居泉沙雷氏菌及应用

1.本发明属于微生物领域，涉及一种居泉沙雷氏菌及应用，尤其涉及一种居泉沙雷氏菌及对在促生五味子时的应用。


背景技术：

2.植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，简称pgpr)是指天然存在于根际环境中并且可以促进植物生长的有益微生物。根际微生物包括细菌、真菌、放线菌、原生动物和藻类。然而，细菌是根际中存在的最丰富的微生物。pgpr诱发的促生过程通常是增加土壤中有限的养分并改善其吸收过程来促进植物生长。
3.五味子是多年生木兰科、五味子属植物的干燥成熟果实。五味子具有肝保护、神经保护、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、解毒、抗凋亡和免疫刺激活性等功能。为了促进五味子生长提高产量，五味子种植者大多会使用化肥和农药，然而，过量的化肥会降低土壤肥力，抑制有益微生物的生长，并污染含水层。还有种植者使用天然肥料，尽管天然肥料作用效果好，但是动物粪便中存在的重金属可能会导致天然肥料存在致癌风险。因此，寻找一种不使用传统化肥和农药并且能够促进五味子生长的方法成为五味子产业持续发展的重要举措。


技术实现要素：

4.为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种能够促进五味子生长以及可在提高五味子产量和品质提供理论依据的居泉沙雷氏菌及应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一株居泉沙雷氏菌，其特征在于：所述居泉沙雷氏菌是serratia fonticola 142，所述serratia fonticola 142已于2023年5月19日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学；保藏编号是cctccno：m 2023780。
7.上述居泉沙雷氏菌的固氮能力d/d值为1.56
±
0.07、溶有机磷能力d/d值为2.06
±
0.07、溶无机磷能力d/d值为1.47
±
0.06、产吲哚乙酸含量为52.34
±
1.91mg/l、铁载体表达量为49.65
±
1.80％、产acc脱氨酶能力od
600
为0.22
±
0.01。
8.如前所述的居泉沙雷氏菌在促生五味子时的应用。
9.如前所述的居泉沙雷氏菌在促生五味子幼苗时的应用。
10.如前所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗株高时的应用。
11.如前所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗茎粗时的应用。
12.如前所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗生物量时的应用。
13.如前所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗叶片叶绿素含量时的应用。
14.如前所述的居泉沙雷氏菌在制备微生物菌肥时的应用。
15.如前所述的居泉沙雷氏菌在制备五味子根部用微生物菌肥时的应用。
16.本发明的优点是：
17.本发明提供了一种居泉沙雷氏菌及应用，是从五味子根及根际土中筛选出促生菌，对其进行分子生物学鉴定，筛选出具有多重促生性能且能够促进五味子生长的菌株，该居泉沙雷氏菌具有固氮、溶磷、产吲哚乙酸(iaa)、产铁载体和产acc脱氨酶能力，作为促进生长剂可以促进五味子幼苗生长，尤其是对五味子幼苗生物量促进效果显著，可用于五味子大田生产中，为提高五味子产量和品质提供理论依据。
附图说明
18.图1是五味子根际环境分离菌株各属占比。
19.图2是serratia fonticola 142对五味子幼苗生长的影响。
20.图3是基于16s rdna序列构建的serratia fonticola 142系统发育树。
21.图4是serratia fonticola 142在lb培养基上的菌落特征。
22.图5是serratia fonticola 142固氮能力复筛结果。
23.图6是serratia fonticola 142溶有机磷能力复筛结果。
24.图7是serratia fonticola 142溶无机磷能力复筛结果。
25.图8是产吲哚乙酸(iaa)含量在50.00mg/l以上的8株菌株显色结果。
具体实施方式
26.以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
27.本试验从陕西省柞水县曹坪镇五味子种植基地的五味子根和根际土壤样品中，筛选出1株促生能力较强的居泉沙雷氏菌，探究了其对五味子幼苗生长的影响，为相关研究提供菌种资源。居泉沙雷氏菌是serratia fonticola 142，serratia fonticola 142已于2023年5月19日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是cctcc no：m 2023780。
28.下面对该serratia fonticola 142的分离筛选方法及性能进行说明。
29.1材料与方法
30.1.1根际细菌的分离和鉴定
31.(1)五味子根表处理：将五味子根表清洗干净，取五味子根之后按照2min 80％乙醇、1min 5％次氯酸钠和2min 80％乙醇浸泡进行表面灭菌，最后用无菌蒸馏水冲洗3次。取1g灭菌后的根，加入9ml无菌水进行研磨至匀浆状态，得到10-1
