一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法

1.本发明涉及化合物分离技术领域，特别是涉及一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法。


背景技术：

2.黑果枸杞是近年来在青海柴达木盆地等地被新挖掘的一种野生药食两用植物。黑果枸杞的营养价值要高于普通枸杞，含有蛋白质、维生素以及矿物质等多种营养成分，食用价值较高，其果实也含有丰富的花青素成分，具有抗氧化和抗过敏功能，增强人体免疫力和改善睡眠。
3.研究表明，黑果枸杞含有多种生物活性成分，其成熟浆果中富含花色苷等多酚类物质，具有抗氧化、潜在预防和治疗心血管系统疾病等作用。其中多酚类物质包括花色苷、黄酮类化合物等通过其较强的抗氧化清除自由基作用，表现出抗炎、保护心血管、抗肿瘤等多种生物活性。
4.目前对于黑果枸杞内的活性物质的研究还比较薄弱，黑果枸杞内的活性物质的发掘、分离和提取，还有待进一步的研究。


技术实现要素：

5.本发明解决的主要技术问题是提供一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，通过对黑果枸杞进行甲醇提取，然后对提取的活性组分进行进一步地分离纯化，最后得到一种具有抗肝炎活性的化合物a。
6.为了解决上述的技术问题，本发明所采用的技术方案是：
7.一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，包括以下内容：
8.(1)将干燥的黑枸杞果实，在室温避光条件下，经甲醇浸泡提取，提取条件：液料比20ml/g，共计提取3次，每次4～5d，将提取液进行过滤，并进行避光减压浓缩、合并，得到黑果枸杞果实甲醇提取物浸膏；
9.(2)将步骤(1)中制备的甲醇提取物浸膏与干燥的聚酰胺粉末以质量比1:1进行混合，经烘箱40℃烘干后研磨，过20目筛，得到过筛粉末；
10.(3)取步骤(2)中过筛粉末装入小型中压色谱塔中，并连接装有mci的中压色谱柱与制备液相色谱，进行干法上样；采用水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱，共计得到三个组分:保留时间12～39min得到fr1，保留时间39～139min得到fr2，保留时间139～230min得到fr3；
11.(4)对步骤(3)中得到的fr2做进一步的分离，以甲醇和/或水为流动相，进行梯度洗脱，保留时间76～130min得到fr2-5；
12.(5)对步骤(4)中fr2-5进行分离，装入c18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相进行梯度洗脱：保留时间21～27min得到fr2-5-4；
13.(6)对步骤(5)中fr2-5-4进行分离，c18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相，进行梯
度洗脱，保留时间25～26min得到fr2-5-4-1为黄色粉末状，即为目标化合物a；
14.化合物a的结构式如下：
[0015][0016]
进一步地，步骤(3)中所述洗脱条件：
[0017]
0～120min，100％水～100％甲醇；
[0018]
120～180min，100％甲醇～100％二氯甲烷；
[0019]
180～210min，100％甲醇；
[0020]
210～240min，100％水；
[0021]
流速：50ml/min，检测波长：210nm。
[0022]
进一步地，步骤(4)中所述洗脱条件：
[0023]
0～120min，0～100％甲醇；
[0024]
120～140min，100％甲醇；
[0025]
流速：50ml/min；
[0026]
检测波长：254nm；
[0027]
填料：chp20p凝胶色谱；
[0028]
柱子规格：49
×
460mm。
[0029]
进一步地，步骤(5)中所述洗脱条件：
[0030]
0～60～65～90min，30％～42％～70％～95％甲醇，
[0031]
流速：19ml/min；
[0032]
检测波长：210nm。
[0033]
进一步地，步骤(6)中所述洗脱条件：
[0034]
0-60min，30％～35％甲醇；
[0035]
流速：18ml/min；
[0036]
检测波长：210nm。
[0037]
进一步地，权利要求1所述c18制备色谱柱的规格为21.2
×
250mm，5μm。
[0038]
本发明还提供了化合物a在制备预防或治疗肝损伤的药物中的应用。
[0039]
其中，所述药物是预防或治疗肝炎的药物中的应用。
[0040]
其中，所述肝损伤为化学性肝损伤。
[0041]
进一步地，所述化学性肝损伤为ccl4导致的肝损伤。
[0042]
根据本发明的分离纯化路径，化合物a存在于fr2、fr2-5或fr2-5-4这几个提取部位中，且在上述部位中含量依次增加。基于化合物a在肝损伤方面的预防或治疗作用，含有
化合物a的fr2、fr2-5或fr2-5-4也具备上述活性。
[0043]
