全血中分离红细胞的试剂盒及方法与流程

1.本发明属于细胞分离技术领域，特别涉及一种全血中分离红细胞的试剂盒及方法。


背景技术：

2.从血液样本中分离红细胞得到血清或血浆传统的方法为离心分离(大于5分钟)，需要使用到专用的离心设备，离心操作不当时可能会造成血细胞的破裂，不利于快速检测，难以满足临床免疫检测快速检测的需求，且离心方法很难实现红细胞分离的自动化，不利于检测设备的小型化。而红细胞的存在对现有的血液标志物检测带来很大的干扰，因此快速准确地进行血液样本处理和检测，有利于为患者争取治疗时间窗口。
3.长期以来 ，人们一直认为红细胞的结构简单
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只有携带氧气的功能
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但自从美国遗传学家提出
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红细胞免疫功能
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的概念以后 ，人们对红细胞有了新的理解，通过大量的实验证明红细胞膜表面有许多与免疫相关的物质，如：补体受体1（cd35）、补体受体3、cd55、cd58、cd59、il-8受体、daf、sod酶等等。
4.公开号为cn111308070a的中国专利公开了一种用于从全血中分离红细胞的试剂盒及其从全血中分离红细胞的方法，采用化学偶联的抗rbc抗体的磁珠，植物凝集素和/或抗rbc抗体进行分离，然后通过磁吸法分离红细胞，但该方法需要使用与全血同体积用量的羧基磁珠，相当于同时稀释血浆样本，因此必定会影响样本检测的灵敏度；而羧基磁珠造价较贵，大量羧基磁珠使用造成分离成本的提高。


