一种温敏性细胞微载体及其制备方法，以及培养细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物医用新材料领域，特别涉及一种温敏性细胞微载体及其制备方法，以及培养细胞的方法。


背景技术：

2.再生医学和细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，都需要大量的细胞。但是目前细胞的扩大培养成本极高。原有二维培养模式已经不能满足需求，因此提出了三维细胞培养模式(参见fronk a and e vargis.methods for culturing retinal pigment epithelial cells:a review of current protocols and future recommendations.journal of tissue engineering,7:1-23)。在现有的三维细胞培养模式中，ge公司的聚苯乙烯微球是主流的培养载体，其优点在于结合了多孔材料的高比表面积和聚苯乙烯微球接近水的密度可以实现扩大培养。但其细胞粘附在球上难以脱附且胰酶脱附可能破坏细胞的蛋白结构，这使得这种培养方式成本较高，且操作复杂。所以，利用温敏材料的亲疏水温度响应性，让细胞在低温时自行脱附而避开胰酶是一种可行的方法。这样获得的细胞表面结构没有经过胰酶的破坏，且温敏材料的循环再生能力使得这种培养载体可以重复使用。而且在细胞培养过程中，温敏材料必须具备低毒性。
3.目前，常用的温敏材料大都使用的聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)，但是pnipam有一定的细胞毒性，且分子量越大，细胞毒性越大。理论上，利用温敏材料的亲疏水温度响应性可实现细胞脱附，但是实际应用中，并不是任意的温敏材料结合到基体微球后都能较好的实现细胞粘附和脱附，且有些还具有较大的细胞毒性，并不能达到理想的实际应用效果。因此，细胞载体的开发还面临较大的挑战。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种温敏性细胞微载体及其制备方法，以及培养细胞的方法。本发明提供的温敏性细胞微载体细胞毒性极低，且可以实现高效的细胞粘附和脱附；以其作为载体去培养细胞时，给细胞生长提供三维空间，与二维平面相比，可实现细胞扩增，降低细胞培养的成本，同时具备保护细胞表面蛋白的作用。
5.本发明提供了一种温敏性细胞微载体，包括玻璃微球和接枝在所述玻璃微球表面的温敏聚合物；所述温敏性细胞微载体的结构如式(l)所示：
[0006][0007]
其中：
[0008]
代表玻璃微球；
[0009]
m、n为聚合度，m为2～8，n为30～120；
[0010]
j、k为对应结构单元的摩尔百分比，j+k＝1，0％≤j/(j+k)≤10％，90％≤k/(j+k)≤100％。
[0011]
优选的，所述温敏聚合物在所述温敏性细胞微载体中的质量分数≥1％。
[0012]
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的温敏性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
a)对玻璃微球进行表面羟基化处理，得到表面羟基化微球；利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理，得到氨基化玻璃微球；
[0014]
b)谷氨酸与丙炔醇反应，生成式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸；所述式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应，生成式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐；
[0015][0016]
c)将步骤a)所得氨基化玻璃微球与步骤b)所得式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐进行反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球；
[0017]
d)将所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与叠氮聚乙二醇进行反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球微载体；
[0018]
其中，步骤a)和步骤b)没有顺序限制。
[0019]
优选的，步骤d)中，所述叠氮聚乙二醇中的聚合度为2～8；
[0020]
步骤a)中，所述氨基硅烷偶联剂为kh550。
[0021]
优选的，步骤a)中，利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理的条件为：温度60～120℃，时间4～24小时。
[0022]
优选的，步骤b)中，谷氨酸与丙炔醇反应的条件为：温度0～8℃，时间8～12小时。
[0023]
优选的，步骤b)中，式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应的条件为：温度25～55℃，时间0.5～3小时。
[0024]
优选的，步骤c)中，所述反应的条件为：温度25～40℃，时间3～7天；