本发明中所述“肝炎”是指由化学物质引起的肝脏炎症的统称。化学性肝损伤一般是指各种化学性的因素所引起的肝脏的损害，包括药物性肝炎，也包括化学毒物所造成的肝炎也可以称为中毒性肝炎。
[0044]
本发明的化合物a或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶的药物组合物中，可以含有药学上可接受的辅料。
[0045]
本发明中所述“药学上可接受的”是指包括任意不干扰活性成分的生物活性的有效性且对它被给予的宿主无毒性的物质。
[0046]
本发明所述药学上可接受的辅料，是药物中除主药以外的一切附加材料的总称，辅料应当具备如下性质：(1)对人体无毒害作用，几无副作用；(2)化学性质稳定，不易受温度、ph、保存时间等的影响；(3)与主药无配伍禁忌，不影响主药的疗效和质量检查；(4)不与包装材料相互发生作用。本发明中辅料包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包含糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包含微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包含十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包含0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；调节剂包含盐酸、枸橼酸、氢氧化钾(钠)、枸橼酸钠及缓冲剂(包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)等；乳化剂包含聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克f-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包含吐温-80、胆汁、甘油等。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。上述酸碱为广义的路易斯酸碱。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0047]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
[0048]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0049]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0050]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0051]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0052]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0053]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0054]
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0055]
本发明化合物同样可以用于注射制剂。其中，所述注射剂选自液体注射剂(水针)、注射用无菌粉末(粉针)或注射用片剂(系指药物用无菌操作法制成的模印片或机压片，临用时用注射用水溶解，供皮下或肌肉注射之用)。
[0056]
其中，所述注射用粉剂的中除含有上述化合物外，还至少含有赋形剂。本发明中所述赋形剂，为有意加到药物中的成分，其在所用的量上不应具有药理学特性，但是，赋形剂可以有助于药物的加工、溶解或溶出、通过靶向给药途径递药或有助于稳定性。
[0057]
所述“c18制备色谱柱”是一种常用的反相色谱柱，其原理是使用c18烷基链固定在硅胶基质上作为固定相，将极性物质与非极性物质分离。c18色谱柱的烷基链可以与样品中的非极性物质相互作用，使其在固定相上停留更长的时间，而无法快速通过柱子，从而实现分离。相反，极性物质则无法与烷基链相互作用,因此可以快速通过柱子。c18色谱柱适用于分离具有不同极性的化合物混合物，例如药物、天然产物和有机化合物等。其分离效果受到固定相的性质、样品的性质和流动相的性质等多个因素的影响。
[0058]
所述dmem是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在mem培养基的基础上研制的。与mem比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(高于4500mg/l)和低糖型(低于1000mg/l)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
[0059]
本发明的有益效果是：
[0060]
本发明首次从黑果枸杞中分离提纯了化合物a，且根据研究发现，化合物a具备一定的预防或治疗肝损伤的活性，夯实了黑果枸杞的活性基础研究。
附图说明
[0061]
图1黑果枸杞果实提取物的mci分离制备图谱；