技术实现要素：

5.本发明针对现有全血中红细胞分离方法的不足，提供一种全血中分离红细胞的试剂盒及方法，利用该试剂盒从全血中分离红细胞，能有效的减少磁性纳米粒子溶液的使用量，进一步降低试剂盒成本。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种全血中分离红细胞的试剂盒，包括偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子、偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子。
7.进一步的，所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子中的补体受体为cd35、补体受体3、cd55、cd58、cd59、il-8受体、daf、sod酶、红细胞趋化因子受体、巨噬细胞吞噬抑制因子中的一种或几种。
8.进一步的，所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子中的生物粒子为乳胶微球、荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球中的至少一种。
9.进一步的，所述偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子中的磁性纳米粒子为磁性高分子微珠。
10.进一步的，所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子具有荧光标记。
11.另一方面，本发明还提供了一种利用上述任意一个技术方案中的试剂盒在全血中分离红细胞的方法，包括至少以下步骤：
1）在试管加入偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子，然后加入全血，轻轻吹打混匀，使偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子与红细胞上的补体受体首先进行特异性结合，生物微粒子迅速富集红细胞，使红细胞形成细胞簇；2）继续在试管中加入偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子，使偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子与红细胞表面的rbc抗原特异性结合，偶联抗体的磁性纳米粒子与结合红细胞补体受体抗体的红细胞结合形成红细胞双抗体夹心复合物，偶联抗体的磁性纳米粒子还可与少量游离的红细胞结合形成红细胞-rbc抗体复合物；3）使用环形电磁套套设在试管外侧，通过改变电流的方向和强度控制电磁套的磁极和磁性的大小，混匀吸磁1min，使结合磁性纳米粒子的红细胞双抗体夹心复合物、红细胞-rbc抗体复合物向磁铁方向聚集。
12.另一方面，本发明还提供了一种利用上述技术方案中的试剂盒在全血中分离红细胞的方法，包括至少以下步骤：1）在试管加入具有荧光标记的偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子，然后加入全血，轻轻吹打混匀，使偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子与红细胞上的补体受体特异性结合；2）继续在试管中加入偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子，使偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子与红细胞表面rbc抗原特异性结合，偶联抗体的磁性纳米粒子与结合红细胞补体受体抗体的红细胞结合形成红细胞双抗体夹心复合物，偶联抗体的磁性纳米粒子还可与少量游离的红细胞结合形成红细胞-rbc抗体复合物；3）使用环形电磁套套设在试管外侧，通过改变电流的方向和强度控制电磁套的磁极和磁性的大小，混匀吸磁1min，使结合磁性纳米粒子的红细胞双抗体夹心复合物、红细胞-rbc抗体复合物向磁铁方向聚集。
13.4）使用荧光检测仪通过试管底透明区照射，通过检测试管中间分离的血浆/血清是否有过量的荧光生物粒子滞留，若试管中间荧光值未超阈值，则可进行后续的血样取样，若试管中间荧光值超过阈值，则代表有过量荧光生物粒子滞留，不能进行血样的取样。
14.通过上述技术方案得到的一种全血中分离红细胞的试剂盒及方法，其有益效果是：1.由于红细胞上有补体受体，偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子与红细胞上的补体受体特异性结合，不占用红细胞表面rbc抗原位点，更便利于红细胞与免疫磁性纳米粒子快速有效的结合。
15.2.生物粒子先与红细胞特异性结合并相互聚集，起到富集红细胞的作用，红细胞富集后复合物颗粒变大，形成细胞簇，聚集的红细胞复合物再与磁性纳米粒子结合，放大磁性纳米粒子的结合效应。
16.3.免疫生物粒子与免疫磁性纳米粒子同时与红细胞结合，形成双抗体夹心结构，灵敏度更高，可以显著节省磁性纳米粒子溶液的加入量，避免样本被稀释的弊端，生物粒子的成本低于羧基磁性纳米粒子，同时可降低试剂盒的使用成本。
17.4.环形电磁套可通过电流控制磁极和吸力来混匀磁性纳米粒子与全血，无需借助工具和外力进行混匀，避免出现红细胞破裂现象。
18.5.环形电磁套增加磁吸面积，提高吸收磁复合物的效率，红细胞被吸附在管壁，分
离的血清/血浆在管的中间，方便后续取样枪直接插入试管中吸取血浆样本，无需考虑误吸取底部红细胞样本的问题。
19.6. 无需使用离心、过滤进行血浆和血细胞分离，简化了血浆分离装置的使用，与传统离心法分离全血样本相比，提高分离效率的同时，缩短分离时间，1-2min内即可高效分离全血。