[0025]
步骤d)中，所述反应的条件为：温度30～50℃，时间3～7天。
[0026]
优选的，步骤a)中：
[0027]
所述表面羟基化处理的过程为：将玻璃微球在混合溶液中浸泡使玻璃微球表面羟基化，然后，固液分离，得到表面羟基化微球；
[0028]
其中，所述混合溶液为硫酸溶液与过氧化氢溶液的混合物，其中的h2so4与过氧化氢的摩尔比为7:3；所述浸泡的条件为：温度40～80℃，时间1～4小时；
[0029]
利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理的过程包括：将表面羟基化微球、溶剂和氨基硅烷偶联剂混合反应，得到氨基化玻璃微球；
[0030]
步骤c)具体包括：将氨基化玻璃微球分散在无水有机溶剂中，加入式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐，在保护性气氛下搅拌反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球；
[0031]
步骤d)具体包括：将表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与有机溶剂混合，情性气体鼓泡一段时间，加入五水硫酸铜和叠氮聚乙二醇，继续鼓泡一段时间，再加入抗坏血酸钠，在情性气体氛围下进行点击化学反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球。
[0032]
本发明还提供了一种培养细胞的方法，其中采用的培养载体为上述技术方案中所述的温敏性细胞微载体或上述技术方案中所述的制备方法制得的温敏性细胞微载体。
[0033]
本发明提供的制备方法，以玻璃微球作为基础材料进行表面羟基化，再利用氨基硅烷偶联剂进行氨基化改性，然后引发丙炔醇改性的谷氨酸n-羧酸酐(nca)聚合在玻璃微球表面，最后与叠氮低聚乙二醇进行点击化学反应，得到表面覆盖一层细胞相容性良好的温敏高分子玻璃微球。本发明制得的温敏性细胞微载体，细胞毒性极低，生物安全性好；而且，其具有温敏性能，能够实现高效的细胞粘附和脱附，在低温环境下有效脱附细胞；以其作为载体去培养细胞时，给细胞生长提供三维空间，与二维平面相比，可实现细胞扩增，降低细胞培养的成本，同时具备保护细胞表面蛋白的作用；此外，所得温敏玻璃微球载体具有可重复使用功能；另外，上述制备方法简单、条件温和、易于操作，原料来源低毒或无毒且价格低廉，有利于规模化生产应用。
[0034]
试验结果表明，本发明制备的温敏玻璃微球载体，可成功粘附细胞，同时可使细胞脱附率达到78％以上，表现出高效的细胞脱附性；细胞存活率达到91.9％以上，表现出极低的细胞毒性和极高的生物安全性。
附图说明
[0035]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0036]
图1为本发明实施例4所得温敏玻璃微球载体的sem图；
[0037]
图2为本发明实施例4所得温敏玻璃微球载体培养细胞在荧光显微镜下的观测图；
[0038]
图3为本发明实施例1～4所得温敏玻璃微球载体的温敏脱附曲线图。
具体实施方式
[0039]
本发明提供了一种温敏性细胞微载体，包括玻璃微球和接枝在所述玻璃微球表面的温敏聚合物；所述温敏性细胞微载体的结构如式(l)所示：
[0040][0041]
其中：
[0042]
代表玻璃微球；
[0043]
m、n为聚合度；m为2～8，具体可为2、3、4、5、6、7、8，更优选为2、3、4、6、8。n为30～120，具体可为30、40、50、60、70、80、90、100、110、120。
[0044]
j、k为对应结构单元的摩尔百分比(具体为占j与k对应结构单元总量的摩尔百分比)，j+k＝1(即100％)，0％≤j/(j+k)≤10％(也可直接以0％≤j≤10％表示)，具体可为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％；90％≤k/(j+k)≤100％(也可直接以90％≤k≤100％表示)，具体可为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
[0045]
本发明中，温敏聚合物均匀分布在玻璃微球表面形成温敏层，所述温敏聚合物在所述温敏性细胞微载体中的质量分数优选为≥1％，更优选为1％～2％。
[0046]
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的温敏性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：
[0047]
a)对玻璃微球进行表面羟基化处理，得到表面羟基化微球；利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理，得到氨基化玻璃微球；
[0048]
b)谷氨酸与丙炔醇反应，生成式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸；所述式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应，生成式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐；
[0049][0050]