[0062]
图2fr2的mci分离制备图谱；
[0063]
图3fr2-5的分离制备图谱；
[0064]
图4fr2-5-4的分离制备图谱；
[0065]
图5fr2-5-4-1的分离制备图谱；
[0066]
图6化合物fr2-5-4-1的质谱图；
[0067]
图7化合物fr2-5-4-1的1h nmr图；
[0068]
图8化合物fr2-5-4-1的
13
c nmr图；
[0069]
图9单体化合物对hepg2细胞增殖的影响柱形图；
[0070]
图10单体化合物对ccl4诱导hepg2细胞损伤的保护作用柱形图；
[0071]
图11单体化合物对hepg2细胞中ast活性的影响柱形图；
[0072]
图12单体化合物对hepg2细胞中alt活性的影响柱形图。
具体实施方式
[0073]
以下对本发明的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，此处所描述的实施例仅是本发明中的一部分，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0074]
dmso:二甲基亚砜。
[0075]
实施例1
[0076]
一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，包括以下内容：
[0077]
(1)称取10.0kg干燥黑果枸杞果实，在室温避光条件下，加入200l甲醇浸泡，提取3次，每次浸泡4d，提取一次，共提取3次；将提取液进行过滤，并进行避光减压浓缩、合并，得到黑果枸杞果实甲醇提物浸膏3.643kg。
[0078]
(2)将步骤(1)中制备的甲醇提取物浸膏与干燥的聚酰胺粉末以质量比1:1进行混合，经烘箱40℃烘干后研磨，过20目筛，得到过筛粉末；
[0079]
(3)取步骤(2)中过筛粉末50.00g装入小型中压色谱塔(26
×
100mm)中，并连接装有mci的中压色谱柱(49
×
460mm)，进行干法上样；采用水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱，0～120min，100％水～100％甲醇；120～180min，100％甲醇～100％二氯甲烷；180～210min，100％甲醇；210～240min，100％水；流速：50ml/min，检测波长：210nm；共计得到三个组分fr1、fr2和fr3，如图1所示，在保留时间39～139min得到fr2 511.3g，收率15.1％。
[0080]
(4)对步骤(3)中得到的fr2做进一步的分离，以甲醇和/或水为流动相，进行梯度洗脱，洗脱条件0～120min，0～100％甲醇；120-140min，100％甲醇；流速：50ml/min；检测波长：254nm；填料：mci；柱子规格：49
×
460mm；如图2所示，保留时间76～130min得到fr2-5 175.5g，收率34.3％。
[0081]
(5)对步骤(4)中fr2-5进行分离，装入规格为21.2
×
250mm，5μm的c18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相进行梯度洗脱：0～60～65～90min，30％～42％～70％～95％甲醇，流速：19ml/min；检测波长：210nm；如图3所示，保留时间21～27min得到fr2-5-4，称重6.3g，收率3.6％。
[0082]
(6)对步骤(5)中fr2-5-4进行分离，规格为21.2.
×
250mm，5μm的c18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相，进行梯度洗脱：0％60min，30-35％甲醇；流速：18ml/min；检测波长：210nm；如图4和图5所示，保留时间25～26min得到fr2-5-4-1，即为黄色粉末状目标化合物a，称重270mg，收率4.3％。
[0083]
如图6、图7和图8所示，化合物a的ms、1h-nmr、
13
c-nmr数据如下:
[0084]
esi-ms m/z:197[m-h]-，化学式c9h
10
o5；
[0085]1h-nmr(dmso，800mhz)：δ:7.54(2h，s，h-2，6)，5.38(1h，s，3，5-oh)，3.83(3h，s，-och3)；
[0086]
13
c-nmr(dmso，800mhz)：δ:119.23(c1)，110.51(c-2)，151.81(c-3)，139.39(c-4)，151.81(c-5)，104.58(c-6)，166.20(c-7)，51.73(c-8)，56.15(-och3)。
[0087]
以上数据与文献报道的已知物3-甲氧基没食子酸甲酯的ms、1h-nmr、
13
c-nmr标准图谱数据核对均一致，故鉴定为methyl 3,4-dihydroxy-5-methoxy-benzoate。
[0088][0089]
3-甲氧基没食子酸甲酯的结构式(化合物a)
[0090]
试验例1methyl 3,4-dihydroxy-5-methoxy-benzoate的体外护肝作用评价
[0091]
1.实验材料与试剂
[0092]