稀释度的溶液，依次稀释为10-2-10-5
不同稀释度的菌悬液。
32.(2)五味子根际土处理：称取1g根际土壤，加入9ml无菌水振荡混匀，得到10-1
稀释度的溶液，依次稀释为10-2-10-5
不同稀释度的根际土壤菌悬液。
33.(3)细菌培养：取10-3
、10-4
、10-5
的匀浆稀释液(步骤1)所得到的菌悬液)和10-3
、10-4
、10-5
的根际土壤菌悬液(步骤2)所得到的)各100μl涂布于lb平板上，涂布重复3次，在28℃恒温培养箱中倒置培养3d。
34.(4)菌株保藏：通过观察菌落的形态特征，挑取长势良好的细菌单菌落在lb培养基平板上划线分离获得纯菌株，结果如图4所示(是分离得到的菌株中的其中一个进行纯培养的结果)，将菌株保存于4℃斜面和-80℃甘油管。
35.(5)菌株鉴定：对分离得到的菌株使用16s rrna基因通用引物27f/1492r扩增，pcr
产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，测序结果与ncbi比对分析，以获得菌株鉴定结果。
36.(6)菌株发育进化树的构建：选取与促生效果较好的菌株同源性相近的菌株进行系统发育树的构建，采用mega 7.0软件构建系统发育树，结果如图3所示。
37.1.2根际细菌促生能力测定
38.(1)菌株固氮、溶磷、解钾能力测定：配制ashby培养基、蒙金娜有机磷培养基、nbrip无机磷培养基和亚历山大罗夫解钾培养基，用无菌接种环接种菌株培养液于上述培养基中，随后将培养基倒置放于28℃恒温培养箱中培养5d，如有透明圈产生则进行复筛。复筛时将菌株摇菌24h涂布于lb培养基，制成直径为0.8cm的琼脂块接种于上述培养基进行复筛，随后将培养基倒置放于28℃恒温培养箱中培养5d，透明圈直径的大小(d)与菌落直径大小(d)的比值越大表明菌株能力越强。
39.(2)菌株产吲哚乙酸(iaa)能力测定：称取吲哚乙酸(iaa)10mg，先用少量乙醇溶解，后用去离子水定容至100ml，则得到浓度为100mg/l的吲哚乙酸(iaa)标准储备液。配制标准浓度为0、5、10、20、40、60、80、100mg/l的吲哚乙酸(iaa)系列标准溶液，避光保存。取1ml各浓度标准溶液，加入等体积salkowski reagent比色液(1ml0.5 m fecl3与49ml 35％ hclo4混匀)，避光处理30min，用酶标仪在530nm检测吸光值，以吲哚乙酸(iaa)标准浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制吲哚乙酸(iaa)标准曲线。将菌株按照1％的量接种于含有0.2g/l色氨酸的kings液体培养基中28℃摇菌培养3d后，结合吲哚乙酸(iaa)浓度标准曲线，用salkowski比色法测定菌株产吲哚乙酸(iaa)含量。
40.(3)菌株产铁载体能力测定：配制mkb液体培养基，将菌株按照1％的接种量接种于灭菌冷却后的mkb液体培养基内，28℃培养2d后，10000rpm超速离心10min，吸取100μl上清液加入100μl cas检测液，避光反应60min后用酶标仪测定其在630nm处的吸光值a。另取100μl cas检测液与100μl未接种菌的mkb液体培养基上清液充分混匀避光反应60min后同法测定吸光值(ar)，铁载体表达量＝(ar-a)/ar。
41.(4)菌株产acc脱氨酶能力测定：配制sm液体培养基，在sm液体培养基中加入过滤除菌的1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)，使其浓度为0.5g/l，得到sma液体培养基。在sm培养基中加入(nh4)2so4，使其浓度为0.5g/l，得到smn液体培养基。将菌株按照1％的接种量接种于smn液体培养基中振荡培养20h，4℃离心，用移液枪吸去上清液并收集菌体。用sm培养液洗涤离心两次，菌体悬浮于sm培养液中，并按5％接种量接种于sma液体培养基，28℃培养2d后，以不接菌sm培养液做调零对照，采用分光光度计测定600nm波长处的吸光值a。
42.1.3五味子幼苗盆栽实验评价菌株的促生效果
43.(1)菌株的预处理：将菌株按照1％的接种量接种于50ml lb液体培养基中，28℃培养24h，培养完成后离心去上清菌落数调至l0
8 cfu/l。
44.(2)盆栽接种：基质在121℃灭菌20min，取出风干，放置3天后备用。土壤与基质体积比1：1混合后，将大小均匀的五味子幼苗移植到含有0.9kg土与基质的盆中(14cm
×
12cm)。向每盆幼苗根部土壤中加入50ml菌悬液，对照组不加菌，加50ml无菌水。各处理5个重复，幼苗在25
±
2℃、16h/8h的光/暗循环的培养室中培育，每隔3天浇50ml无菌水，30天后，检测幼苗生长指标。幼苗生长指标包括株高、根长、茎粗、鲜重、干重和叶绿素含量。
45.2结果与分析。
46.2.1根际细菌的分离与鉴定
47.在根际土以及根内分离得到85株菌，经鉴定来自37个属，如图1。其中大多属于芽孢杆菌(bacillus)为优势菌属，有23株，占所有菌株的27.1％；其次是假单胞菌属(pseudomonas)，有11株，占所有菌株的12.9％。serratia fonticola 142是沙雷氏菌属。
48.2.2菌株固氮能力测定