c)将步骤a)所得氨基化玻璃微球与步骤b)所得式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐进行反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球；
[0051]
d)将所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与叠氮聚乙二醇进行反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球微载体；
[0052]
其中，步骤a)和步骤b)没有顺序限制。
[0053]
本发明提供的制备方法，以玻璃微球作为基础材料进行表面羟基化，再利用氨基硅烷偶联剂进行氨基化改性，然后引发丙炔醇改性的谷氨酸n-羧酸酐(nca)聚合在玻璃微球表面，最后与叠氮低聚乙二醇进行点击化学反应，得到表面覆盖一层细胞相容性良好的温敏高分子玻璃微球。
[0054]
关于步骤a)：
[0055]
a)对玻璃微球进行表面羟基化处理，得到表面羟基化微球；利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理，得到氨基化玻璃微球。
[0056]
按照本发明，先对玻璃微球进行表面羟基化处理，得到表面羟基化微球。
[0057]
本发明中，进行上述表面羟基化处理的过程优选为：将玻璃微球在混合溶液中浸泡使玻璃微球表面羟基化，然后，固液分离，得到表面羟基化微球。
[0058]
其中：
[0059]
所述玻璃微球作为制备细胞微载体的基础材料，其粒径优选为100～300μm，具体可为100μm、150μm、200μm、250μm、300μm。
[0060]
所述混合溶液优选为硫酸溶液与过氧化氢溶液的混合物，其中的h2so4与过氧化氢的摩尔比优选为7:3。所述混合溶液与玻璃微球的用量关系没有特殊限制，能够将玻璃微球完全浸没于混合溶液中即可。
[0061]
所述浸泡的温度条件优选为40～80℃，具体可为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。所述浸泡的时间优选为1～4h，具体可为1h、2h、3h、4h。经上述浸泡处理，玻璃微球表面发生羟基化。
[0062]
所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规分离方式即可，例如过滤、或将微球捞出等。经固液分离后，得到表面羟基化玻璃微球。
[0063]
按照本发明，在得到表面羟基化微球后，利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理，得到氨基化玻璃微球。
[0064]
本发明中，所述氨基硅烷偶联剂优选为kh550，采用上述氨基硅烷偶联剂，使玻璃微球表面结合上一定链结构的氨基链，有利于后续制备及提高产品效果。利用上述氨基硅烷偶联剂使表面羟基化微球转变成氨基化玻璃微球的反应路线如下：
[0065][0066]
本发明中，利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理的过程优选包括：将表面羟基化微球、溶剂和氨基硅烷偶联剂混合反应，得到氨基化玻璃微球。
[0067]
其中：
[0068]
所述溶剂优选为甲苯和/或乙醇。所述玻璃微球(即羟基化处理前的初始玻璃微球)与溶剂的用量比优选为1g:(10～100)ml，具体可为1g:10ml、1g:20ml、1g:30ml、1g:40ml、1g:50ml、1g:60ml、1g:70ml、1g:80ml、1g:90ml、1g:100ml。
[0069]
所述氨基硅烷偶联剂的种类如前文所述，不再赘述。所述玻璃微球(即羟基化处理前的初始玻璃微球)与氨基硅烷偶联剂的用量比优选为1g:a ml，a≥0.4；更优选为1g:(0.4～1.4)ml，具体可为1g:0.4ml、1g:0.5ml、1g:0.6ml、1g:0.7ml、1g:0.8ml、1g:0.9ml、1g:
1.0ml、1g:1.1ml、1g:1.2ml、1g:1.3ml、1g:1.4ml。
[0070]
所述反应的温度优选为60～120℃，具体可为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃，更优选为80℃。所述反应的时间优选为4～24h，具体可为4h、8h、12h、16h、20h、24h。所述反应优选在搅拌条件下进行。所述搅拌的速率优选为1000～2500rpm，具体可为1000rpm、1500rpm、2000rpm、2500rpm。
[0071]
在上述反应后，优选还进行清洗。所述清洗优选为用去离子水清洗。经上述处理后，得到氨基化玻璃微球。
[0072]
关于步骤b)：
[0073]
b)谷氨酸与丙炔醇反应，生成式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸；所述式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应，生成式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐。
[0074]
按照本发明，先将谷氨酸与丙炔醇反应，生成式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸。其反应路线如下：