20.7.结合红细胞的免疫磁球被磁铁套吸附管壁上，试管底是高透明材质，采用荧光标记偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子，并使用荧光检测仪通过试管底透明区照射检测分离血浆是否有富余的荧光生物粒子滞留，若有荧光生物粒子滞留，仪器则不进行血样的取样，可以减少血样进一步检测的干扰。
附图说明
21.图1是本发明在放置偶联红细胞补体受体的生物粒子的试管中加入全血时的示意图；图2是本发明在图1的试管中加入偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子时的示意图；图3是本发明在图2的试管外侧套设环形电磁套时的示意图。
具体实施方式
22.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
23.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
24.本发明总体来说涉及细胞分离技术领域，通过使用免疫生物粒子与免疫磁性纳米粒子同时与红细胞结合，起到放大结合红细胞作用，节省磁性纳米粒子的使用量。
25.下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。
26.如图所示，一种全血中分离红细胞的试剂盒，包括偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子、偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子。
27.所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子中的补体受体为cd35、补体受体3、cd55、cd58、cd59、il-8受体、daf、sod酶、红细胞趋化因子受体、巨噬细胞吞噬抑制因子中的一种或几种。
28.所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子中的生物粒子为乳胶微球、荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球中的至少一种。
29.所述偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子中的磁性纳米粒子为磁性高分子微珠。
30.所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子具有荧光标记。
31.以下是应用本发明的一个技术方案中偶联cd35抗体的乳胶微球/偶联cd35抗体的荧光乳胶微球的制备方法：1） 取乳胶微球/荧光乳胶微球（购于苏州纳微科技股份有限公司，下称乳胶球）100ul到1.5ml离心管中，乳胶球粒径为20μm，离心去上清，用mes溶液洗涤2次；
2）活化：洗涤后的乳胶球分散于80μlmes溶液，迅速加入新配制的10μlnhs和10μledc溶液(50mg/ml，用上述mes做分散剂)，吹打混匀后置于旋转仪上常温活化5min，离心去上清,可与抗cd35抗体进行共价偶联；3）偶联抗体：向活化后的乳胶球分中，加入cd35抗体轻柔混匀，抗体保持液为ph7.0的pbs溶液，反应结束后，离心去上清；4）封闭：加入含有5％bsa的pbs溶液重悬反应后的乳胶球，室温反应1h，离心去上清,重新悬浮于 ph 7.0的pbs溶液中得到偶联cd35抗体的乳胶微球溶液/偶联cd35抗体的荧光乳胶微球溶液。
32.5）冻干：将偶联cd35抗体的乳胶微球溶液在压力为20pa、温度低于-30℃下进行真空冷冻干燥处理，得到冻干的偶联cd35抗体的乳胶微球/冻干的偶联cd35抗体的荧光乳胶微球。
33.以下是应用本发明的一个技术方案中偶联抗rbc抗体的磁性高分子微珠的制备方法：1） 取羧基磁性高分子微珠（购于武汉新纵科生物技术有限公司，下称磁珠）100ul到1.5ml离心管中，磁珠粒径为10μm，磁性分离去除上清液；2）活化：洗涤后的磁性纳米粒子分散于mes溶液，迅速加入新配制的nhs和edc溶液，吹打混匀后置于旋转仪上活化5min，活化期间使磁珠保持悬浮状态，磁性分离去除上清液；3）偶联抗体：向活化后的磁珠中，加入抗rbc抗体轻柔混匀，抗体保持液为ph7.0的pbs溶液，室温反应1h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态，反应结束后，磁吸去上清；4）封闭：加入ph7.0含有5％bsa的pbs溶液重悬反应后的磁珠，室温反应1h，期间保持磁珠的悬浮状态；磁吸去上清，重新悬浮于 ph 7.0的pbs溶液中，放置于4℃冰箱中，得到偶联抗rbc抗体的磁性高分子微珠。
34.实施例1：将4个试管中均加入全血200ul，分别加入偶联抗rbc抗体的磁性高分子微珠20ul、40ul、80ul、160ul，将试管放入环形电磁套磁吸1min，吸取中间血浆，试管中血浆的量见表1。
35.表1分离全血磁珠的用量
36.由表1可见，如果只加入抗rbc抗体的磁性高分子微珠，200ul全血中需要加入80ul的抗rbc抗体的磁性高分子微珠才可以将全血中的红细胞分离出来。
37.实施例2：将4个试管中均加入全血200ul和10 ug冻干的偶联cd35抗体的乳胶微球，轻轻吹打混匀反应0.5-1min，再分别加入偶联抗rbc抗体的乳胶微球10ul、20ul、40ul、80ul，将试
管放入环形电磁套磁吸1min，吸取中间血浆，试管中血浆的量见表2。
38.表2添加乳胶球的全血分离乳胶微球的需用量
39.由表2可见，加入偶联cd35抗体的乳胶微球可以有效减少偶联抗rbc抗体的磁性高分子微珠的使用量，200ul全血中添加10 ug免疫乳胶微球后，20ul偶联抗rbc抗体的磁性高分子微珠就可以将全血中的红细胞分离出来。