49.从根际环境分离得到的85株细菌中具有固氮能力的菌株有53株。53株固氮菌的固氮圈比值(d/d)在1.25-3.56范围内，其中1.25≤d/d《3.00的细菌有36株，3.00≤d/d≤3.56的细菌有17株。固氮能力最强的菌株为140，d/d值为3.56。d/d值在3.00≤d/d≤3.56范围内的菌株固氮能力较强，见表1。而53株菌中，serratia fonticola 142的固氮能力d/d值仅为1.56
±
0.07，固氮能力并非显著，如图5所示，是本发明对serratia fonticola 142固氮能力的复筛，即serratia fonticola142的固氮能力并非显著。
50.表1固氮能力较强的菌株
[0051][0052]
2.3菌株溶磷(有机磷)能力测定
[0053]
从根际环境分离得到的85株细菌中具有溶磷(有机磷)能力的菌株有10株，具体数据见表2。10株溶磷菌(有机磷)的溶磷圈比值(d/d)在1.07-2.13范围内。溶磷(有机磷)能力最强的菌株为133，d/d值为2.13。serratia fonticola 142的溶磷(有机磷)的溶磷圈比值(d/d)是2.06
±
0.07，如图6，属于具有较强的溶磷(有机磷)能力的菌株。
[0054]
表2溶有机磷能力较强的菌株
[0055][0056]
2.4菌株溶磷(无机磷)能力测定
[0057]
从根际环境分离得到的85株细菌中具有溶磷(无机磷)能力的菌株有7株，具体数据见表3。7株溶磷菌的溶磷圈(无机磷)比值(d/d)在1.33-1.94范围内。溶磷(无机磷)能力最强的菌株为186，d/d值为1.94。serratia fonticola 142的溶磷(无机磷)的溶磷圈比值
(d/d)是
[0058]
1.47
±
0.06，证明该菌具有很强溶解无机磷的能力。参见图7，serratia fonticola 142的溶磷能力的复筛，证实其具有很强的溶解无机磷的能力。
[0059]
表3溶无机磷能力较强的菌株
[0060][0061][0062]
2.5菌株产吲哚乙酸(iaa)能力测定
[0063]
从根际环境分离得到的85株细菌中具有产吲哚乙酸(iaa)能力的菌株有16株。产吲哚乙酸(iaa)含量在20-100mg/l之间，产吲哚乙酸(iaa)最高的菌株为134，iaa含量高达97.38mg/l。产吲哚乙酸(iaa)含量在50.00mg/l以上的菌株有8株，显色结果见图8，数据见表4。
[0064]
表4产吲哚乙酸(iaa)能力较强的菌株
[0065][0066]
2.6菌株产铁载体能力测定
[0067]
从根际环境分离得到的85株细菌中具有产铁载体能力的菌株有67株。产铁载体能力最强的菌株为128，铁载体表达量高达72.25％。铁载体表达量在40％以上的菌株有30株，见表5。
[0068]
表5产铁载体能力较强的菌株
fonticola 142处理过的五味子幼苗株高和茎粗显著高于control和lw79(p《0.05)，株高分别提高198.20％和16.82％，茎粗分别提高53.05％和37.80％。在幼苗根长方面，各处理相比无显著差异(p《0.05)。
[0078]
表7pgpr对五味子幼苗株高、根长和茎粗的影响
[0079][0080]
2.10pgpr对五味子幼苗生物量的影响
[0081]
由表8可知，接种serratia fonticola 142使五味子幼苗地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重都显著高于control处理(p《0.05)，分别提高92.95％、73.95％、111.76％和98.33％。与lw79处理相比，接种serratia fonticola 142使五味子幼苗地上鲜重、地下鲜重和地上干重都显著增加(p《0.05)，分别提高33.88％、61.72％和63.64％。
[0082]
表8pgpr对五味子幼苗生物量的影响
[0083][0084]
2.11pgpr对五味子幼苗叶片叶绿素含量的影响
[0085]
由表9可知，接种serratia fonticola 142使五味子幼苗叶片叶绿素a和总叶绿素a+b含量显著高于control处理(p《0.05)，分别提高42.00％和27.59％。与lw79处理相比，接种serratia fonticola 142使五味子叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素a+b含量都显著增加(p《0.05)，分别提高47.92％、21.21％和35.37％。
[0086]
表9pgpr对五味子叶片叶绿素含量的影响
[0087][0088]
显然，与control处理相比，serratia fonticola 142处理的五味子幼苗株高增加198.20％，茎粗增加53.05％，地上鲜重增加92.95％，地下鲜重增加73.95％，地上干重增加111.76％，地下干重增加98.33％，叶绿素a含量增加42.00％，叶绿素b含量增加8.11％，总叶绿素a+b含量增加27.59％。与lw79(serratia sp.)处理相比，serratia fonticola 142处理的五味子幼苗株高增加16.82％，茎粗增加37.80％，地上鲜重增加33.88％，地下鲜重
增加61.72％％，地上干重增加63.64％，地下干重增加48.75％，叶绿素a含量增加47.92％，叶绿素b含量增加21.21％，总叶绿素a+b含量增加35.37％。说明serratia fonticola 142比同属菌株促生效果好且对五味子幼苗生长具有较强的促生效果，可作为为生物菌肥等方面的应用。