[0075][0076]
本发明中，所述谷氨酸与丙炔醇的用量比优选为20g:(30～60)ml，具体可为20g:30ml、20g:35ml、20g:40ml、20g:45ml、20g:50ml、20g:55ml、20g:60ml。
[0077]
本发明中，所述反应优选在浓硫酸催化剂的作用下进行。本发明中，所述谷氨酸与浓硫酸的用量比优选为20g:(8～16)ml，具体可为20g:8ml、20g:9ml、20g:10ml、20g:11ml、20g:12ml、20g:13ml、20g:14ml、20g:15ml、20g:16ml。
[0078]
本发明中，所述反应的温度条件优选为0～8℃，具体可为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃。所述反应的时间优选为8～12h，具体可为8h、9h、10h、11h、12h。
[0079]
所述反应后，优选还进行中和处理，去中和前序环节引入的硫酸。所述中和处理优选为利用饱和碳酸氢钠溶液进行中和处理。所述饱和碳酸氢钠溶液与浓硫酸的体积比优选为1:(0.8～1)。
[0080]
本发明中，经上述中和处理后，优选还进行过滤和重结晶。其中，所述重结晶采用的溶剂优选为甲醇水溶液。所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比优选为1:(0.3～0.7)。经重结晶后，过滤除去溶剂，得到白色粉末，即为式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸(gap)。
[0081]
本发明中，上述反应过程优选具体包括：将谷氨酸与丙炔醇混合，冰浴搅拌下加入浓硫酸，反应过夜，得到反应液；将反应液与饱和碳酸氢钠溶液混合进行中和处理，然后滤去溶液，在甲醇水溶液中进行重结晶，之后再滤去溶剂，得到白色粉末，即式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸(gap)。
[0082]
按照本发明，在得到式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸后，将式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应，生成式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐。其反应路线如下：
[0083]
[0084]
本发明中，所述谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的质量比优选为20:(6～15)，具体可为20:6、20:7、20:8、20:9、20:10、20:11、20:12、20:13、20:14、20:15。
[0085]
本发明中，所述反应优选在溶剂介质中进行。所述溶剂优选为四氢呋喃(thf)。所述谷氨酸与溶剂的用量比优选为20g:(150～400)ml。
[0086]
本发明中，所述反应的温度优选为25～55℃，具体可为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。所述反应的时间优选为0.5～3h，具体可为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h。
[0087]
本发明中，经上述反应后，优选还进行以下后处理：旋蒸除去溶剂。经上述处理后，得到式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐(gap-nca)。
[0088]
本发明中，上述步骤a)和步骤b)没有顺序限制。
[0089]
关于步骤c)：
[0090]
c)将步骤a)所得氨基化玻璃微球与步骤b)所得式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐进行反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球。
[0091]
该步骤的反应路线如下：
[0092][0093]
本发明中，所述氨基化玻璃微球与式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐的质量比优选为0.1:(0.1～2)，具体可为0.1:0.1、0.1:0.2、0.1:0.3、0.1:0.4、0.1:0.5、0.1:0.6、0.1:0.7、0.1:0.9、0.1:1.0、0.1:1.1、0.1:1.2、0.1:1.3、0.1:1.4、0.1:1.5、0.1:1.6、0.1:1.7、0.1:1.8、0.1:1.9、0.1:2.0。
[0094]
本发明中，所述反应优选在无水有机溶剂介质中进行。所述无水有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷、四氢呋喃和三氯甲烷中的至少一种。本发明中，所述氨基化玻璃微球与无水有机溶剂的用量比优选为100mg:(6～10)ml，具体可为100mg:6ml、100mg:7ml、100mg:8ml、100mg:9ml、100mg:10ml。
[0095]
本发明中，所述反应优选在保护性气氛下进行。本发明对提供保护性气氛的气体种类没有特殊限制，为本领域常规保护性气体即可，如氮气或氩气等。
[0096]
