一种非小细胞肺癌相关的lncRNA分子标记及其应用

一种非小细胞肺癌相关的lncrna分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种非小细胞肺癌相关的lncrna分子标记及其应用。
技术背景
2.非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,nsclc)是肺癌的主要类型，约占所有肺癌的80％。尽管随着治疗方案的极大进步，但nsclc的预后仍然较差，患者的5年生存率约为15％。nsclc的预后较差的原因之一包括，nsclc在早期缺乏明显的临床表现，大多数患者在出现淋巴转移和远处转移时方被确证。因此，探索一种能够实现对nsclc早期诊断的新生物标志物，是临床当前亟待解决的问题。
3.长链非编码rna(long non-coding rnas,lncrnas)是一种进化上保守的非编码rna，在包括癌症在内的多种人类疾病中扮演着关键的角色。目前大量的研究指出，lncrnas的异常与nsclc的发展、侵袭和转移以及化疗耐药中扮演着关键的角色。lncrna mnx1-as1的表达在nsclc中显著上调，同时lncrna mnx1-as1的异常表达与tnm分期、淋巴结转移以及nsclc的预后显著有关，同时敲除lncrna mnx1-as1可抑制a549的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡(liu g,guo x,zhang y,et al.expression and significance of lncrna mnx1-as1 in non-small cell lung cancer[j].oncotargets and therapy,2019,12:3129.)。
[0004]
大量的研究指出，在nsclc和正常肺组织中lncrna表达谱表达具有显著差异，此外由于lncrnas具有稳定、易检测、经济及无创等点，而且随着rna分子输送技术的提高，这些lncrnas可能作为nsclc早期诊断的生物标志物，也可以为治疗nsclc提供潜在的药物靶点。然而，在nsclc中目前只有少数lncrnas的意义被确定，因此，进一步探索确定其他在nsclc中发挥作用的lncrnas，具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种非小细胞肺癌相关的lncrna分子标记，该lncrna分子标记为lncrna mif-as1，序列为seq id no.1。
[0006]
本发明另一目的在于提供所述的lncrna分子标记在制备非小细胞肺癌筛查与诊断的检测产品中的应用。
[0007]
本发明再一目的在于提供一种非小细胞肺癌诊断用试剂盒，该试剂盒包括用于检测如上所述的lncrna分子标记的引物，或包括与上述lncrna分子标记进行特异性结合的抗体。
[0008]
本发明还提供一种如上所述的lncrna分子标记在制备预测非小细胞肺癌放化疗敏感性的试剂中的应用。
[0009]
本发明的有益效果在于：
[0010]
本发明通过lncrna测序方法分析nsclc患者外周血样本中的lncrna表达谱差异，
发现一种新的lncrna mif-as1在nsclc患者外周血以及nsclc细胞系中表达含量显著上升，试验证明该lncrna mif-as1对nsclc具有诊断价值。同时lncrna mif-as1对nsclc的放化疗敏感性的预测价值优于传统生物标志物cea，表明lncrna mif-as1能够作为nsclc放化疗敏感性的生物标志物。
[0011]
本发明提供的lncrna mif-as1为nsclc的早期诊断提供了一种新的生物标志物，为更进一步的理解nsclc的潜在机制提供新的方向。
附图说明
[0012]
图1为敏感组与耐药组之间差异表达lncrna筛选结果。
[0013]
图2为nsclc中顺铂敏感性相关lncrna差异表达筛选。
[0014]
图3为rt-qpcr试验方法验证lncrna mif-as1在nsclc放化疗敏感组和耐药组之间的表达差异，**p《0.01。
[0015]
图4为nsclc患者血清中lncrna mif-as1含量对nsclc放化疗敏感性的roc曲线分析。
具体实施方式
[0016]
为了便于理解，下面结合试验对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
[0017]
1患者以及样本收集
[0018]
2021至2022年在中国科学院合肥肿瘤医院胸部肿瘤中心就诊的nsclc组患者61例。nsclc患者通过现有的活检样本，病理检查确认为nsclc(依据第8版国际抗癌联盟uicc肺癌tnm分期标准)；入组前接受过放疗、化疗等形式的治疗。本研究符合人体试验伦理学标准，并得到中科院合肥肿瘤医院伦理委员会批准，所有受试者在采集血浆样本前均自愿签署书面知情同意书。
[0019]
2试验
[0020]
2.1lncrna试验
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根据nebnext ultra rna libraryprep kit for illumina(neb，usa)的试剂盒说明书，对rna片段进行第一链和第二链cdna合成，然后通过接头连接和低循环的pcr扩增富集。使用agilent 2200tapestation和qubit对文库进行质检以及定量。质检合格的终文库通过illumina nova测序仪(illumina,usa)在ribobio co.ltd(ribobio,china)以双端150bp的读长即pe150进行高通量测序。最后用edger包软件对数据进行标准化和分析，差异lncrna的标准为logfc绝对值大于0.5且fdr小于0.01。
[0022]
2.2rt-qpcr试验
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使用病毒rna提取试剂(tiangen，北京，中国)来提取总rna。用mrna/lncrna qrt-pcr startert试剂盒(锐博，广州，中国)将总rna反转录成cdna，在abi7300plus快速pcr实时系统(applied biosystems，foster city，ca，usa)上使用prepremix ex taqtmii(takara，大连，中国)进行qpcr测定。反应条件包括在95℃下预变性10分钟，在95℃下变性10秒，在60℃下退火20秒，在72℃下延伸34秒的40个循环。λpolya+rna-a作为内参，用2-δδct方法分析数据。引物由广州锐博生物工程有限公司合成。
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2.3统计学分析
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统计软件spss21.0(ibm公司，armonk，ny，usa)和origin pro 2019(originlab corporation,northampton,ma,usa.)进行统计处理、分析、作图；采用非参数mann-whitney u检验比较不同组别间非小细胞肺癌患者全血中lncrna mif-as1的相对表达水平。使用receiver operating characteristic(roc)曲线和area under the roc curve(auc)评估lncrna mif-as1以及cea对nsclc的诊断效能。使用尤登指数(youden's index)确定最佳截止点。
[0026]
3.结果
[0027]
3.1lncrna mif-as1在nsclc患者血液中表达含量显著上升，可能作为nsclc的生物标志物
[0028]
lncrna试验从患者中收集6例临床血浆样品，其中3例对顺铂治疗敏感，3例耐受。从血浆中提取出外泌体dna，使用二代测序方法对lncrna进行基因测序，使用edger包进行差异分析，以logfc绝对值大于0.5且fdr小于0.01为阈值，共获得了5189个差异lncrna，其中1629个下调，3560个上调，如图1所示。
[0029]
同时，从gdsc数据库下载62个肺腺癌细胞系和15个肺鳞癌细胞系，其中17个为顺铂敏感细胞系，60个对顺铂耐药。对敏感组和耐药组进行了差异分析，以p《0.05以及fold change》2为标准筛选了nsclc肿瘤中顺铂敏感性相关的lncrna，共获得了10个差异表达lncrna，上调的lncrna包括：fam215b、cllu1-as1、snhg9、mir1915hg、ctb-61m7.1、linc02694、linc00525、mif-as1，下调的lncrna包括：gs1-98e2.1、gdf5-as1，如图2所示。
[0030]
临床样品的差异基因与细胞系的差异基因取交集，得到敏感组与耐药组之间共同差异的上调lncrna mif-as1。
[0031]
由于mif-as1上升倍数很大且尚未有文献报道，因此应用rt-qpcr试验方法进一步验证mif-as1在nsclc放化疗敏感组和耐药组之间是否存在表达差异。rt-qpcr试验结果指出，与放化疗敏感组相比，mif-as1在nsclc放化疗耐药组中表达含量显著上升(p《0.05)，如图3所示。
[0032]
表明lncrna mif-as1有潜力发展成为nsclc的新的生物标志物。
[0033]
3.2lncrna mif-as1对nsclc的放化疗敏感性的预测价值以及其与nsclc患者临床病理参数的相关性分析
[0034]
为了探讨lncrna mif-as1对nsclc患者的放化疗敏感性的预测价值，应用roc曲线分析法分析61例nsclc患者血浆中lncrna mif-as1含量的差异。
[0035]
结果显示，lncrna mif-as1区分nsclc放化疗不敏感患者和放化疗敏感患者的相应auc值为0.775(95％ci＝0.568至0.981，敏感性＝81.8％，特异性＝80.0％)，而传统生物标志物cea区分nsclc放化疗不敏感患者和放化疗敏感患者的相应auc值为0.590(95％ci＝0.420至0.760，敏感性＝81.8％，特异性＝48.0％)，结果如图4所示。
[0036]
该试验结果表明，lncrna mif-as1对nsclc的放化疗敏感性的预测价值优于传统生物标志物cea，lncrna mif-as1能够作为nsclc放化疗敏感性的生物标志物。
[0037]
为进一步探讨lncrna mif-as1的表达与临床病理因素之间的关系，收集并分析患者的临床数据，结果如表1所示。
[0038]
表1 nsclc患者外周血中lncrna mif-as1的表达与nsclc临床病理指标的相关性分析[中位数(四分位数间距)]
[0039][0040]
可以看出，lncrna mif-as1的表达与肿瘤大小显著相关p＜0.05，但与年龄、性别、吸烟状态、肿瘤分期、淋巴结转移和远端转移之间没有显著关联(p》0.05)。表明lncrna mif-as1作为用于nsclc诊断的生物标志物，诊断结果受患者间差异的影响较小，应用前景较好。
[0041]
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