40.实施例3：将4个试管中放入冻干的偶联cd35抗体的荧光乳胶微球的量分别为2.5ug、5ug、10ug、20ug，加入全血200ul，轻轻吹打混匀反应0.5-1min，后加入偶联抗rbc抗体的磁性高分子微珠20ul，将试管放入环形电磁套磁吸1min，吸取中间血浆，并将血浆通过荧光检测仪进行荧光检测，此时试管中血浆量、红细胞游离情况、血浆中荧光情况见表3。（荧光检测仪为常规技术，与荧光乳胶微球携带的信号一致即可）表3优化分离全血乳胶球的用量
41.由表3可见，通过荧光检测发现，在200ul全血中加入5ug冻干的偶联cd35抗体的荧光乳胶微球，可以满足结合红细胞的同时不会残留多余的荧光乳胶微球至血浆中，可以进行后续的检测。
42.上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，包括偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子、偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子。2.根据权利要求1所述的全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子中的补体受体为cd35、补体受体3、cd55、cd58、cd59、il-8受体、daf、sod酶、红细胞趋化因子受体、巨噬细胞吞噬抑制因子中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子中的生物粒子为乳胶微球、荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球中的至少一种。4.根据权利要求1所述的全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子中的磁性纳米粒子为磁性高分子微珠。5.根据权利要求1-4任一项所述的全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子具有荧光标记。6.一种全血中分离红细胞的方法，其特征在于，应用权利要求1-4任一项所述的试剂盒，包括至少以下步骤：1）在试管加入偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子，然后加入全血，轻轻吹打混匀，使偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子与红细胞上的补体受体特异性结合；2）继续在试管中加入偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子，使偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子与红细胞表面rbc抗原特异性结合，偶联抗体的磁性纳米粒子与结合红细胞补体受体抗体的红细胞结合形成红细胞双抗体夹心复合物，偶联抗体的磁性纳米粒子还可与少量游离的红细胞结合形成红细胞-rbc抗体复合物；3）使用环形电磁套套设在试管外侧，通过改变电流的方向和强度控制电磁套的磁极和磁性的大小，混匀吸磁1min，使结合磁性纳米粒子的红细胞双抗体夹心复合物、红细胞-rbc抗体复合物向磁铁方向聚集。7.一种全血中分离红细胞的方法，其特征在于，应用权利要求5所述的试剂盒，包括至少以下步骤：1）在试管加入具有荧光标记的偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子，然后加入全血，轻轻吹打混匀，使偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子与红细胞上的补体受体特异性结合；2）继续在试管中加入偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子，使偶联抗rbc抗体的磁性纳米粒子与红细胞表面rbc抗原特异性结合，偶联抗体的磁性纳米粒子与结合红细胞补体受体抗体的红细胞结合形成红细胞双抗体夹心复合物，偶联抗体的磁性纳米粒子还可与少量游离的红细胞结合形成红细胞-rbc抗体复合物；3）使用环形电磁套套设在试管外侧，通过改变电流的方向和强度控制电磁套的磁极和磁性的大小，混匀吸磁1min，使结合磁性纳米粒子的红细胞双抗体夹心复合物、红细胞-rbc抗体复合物向磁铁方向聚集；4）使用荧光检测仪通过试管底透明区照射，通过检测试管中间分离的血浆/血清是否有过量的荧光生物粒子滞留，若试管中间荧光值未超阈值，则可进行后续的血样取样，若试管中间荧光值超过阈值，则代表有过量荧光生物粒子滞留，不能进行血样的取样。

技术总结
本发明属于细胞分离技术领域，提出一种全血中分离红细胞的试剂盒，包括偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子、偶联抗RBC抗体的磁性纳米粒子。由于红细胞上有补体受体，偶联红细胞补体受体抗体的生物粒子与红细胞上的补体受体特异性结合，不占用红细胞表面RBC抗原位点，更便利于红细胞与免疫磁性纳米粒子快速有效的结合，并且免疫生物粒子预先富集红细胞，形成细胞簇，再与免疫磁性纳米粒子结合，起到放大结合红细胞作用，节省磁性纳米粒子的使用量，生物粒子的成本低于磁性纳米粒子，节省了试剂盒的成本。试剂盒的成本。试剂盒的成本。


技术研发人员：范永刚 魏华英 李慧 王俊水 李轩 周洪锐 李昀地 赵娜 肖福磊 秦月 钱龙 孟佳
受保护的技术使用者：天津中新科炬生物制药股份有限公司
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/9/13