本发明中，所述反应的温度优选为25～40℃，具体可为25℃、30℃、35℃、40℃。所述反应的时间优选为3～7天，具体可为3天、4天、5天、6天、7天。本发明中，所述反应的过程中优选伴随搅拌。所述搅拌的速率优选为200～1000rpm。通过上述反应，体系中生成了表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球。
[0097]
本发明中，所述步骤c)优选具体包括：将氨基化玻璃微球分散在无水有机溶剂中，加入式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐，在保护性气氛下搅拌反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球。
[0098]
本发明中，经上述反应后，优选还进行如下后处理：固液分离、洗涤和干燥。其中，所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规方式即可，如过滤等。所述洗涤优选为用有机溶剂洗涤；所采用有机溶剂的种类优选与前文反应过程中采用的无水有机溶剂介质相同。所述干燥优选为真空干燥。所述干燥的温度优选为30～80℃。经以上后
处理，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球。
[0099]
关于步骤d)：
[0100]
d)将所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与叠氮聚乙二醇进行反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球微载体。
[0101]
该步骤的反应路线如下：
[0102][0103]
本发明中，所述叠氮聚乙二醇(n
3-peg)的聚合度m优选为2～8，若采用聚合度过高的叠氮聚乙二醇或采用m为1的叠氮基乙醇，则会使最终产品无法有效粘附细胞，本发明控制在上述聚合度下才能够高效实现细胞粘附。所述聚合度m具体可为2、3、4、5、6、7、8，更优选为2、3、4、6、8。而且，上述叠氮聚乙二醇中聚乙二醇主链为单纯聚乙二醇，若该主链上含其它取代基或接枝了其它分子链则会导致产品的效果变差甚至没有效果。本发明对所述叠氮聚乙二醇的来源没特殊限制，为市售商业品或按照本领域技术人员熟知的常规制备方法制得即可。
[0104]
本发明中，所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与叠氮聚乙二醇的用量比优选为100mg:(10～100)μl，具体可为100mg:10μl、100mg:20μl、100mg:30μl、100mg:40μl、100mg:50μl、100mg:60μl、100mg:70μl、100mg:80μl、100mg:90μl、100mg:100μl，更优选为100mg:50μl。
[0105]
本发明中，所述反应优选在保护性气氛下进行。本发明对提供保护性气氛的气体种类没有特殊限制，为本领域常规保护性气体即可，如氮气或氩气等。
[0106]
本发明中，所述反应优选在催化剂的作用下进行。所述催化剂优选为五水硫酸铜和抗坏血酸钠。其中，所述五水硫酸铜的质量优选为所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球质量的10％～30％，具体可为10％、15％、20％、25％、30％，更优选为20％。所述抗坏血酸钠的质量优选为所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球质量的20％～60％，具体可为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％，更优选为40％。
[0107]
本发明中，所述反应优选在有机溶剂介质中进行。所述有机溶剂优选为二甲基亚砜(dmso)和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中的至少一种。本发明中，所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与有机溶剂的用量比优选为100mg:(10～30)ml，具体可为100mg:10ml、100mg:20ml、100mg:30ml。
[0108]
本发明中，所述反应的温度优选为30～50℃，具体可为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。所述反应的时间优选为3～7天，具体可为3天、4天、5天、6天、7天。在上述条件下发生点击化学反应，体系中生成了表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球。
[0109]
本发明中，所述步骤d)优选具体包括：将表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与有机溶剂混合，情性气体鼓泡一段时间，加入五水硫酸铜和叠氮聚乙二醇，继续鼓泡一段时间，再
加入抗坏血酸钠，在情性气体氛围下进行点击化学反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球。其中，第一次鼓泡的时间优选为10～50分钟，具体可为10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟，更优选为30分钟；第二次鼓泡(即所述继续鼓泡)的时间优选为3～30分钟，具体可为3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟，更优选为10分钟。