技术特征：
1.一株居泉沙雷氏菌，其特征在于：所述居泉沙雷氏菌是serratia fonticola 142，所述serratia fonticola 142已于2023年5月19日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是cctcc no：m 2023780。2.根据权利要求1所述的居泉沙雷氏菌，其特征在于：所述居泉沙雷氏菌的固氮能力d/d值为1.56
±
0.07、溶有机磷能力d/d值为2.06
±
0.07、溶无机磷能力d/d值为1.47
±
0.06、产吲哚乙酸含量为52.34
±
1.91mg/l、铁载体表达量为49.65
±
1.80％、产acc脱氨酶能力od
600
为0.22
±
0.01。3.根据权利要求1或2所述的居泉沙雷氏菌在促生五味子时的应用。4.根据权利要求3所述的居泉沙雷氏菌在促生五味子幼苗时的应用。5.根据权利要求4所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗株高时的应用。6.根据权利要求4所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗茎粗时的应用。7.根据权利要求4所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗生物量时的应用。8.根据权利要求4所述的居泉沙雷氏菌在提高五味子幼苗叶片叶绿素含量时的应用。9.根据权利要求1或2所述的居泉沙雷氏菌在制备微生物菌肥时的应用。10.根据权利要求9所述的居泉沙雷氏菌在制备五味子根部用微生物菌肥时的应用。

技术总结
本发明属于微生物领域，涉及一种居泉沙雷氏菌及应用，居泉沙雷氏菌是Serratia fonticola142，Serratia fonticola 142已于2023年5月19日提交至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCC NO：M 2023780。本发明提供了一种能够促进五味子幼苗生长的居泉沙雷氏菌及应用。雷氏菌及应用。雷氏菌及应用。


技术研发人员：林雁冰 李艳 宋天骄 丁赞博 吴巧露
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/9/13