技术特征：
1.一种非小细胞肺癌相关的lncrna分子标记，其特征在于，该lncrna分子标记为lncrna mif-as1，序列为seq id no.1。2.一种如权利要求1所述的lncrna分子标记在制备非小细胞肺癌筛查与诊断的检测产品中的应用。3.一种非小细胞肺癌诊断用试剂盒，包括用于检测如权利要求1中所述的lncrna分子标记的引物，或包括与权利要求1中所述的lncrna分子标记进行特异性结合的抗体。4.一种如权利要求1所述的lncrna分子标记在制备预测非小细胞肺癌放化疗敏感性的试剂中的应用。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种非小细胞肺癌相关的lncRNA分子标记及其应用，该lncRNA分子标记为lncRNA MIF-AS1。试验证明，lncRNA MIF-AS1在NSCLC患者外周血以及NSCLC细胞系中表达含量显著上升，表明lncRNA MIF-AS1对NSCLC具有诊断价值；同时lncRNA MIF-AS1对NSCLC的放化疗敏感性的预测价值优于传统生物标志物CEA，表明lncRNA MIF-AS1能够作为NSCLC放化疗敏感性的生物标志物。本发明提供的lncRNA MIF-AS1为NSCLC的早期诊断提供了一种新的生物标志物，为更进一步的理解NSCLC的潜在机制提供新的方向。解NSCLC的潜在机制提供新的方向。解NSCLC的潜在机制提供新的方向。


技术研发人员：王宏志 叶芳 洪波 聂金福 方志友 陈学冉
受保护的技术使用者：中国科学院合肥物质科学研究院
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/13