[0110]
本发明中，经上述反应后，优选还进行如下后处理：固液分离、洗涤和干燥。其中，所述固液分离的方式没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规方式即可，如过滤等。所述洗涤优选为用去离子水洗涤。所述干燥优选为真空干燥。所述干燥的温度优选为30～80℃。经以上后处理，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球(g-pgap-g-meom)，即温敏性细胞微载体。
[0111]
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的制备方法制得的温敏性细胞微载体。
[0112]
本发明制备的温敏性细胞微载体，玻璃微球表面接枝的温敏聚合物主链为聚谷氨酸，聚谷氨酸的侧基为低聚乙二醇，低聚乙二醇数量可达到聚谷氨酸结构单元数量的90％以上；温敏聚合物均匀分布在玻璃微球表面形成温敏层，质量分数可达1％以上。
[0113]
本发明还提供了一种培养细胞的方法，其中的培养载体为上述技术方案中所述的温敏性细胞微载体。
[0114]
本发明提供的制备方法，以玻璃微球作为基础材料进行表面羟基化，再利用氨基硅烷偶联剂进行氨基化改性，然后引发丙炔醇改性的谷氨酸n-羧酸酐(nca)聚合在玻璃微球表面，最后与叠氮低聚乙二醇进行点击化学反应，得到表面覆盖一层细胞相容性良好的温敏高分子玻璃微球。本发明制得的温敏性细胞微载体，细胞毒性极低，生物安全性好；而且，其具有温敏性能，能够实现高效的细胞粘附和脱附，在低温环境下有效脱附细胞；以其作为载体去培养细胞时，给细胞生长提供三维空间，与二维平面相比，可实现细胞扩增，降低细胞培养的成本，同时具备保护细胞表面蛋白的作用；此外，所得温敏玻璃微球载体具有可重复使用功能；另外，上述制备方法简单、条件温和、易于操作，原料来源低毒或无毒且价格低廉，有利于规模化生产应用。
[0115]
试验结果表明，本发明制备的温敏玻璃微球载体，可成功粘附细胞，同时可使细胞脱附率达到78％以上，表现出高效的细胞脱附性；细胞存活率达到91.9％以上，表现出极低的细胞毒性和极高的生物安全性。
[0116]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0117]
实施例1～4
[0118]
a)取玻璃微球(粒径约200μm)浸泡在混合溶液(硫酸溶液与过氧化氢溶液的混合物，其中的h2so4与过氧化氢的摩尔比为7:3)中，于80℃回流1小时，使玻璃微球表面羟基化，然后取出玻璃微球并洗净。之后，将表面羟基化微球分散于甲苯中，加入氨基硅烷偶联剂kh550，于80℃搅拌过夜后，用去离子水清洗，得到氨基化玻璃微球。
[0119]
按照上述过程分别做4组试验，分别为实施例1～4，试验组和样品均分别记为a、b、c、d(后续步骤中也各步骤产物以a、b、c、d进行贯穿表示)。
[0120]
其中，4组试验的各原料用量等信息参见表1：
[0121]
表1：步骤a)的试验信息
[0122][0123]
b)取20g谷氨酸加入到30ml丙炔醇中，冰浴搅拌下加入8ml浓硫酸反应过夜，然后，加入到饱和碳酸氢钠溶液(饱和碳酸氢钠溶液与浓硫酸的体积比为1:0.9)中进行中和，之后再滤去溶液，在甲醇水溶液中进行重结晶，之后再滤去溶剂，得到白色粉末，即式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸(gap)。
[0124]
将所得全部式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸、6g双(三氯甲基)碳酸酯和200ml四氢呋喃溶剂混合，于50℃反应2小时，然后进行后处理，得到式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐(gap-nca)。
[0125]
c)分别取氨基化玻璃微球a～d各100mg，分别分散在8ml无水dmf中，再加入0.8g式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐(gap-nca)，在25℃氮气环境下搅拌反应3天，再滤去溶液、用有机溶剂清洗微球和真空干燥，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球(g-pgap)。
[0126]
4组试验的试验信息参见表2：
[0127]
表2：步骤c)的试验信息
[0128][0129]
表2中的接枝量是通过热重分析而得，可以看出，样品a～d的表面接枝密度在0.25％～1.05％之间。
[0130]
d)分别取表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球a～d各100mg，加入20ml二甲基亚砜(dmso)，氩气鼓泡30分钟后，加入20mg五水硫酸铜和50μl叠氮低聚乙二醇(聚合度m＝4)，继续鼓泡10分钟，加入40mg抗坏血酸钠，在氩气氛围下40℃进行点击化学反应3天。滤去溶液后，用去离子水冲洗产物，得到接枝低聚乙二醇(聚合度m＝4)的温敏玻璃微球载体(g-pgap-g-meom)。