1.1实验材料
[0093]
单体化合物methyl 3,4-dihydroxy-5-methoxy-benzoate。
[0094]
人肝癌hepg2细胞株：中国科学院典藏细胞库(目录号：scsp-510)。
[0095]
1.2主要试剂的配制方法
[0096]
(1)细胞冻存液：在超净工作台中，将dmem培养基：胎牛血清：dmso以7:2:1的比例混合，现用现配。
[0097]
(2)dmem完全培养基：在新鲜的500ml dmem培养基中先加入5ml青霉素-链霉素双抗混合均匀，之后加入50ml胎牛血清，配制成含10％血清的dmem培养基。
[0098]
(3)mtt溶液：称取50.00mg mtt粉末，加入pbs缓冲液溶解并定容至10ml，避光条件下超声助溶，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃避光冻存。
[0099]
(4)ccl4损伤液的制备：将ccl4与无水乙醇1:1混匀后加入dmem培养液中(终浓度为0.1％v/v)，得到ccl4损伤液置于4℃冰箱保存。用前震荡后使用。
[0100]
(5)单体化合物溶液的配置：称取4.925mg的methyl 3,4-dihydroxy-5-methoxy-benzoate单体化合物，加入5ml dmso溶解，配制成浓度为5mmol/l的储备液，受试样品的储备液保存于-20℃冰箱，使用时按实验需要进行稀释。
[0101]
2.实验方法
[0102]
2.1mtt法测定细胞活力
[0103]
采用mtt比色法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)进行细胞活力的测定，其具体方法是将处于对数生长期的hepg2细胞用胰酶消化2-3min后，加入一定量的dmem完全培养基，调整细胞密度为1
×
104个/孔，接种于96孔细胞板中，培养24h后弃去培养液。分别加入含有不同浓度药物和含1％血清的dmem培养基200μl，每组设置6个复孔，培养一段时间后，弃去培养基，加入新鲜的含1％血清的dmem培养基，然后每孔加入20μl mtt溶液(终浓度0.5mg/ml)后继续培养4h，到达预设时间后将96孔板中的培养基弃去，每孔加入200μl dmso，最后使用酶标仪测定490nm波长处的各孔吸光度值。
[0104]
2.2细胞总蛋白提取
[0105]
将培养皿中的培养基弃去，加入pbs清洗两次，之后根据自己所需蛋白浓度加入40-100μl细胞裂解液(ripa:pmsf＝100:1v/v)，放置于4℃冰上裂解5min，裂解完成后，使用细胞刮刀将细胞完全刮下，转移至离心管中，12000rpm，4℃，离心15min，吸取上清液至另一离心管，-80℃保存。
[0106]
2.3细胞肝酶活力测定
[0107]
取对数生长期hepg2细胞，用胰蛋白酶消化后用含10％血清的dmem完全培养基调整细胞悬液浓度，之后将细胞接种到6孔板中培养，每孔3ml，之后将6孔板放置于co2培养箱24h，至细胞完全贴壁状态。将6孔板取出，细胞分别设置空白对照组，模型组，化合物a与0.1％ccl4联合处理组。各组细胞培养6h后，弃去上清液，提取细胞蛋白，用于测定alt、ast指标。
[0108]
3.实验结果
[0109]
3.1单体化合物对hepg2细胞增殖的影响
[0110]
由图9可见，单体化合物浓度在5～20μm的3个浓度范围内作用于hepg2细胞24h，3个浓度均未见有明显的细胞毒性，与空白对照组相比没有显著性差异，后续继续选择5、10、20μm进行后续实验。
[0111]
3.2单体化合物对ccl4诱导hepg2细胞损伤的保护作用
[0112]
如图10所示，ccl4损伤后，与正常组对比，模型组细胞的存活率极显著降低，表明ccl4可以诱导损伤hepg2细胞并抑制其活性(p《0.01)。与模型组比较，单体化合物在经过细胞同时给药后，3个作用浓度下可不同程度的提高细胞活力，与模型组相比具有极显著差异(p《0.01)。
[0113]
备注：图10与空白对照组对比，##p＜0.01；与ccl4模型组对比，**p＜0.01。
[0114]
3.3hepg2细胞肝酶活力
[0115]
谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，alt)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，ast)存在于人体各种细胞中，肝细胞中含量最高，当机体受到外界刺激如药物性肝中毒或化学性肝中毒时，相应的肝细胞受损导致细胞膜通透性增加后将其释放出来，使胞外环境中的肝酶浓度升高，因此，通常将ast、alt作为临床上诊断病毒性肝炎及中毒性肝炎的重要指标，同时也是急性肝细胞受损的敏感标志物。
[0116]
如图11～图12所示，与空白对照组相比，模型组细胞中ast、alt酶活力极显著升高，二者之间的差异具有统计学意义(p＜0.01)，说明ccl4使细胞明显受到损伤后导致细胞
