1～qc 3)测定结果和统计数据见表10。
[0199]
表10
[0200][0201][0202]
注：n表示样本数、mean表示算术均值、％bias(偏差)＝100
×
(mean或检测值
–
标示值)/标示值，用于表示准确度；-表示无数据。
[0203]
结果显示，本发明的批内和批间准确度与精密度满足验证要求，检测方法的定量下限为0.005μm，灵敏度高。
[0204]
8.5样品稳定性
[0205]
1-羟基咪达唑仑在人肝微粒体中稳定性数据见表11。
[0206]
表11
[0207][0208]
注：％cv(变异系数)＝100
×
sd/mean，用于表示精密度；％bias(偏差)＝100
×
(平均浓度
–
标示浓度)/标示浓度，表示准确度。
[0209]
结果表明，1-羟基咪达唑仑样品孵育过程(37℃水浴)放置30min，样品临时存放(-15℃～-30℃条件下)保存48h，处理后样品进样器(4℃条件下)放置24h，样品临时存放(-65℃～-90℃条件下)保存322d均稳定，说明本发明的体系样品稳定性优异。
[0210]
8.6回收率
[0211]
若采用提取方法处理样品，应评估回收率(提取效率)，回收率报告为经过样品提取和处理步骤的待测物已知量的百分比。通过比较处理过的加标样品和处理过的空白基质中加入待测物的响应值来确定。
[0212]
同一浓度水平的样品的回收率变异系数(％cv)不得大于15％，所有样品回收率的变异系数(％cv)均不得大于15％。
[0213]
(1)待测物1-羟基咪达唑仑在人肝微粒体中回收率数据见表12。
[0214]
表12
[0215][0216]
注：回收率(％)＝经提取样品峰面积/不经提取样品峰面积均值
×
100；％cv(变异系数)＝100
×
sd/mean，用于表示精密度；
“‑”
为无数据。
[0217]
结果可知，低(qc 1，0.015μm)、中(qc 2，2μm)、高(qc 3，4μm)三个浓度水平质控样品中待测物1-羟基咪达唑仑回收率变异系数(％cv)分别为2.58％、1.52％和5.58％，总变异系数(％cv)为5.77％，符合接受标准。
[0218]
(2)内标非那西汀在肝微粒体中回收率数据见表13。
[0219]
表13
[0220][0221][0222]
注：回收率(％)＝经提取样品峰面积/不经提取样品峰面积均值
×
100；％cv(变异系数)＝100
×
sd/mean，用于表示精密度；
“‑”
为无数据。
[0223]
结果可知，低(qc 1，0.015μm)、中(qc 2，2μm)、高(qc 3，4μm)三个浓度水平质控样品中内标非那西汀回收率变异系数(％cv)分别为3.55％、2.08％和2.12％，总变异系数(％cv)为3.01％，符合接受标准。
[0224]
8.7残留
[0225]
残留(carryover)是指前一个样品残留在系统中的残留物而引起的测定浓度的变化。在验证期间通过在定量上限样品之后分析空白样品来考察残留。在定量上限样品之后的空白样品中的残留应不超过定量下限样品中待测物响应的20％和内标响应的5％
[0226]
uplc-ms/ms法测定的人肝微粒体中待测物1-羟基咪达唑仑和内标非那西汀残留见表14。
[0227]
表14
[0228]
[0229][0230]
注：
“‑”
为无数据。
[0231]
结果可知，测定的1-羟基咪达唑仑和内标非那西汀的在人肝微粒体中最大残留分别为18.77％和0.03％，结果表明，此分析方法残留符合接受标准。
[0232]
8.8均一性
[0233]
验证待测物1-羟基咪达唑仑在人肝微粒体中测定分析批的均一性。
[0234]
结果表明，uplc-ms/ms法测定人肝微粒体样品待测物1-羟基咪达唑仑的分析批最多可进样118个样本。证明本发明的分析方法一个批次进样量大，具有更高效率，均一性好。
[0235]
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

技术特征：
1.一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：s1、建立肝微粒体温孵体系在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物预孵育，之后加入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；s2、标准曲线样品及待测样品的配制根据步骤s1中的肝微粒体温孵体系，配制系列浓度的标准曲线样品、质控样品及空白样品等，并进行孵育；其中，底物为系列浓度的1-羟基咪达唑仑；根据s1中的肝微粒体温孵体系，配制待测样品，并进行孵育，其中底物为浓度0.5μm的咪达唑仑；s3、样品进样前处理在步骤s2中孵育后的标准曲线样品和待测样品中加入内标工作溶液终止反应，涡旋、振荡、离心，后取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入乙腈水溶液复溶，封膜、摇板；s4、uplc-ms/ms分析检测将步骤s3处理后的样品进行uplc-ms/ms分析检测，其中，色谱检测条件：流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈溶液；洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；色谱柱：acquity uplc hss t3；流速：0.4ml/min保留时间：1-羟基咪达唑仑：0.59min；非那西汀：0.82min；洗脱时间：1.5min色谱洗脱程序为：0～1.5min、流动相b的体积百分数为40％；质谱条件为：质谱离子源：turbo spray电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：mrm多反应离子监测；碰撞气：medium；气帘气：35psi；分辨率q1/q3：unit/unit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500v；离子化温度：500℃；采集时长：1.50min；根据检测结果得到1-羟基咪达唑仑的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的1-羟基咪达唑仑浓度。2.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.01mg/ml，氯化镁溶液的孵育浓度为10mm，还原型辅酶ⅱ的孵育浓度为1mm；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒温水浴锅中的孵育时间为25min。3.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s2中，标准曲线样品浓度范围为0.005μm～5μm。4.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s3中，内标工作溶液为100ng/ml的非那西汀；乙腈水溶液的体积分数为50％，上清液和乙腈水溶液的体积比为1:2；前处理的条件如下：以2500rpm的转速涡旋振荡5min；在4℃的条件下，以12000rpm的转
速离心10min；以300rpm的转速摇板5min。5.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s4中，色谱柱的规格为：长50mm
×
内径2.1μm，填充颗粒1.8μm。6.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样量为2μl。7.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样时间为1.5min。8.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s4中，uplc检测条件中，柱温为40℃，自动进样器的温度设定为4℃。9.根据权利要求1所述的肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，其特征在于，所述步骤s4中，离子监测采集参数如下：1-羟基咪达唑仑：母离子为342.1da；子离子为203.0da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为160volts；碰撞电压为37volts；碰撞池入口电压为12volts；非那西汀：母离子为180.0da；子离子为110.3da；驻留时间为100ms；入口电压为10volts；去簇电压为71volts；碰撞电压为40volts；碰撞池入口电压为12volts。

技术总结
本发明提供一种肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法，首先，摸索并建立合理的肝微粒体孵育体系；其次，对1-羟基咪达唑仑在肝微粒体中浓度测定进行方法开发与摸索，优化色谱和质谱条件、确定生物样品前处理方式，同时对其进行方法学验证；最后，进行样品测定，得到特定孵育样品在肝微粒体中1-羟基咪达唑仑浓度。本发明的检测方法灵敏度高，稳定性好、精确，且提高了分析效率。且提高了分析效率。且提高了分析效率。


技术研发人员：樊阿莉 何孟奇 胡惠影 张雪峰 程远国 窦金辉
受保护的技术使用者：江苏鼎泰药物研究（集团）股份有限公司
技术研发日：2022.03.04
技术公布日：2023/9/12