[0131]
4组试验的试验信息参见表3：
[0132]
表3：步骤d)的试验信息
[0133][0134]
最终得到4个温敏玻璃微球产品(记为a、b、c、d)，分别为实施例1～4的产物。
[0135]
测试例一：产品测试
[0136]
1、sem表征
[0137]
实施例4所得温敏玻璃微球载体的sem图像参见图1。可以看出，本发明所得温敏玻璃微球载体产品的粒度在200μm左右，颗粒分散良好。
[0138]
2、细胞吸附及脱附测试
[0139]
细胞培养：
[0140]
将正常培养的含有绿色荧光蛋白(gfp)细胞通过胰酶消化下来后，离心计数。取24孔板，每个孔板投入100mg温敏玻璃微球和100万的细胞，将gfp细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养48小时。
[0141]
取培养48小时后的24孔板，在显微镜下观测gfp蛋白的表达，具体是用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。其中，实施例4的效果参见图2(标尺100μm)，可以看出，细胞成功粘附。
[0142]
细胞成功粘附后，将上述培养孔板置于4℃冰箱中一定时间(分别是2分钟、5分钟、10分钟、30分钟)，然后轻轻吹打一下，吸取上清液，对细胞计数，可以观察到细胞在低温下逐渐脱附。同时取30分钟后的温敏玻璃微球加入胰酶消化未脱附的细胞，计算细胞脱附率，计算公式如下：
[0143]
细胞温敏脱附率(％)＝a/(a+b)
×
100；
[0144]
其中，a是温敏脱附下来细胞的数量，b是胰酶消化下来细胞的数量；每组实验重复三次，取平均值作为测试结果。
[0145]
脱附率结果参见图3，可以看出，随着时间延长，空白对照组(即control组)的脱附率没有明显改变，而实施例1～4组，细胞脱附效果明显提高，尤其是在10分钟以后。各组30分钟后的脱附效率参见表4：
[0146]
表4：细胞脱附率
[0147]
培养载体种类细胞温敏脱附率(％)无(即空白组)2实施例178实施例281实施例387实施例495
[0148]
3、细胞毒性测试
[0149]
采用细胞计数试剂cck-8评价温敏玻璃微球的细胞毒性：
[0150]
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用培养基稀释，按每孔1
×
104细胞的密度接种于96孔培养板，加入50mg温敏玻璃微球后，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。吸出细胞培养液后，每个孔加入100μl的10％ cck-8培养基，置于37℃培养箱培养1小时。然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用450nm。细胞存活率按下公式计算：
[0151]
细胞存活率(％)＝(a
sample
/a
control
)
×
100；
[0152]
其中，a
sample
是加入温敏玻璃微球的细胞样品孔的吸收，a
control
是未加入温敏玻璃微球的细胞样品孔的吸收；每组实验重复三次，取平均值作为测试结果。
[0153]
测试结果参见表5：
[0154]
表5：细胞存活率
[0155]
培养载体种类细胞存活率(％)实施例196.1实施例294.1实施例395.0实施例491.9
[0156]
由表5测试结果可以看出，采用本发明所得温敏玻璃微球作为培养载体，能够使细胞存活率达到91.9％以上，表现出极低的细胞毒性和极高的生物安全性。
[0157]
实施例5按照实施例4的制备过程实施，不同的是，步骤d)中叠氮聚乙二醇的聚合度调整为2。
[0158]
对比例1
[0159]
按照实施例4的制备过程实施，不同的是，步骤d)中叠氮聚乙二醇的聚合度调整为1，即采用叠氮基乙醇。
[0160]
对比例2
[0161]
按照实施例4的制备过程实施，不同的是，步骤d)中叠氮聚乙二醇的聚合度调整为10。
[0162]
测试例二：产品测试
[0163]
按照测试例一中的测试方法对实施例5及对比例1～2所得产品进行测试，结果参见表6。
[0164]
表6：各实施例及对比例的测试结果
[0165]
培养载体种类细胞脱附率(％)细胞存活率(％)实施例59594对比例1590对比例2389
[0166]
由表6结合表4～5的测试结果可以看出，本发明实施例1～5所得温敏玻璃微球载体可使细胞脱附率达到78％以上，表现出高效的细胞脱附性；细胞存活率达到91.9％以上，表现出极低的细胞毒性和极高的生物安全性。与实施例1～5相比，对比例1～2的细胞脱附率显著降低、细胞存活率也降低，证明本发明引入叠氮聚乙二醇并控制叠氮聚乙二醇中的聚合度在一定范围内，有利于提高细胞粘附及脱附性以及降低细胞毒性。
[0167]
需要说明的是，本领域对于玻璃微球的定义为：玻璃微球(微球)是一种粒径为15
～300μm不等中空密闭的正球形、粉沫状的超轻质填充材料。因此，对于玻璃微球的界定属于本领域公知常识，此处不再累述。
[0168]
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有近似于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

技术特征：