结构和功能异常。与模型组相比，不同浓度单体化合物和0.1％ccl4损伤液的培养基预孵育，可以降低细胞中alt和ast水平，具有极显著性差异(p＜0.01)，且呈现剂量依赖效应，说明单体化合物虽不能完全抵抗ccl4造成的细胞损伤，但在一定程度上减轻了细胞的损伤程度。观测其各项指标变化可以综合判定对肝脏损伤的调节效果，经单体化合物作用于细胞后，细胞中alt、ast酶活力下降，说明在单体化合物的干预下肝细胞损伤减少，肝酶活力降低。
[0117]
备注：图11和图12，与空白对照组对比，##p＜0.01；与ccl4模型组对比，**p＜0.01。

技术特征：
1.一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，其特征在于，包括以下内容：(1)取黑果枸杞果实甲醇提取物浸膏；(2)将黑果枸杞果实甲醇提取物浸膏与干燥的聚酰胺粉末以质量比1:1进行混合，干燥后研磨，过20目筛，得到过筛粉末；(3)取步骤(2)中过筛粉末装入小型中压色谱塔中，并连接装有mci的中压色谱柱与制备液相色谱，进行干法上样；采用水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱，共计得到三个组分：保留时间12～39min得到fr1，保留时间39～139min得到fr2，保留时间139～230min得到fr3；(4)步骤(3)中得到的fr2，以甲醇和/或水为流动相，进行梯度洗脱，保留时间76～130min得到fr2-5；(5)步骤(4)中fr2-5，连接c18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相进行梯度洗脱：保留时间21～27min得到fr2-5-4；(6)步骤(5)中fr2-5-4，c18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相，进行梯度洗脱，保留时间25～26min得到fr2-5-4-1，即为黄色粉末状目标化合物a；化合物a的结构式如下：2.根据权利要求1所述的一种从黑枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱条件：0～120min，100％水～100％甲醇；120～180min，100％甲醇～100％二氯甲烷；180～210min，100％甲醇；210～240min，100％水；流速：50ml/min，检测波长：210nm。3.根据权利要求1所述的一种从黑枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，其特征在于，步骤(4)中所述洗脱条件：0～120min，0～100％甲醇；120～140min，100％甲醇；流速：50ml/min；检测波长：254nm；填料：chp20p凝胶色谱；
柱子规格：49
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460mm。4.根据权利要求1所述的一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，其特征在于，步骤(5)中所述洗脱条件：0-60-65-90min，30％～42％～70％～95％甲醇；流速：19ml/min；检测波长：210nm。5.根据权利要求1所述的一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，其特征在于，步骤(6)中所述洗脱条件：0～60min，30％～35％甲醇；流速：18ml/min；检测波长：210nm。6.根据权利要求1所述的一种从黑枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，其特征在于，所述c18制备色谱柱的规格为21.2
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250mm，5μm。7.化合物a、权利要求1所述fr2、fr2-5或fr2-5-4在制备预防或治疗肝损伤的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物是预防或治疗肝炎的药物中的应用。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肝损伤为化学性肝损伤。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述化学性肝损伤为ccl4导致的肝损伤。

技术总结
本发明公开了一种从黑果枸杞中分离抗肝炎活性物质的方法，涉及化合物分离技术领域。黑果枸杞经甲醇提取物制成甲醇提取物浸膏，后与聚酰胺粉末等比例混合过筛得到过筛粉末，将过筛粉末装入色谱塔，水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱，分离出活性物质，并将活性物质以水和甲醇为洗脱项进行进一步分离，最后分离提纯得到化合物A。本发明首次从黑果枸杞中分离提纯了化合物A，并且验证了化合物A具有治疗肝炎的效果。炎的效果。炎的效果。


技术研发人员：胡娜 李婧 王洪伦 铁芳芳 董琦
受保护的技术使用者：中国科学院西北高原生物研究所
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/9/12