1.一种温敏性细胞微载体，其特征在于，包括玻璃微球和接枝在所述玻璃微球表面的温敏聚合物；所述温敏性细胞微载体的结构如式(l)所示：其中：代表玻璃微球；m、n为聚合度，m为2～8，n为30～120；j、k为对应结构单元的摩尔百分比，j+k＝1，0％≤j/(j+k)≤10％，90％≤k/(j+k)≤100％。2.根据权利要求1所述的温敏性细胞微载体，其特征在于，所述温敏聚合物在所述温敏性细胞微载体中的质量分数≥1％。3.一种权利要求1～2中任一项所述的温敏性细胞微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)对玻璃微球进行表面羟基化处理，得到表面羟基化微球；利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理，得到氨基化玻璃微球；b)谷氨酸与丙炔醇反应，生成式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸；所述式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应，生成式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐；c)将步骤a)所得氨基化玻璃微球与步骤b)所得式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐进行反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球；d)将所述表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与叠氮聚乙二醇进行反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球微载体；其中，步骤a)和步骤b)没有顺序限制。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中，所述叠氮聚乙二醇中的聚合度为2～8；步骤a)中，所述氨基硅烷偶联剂为kh550。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中，利用氨基硅烷偶联剂对所
述表面羟基化微球进行处理的条件为：温度60～120℃，时间4～24小时。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，谷氨酸与丙炔醇反应的条件为：温度0～8℃，时间8～12小时。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，式(1)所示丙炔醇改性谷氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯反应的条件为：温度25～55℃，时间0.5～3小时。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，所述反应的条件为：温度25～40℃，时间3～7天；步骤d)中，所述反应的条件为：温度30～50℃，时间3～7天。9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中：所述表面羟基化处理的过程为：将玻璃微球在混合溶液中浸泡使玻璃微球表面羟基化，然后，固液分离，得到表面羟基化微球；其中，所述混合溶液为硫酸溶液与过氧化氢溶液的混合物，其中的h2so4与过氧化氢的摩尔比为7:3；所述浸泡的条件为：温度40～80℃，时间1～4小时；利用氨基硅烷偶联剂对所述表面羟基化微球进行处理的过程包括：将表面羟基化微球、溶剂和氨基硅烷偶联剂混合反应，得到氨基化玻璃微球；步骤c)具体包括：将氨基化玻璃微球分散在无水有机溶剂中，加入式(2)所示丙炔醇改性谷氨酸n-羧酸酐，在保护性气氛下搅拌反应，得到表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球；步骤d)具体包括：将表面接枝聚谷氨酸的玻璃微球与有机溶剂混合，情性气体鼓泡一段时间，加入五水硫酸铜和叠氮聚乙二醇，继续鼓泡一段时间，再加入抗坏血酸钠，在情性气体氛围下进行点击化学反应，得到表面修饰聚谷氨酸衍生物的玻璃微球。10.一种培养细胞的方法，其特征在于，其中采用的培养载体为权利要求1～2中任一项所述的温敏性细胞微载体或权利要求3～9中任一项所述的制备方法制得的温敏性细胞微载体。

技术总结
本发明提供了一种温敏性细胞微载体及其制备方法，以及培养细胞的方法。本发明提供的制备方法，以玻璃微球作为基础材料进行表面羟基化，再利用氨基硅烷偶联剂进行氨基化改性，然后引发丙炔醇改性的谷氨酸N-羧酸酐(NCA)聚合在玻璃微球表面，最后与叠氮低聚乙二醇进行点击化学反应，得到表面覆盖一层细胞相容性良好的温敏高分子玻璃微球。本发明制得的温敏性细胞微载体，细胞毒性极低，生物安全性好；而且，其具有温敏性能，能够实现高效的细胞粘附和脱附，在低温环境下有效脱附细胞；以其作为载体去培养细胞时，给细胞生长提供三维空间，与二维平面相比，可实现细胞扩增，降低细胞培养的成本，同时具备保护细胞表面蛋白的作用。同时具备保护细胞表面蛋白的作用。


技术研发人员：田华雨 罗智敏 郝凯 刘璁
受保护的技术使用者：嘉庚创新实验室
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/13