一种环二鸟苷酸含量检测模型及其构建方法和应用

1.本技术涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种环二鸟苷酸含量检测模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.环二鸟苷酸(cyclic bis(3'-5')diguanylic acid，c-di-gmp)是细菌体内普遍存在的第二信使分子，参与调节细菌的多种生理功能，尤其在细菌生物膜形成和致病因子产生中起着至关重要的调节作用。
3.环二鸟苷酸通过与核糖开关结合，从而达到对基因表达的精细调节。核糖开关被定义为一类位于mrna3'-或5'-非翻译区上，能够结合小分子代谢物以调控基因转录或翻译的mrna元件，多数核糖开关都可以分成2个结构域：适体结构域(aptamer domain，ad)和表达结构域(expression domain，epd)。ad是一个高度折叠的结构，能与代谢产物特异结合。ad形成高度折叠的二级或者三级结构，与靶代谢产物结合后，通过自身的构象发生变化，导致下游epd的rna折叠变化，形成茎环结构，直接调节基因的表达。目前已证实多个与环二鸟苷酸特异性结合的核糖开关，环二鸟苷酸的两个碱基g与核糖开关的特异位点的碱基c形成watson-crick配对，从而实现对下游基因表达的调节。
4.不同浓度的环二鸟苷酸通过对核糖体开关的调节，使信号级联放大，对细胞的生存状态和生理功能产生很大影响。因此，如何检测出活体细胞内环二鸟苷酸的含量对于其生理功能研究显得尤为重要。
5.目前，环二鸟苷酸含量检测主要依赖于化学方法如高效液相分析和同位素标记分析等。但是，这些方法均需要破碎细菌，不能对活体内的环二鸟苷酸含量进行实时分析，给环二鸟苷酸的生物学功能研究带来很多不便，阻碍了环二鸟苷酸的研究进展。同时，化学方法如高效液相分析时需要体外合成环二鸟苷酸标准品，体外合成环二鸟苷酸价格昂贵、不稳定、不易贮存。同样，同位素标记分析对实验条件要求高，从事放射性同位素工作的人员要接受专门训练，要具备相应的安全防护措施和条件。因此，建立一种简单方便的环二鸟苷酸生物学检测方法将给环二鸟苷酸的研究带来很大的便利。


技术实现要素：

6.本技术提供一种环二鸟苷酸含量检测模型及其构建方法和应用，利用该模型能够对活细胞中环二鸟苷酸的含量进行快速便捷的检测。
7.本技术提供的一种环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法及其应用采用如下的技术方案：
8.一种环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，包括以下步骤：
9.s1核糖开关基因的克隆
10.提取核糖开关菌株基因组，并以此基因组为模板，通过特异引物进行pcr扩增得到核糖开关基因；
11.s2报告基因的克隆
12.提取报告基因菌株基因组，并以此基因组为模板，通过特异引物pcr扩增，得到报告基因lacz；
13.s3核糖开关基因与报告基因的组合
14.将报告基因lacz连入pet-24a(+)连核糖开关载体，经鉴定转化成功后挑取单克隆培养。
15.通过采用上述技术方案，传统的环二鸟苷酸含量检测通常需要破碎细胞，不能对活体内的环二鸟苷酸含量进行实时分析，给环二鸟苷酸的生物学功能研究带来很多不便，阻碍了环二鸟苷酸的研究发展。核糖开关通过结合代谢小分子对基因表达进行快速且灵敏的调控。该环二鸟苷酸含量检测模型首先提取不同细菌中的核糖开关和报告基因，然后将核糖开关与报告基因重新组合，构建成环二鸟苷酸核糖开关检测模型，通过构建环二鸟苷酸生物检测模型，可以根据模型下游报告基因的表达水平变化，实时检测出菌体中环二鸟苷酸的含量变化。该环二鸟苷酸含量检测模型无需将细胞破碎即可对活体内的环二鸟苷酸含量进行实时分析，使得活体内的环二鸟苷酸含量的检测更简单、便捷。
16.优选的，所述报告基因克隆自大肠杆菌基因组的lacz基因。
17.通过采用上述技术方案，来源于大肠杆菌的lacz基因编码的β-半乳糖苷酶(简称β-gal)由4个亚基组成四聚体，可催化乳糖水解。β-gal比较稳定，用x-gal为底物进行染色时呈蓝色，十分便于观察和检测。
18.优选的，所述lacz基因的特异引物序列如下：
19.上游引物5
’‑
ggatccaccatgattacggattcac-3’；
20.下游引物5
’‑
gaattctcagttgcaccacagatgaaac-3’。
21.优选的，所述核糖开关基因克隆自霍乱弧菌基因组或嗜水气单细胞菌基因组。
22.通过采用上述技术方案，嗜水气单胞菌以及霍乱弧菌均为革兰氏阴性菌，宿主菌株大肠杆菌为革兰氏阴性菌，从嗜水气单胞菌基因组以及霍乱弧菌基因组中克隆所得的核糖开关均能在大肠杆菌中折叠形成与环二鸟苷酸结合的正确构象。
23.优选的，克隆自霍乱弧菌的所述核糖开关基因的pcr引物序列如下：
24.上游引物5
’‑
tctagaaagcgtgagagcttgattcca-3’；
25.下游引物5
’‑
ggatccggtcattttaggttgttttttca-3’。
26.优选的，克隆自嗜水气单细胞菌的所述核糖开关基因的pcr引物序列如下：
27.上游引物5
’‑
tctagacagtgagccaacgcacattac-3’；
28.下游引物5
’‑
ggatccggcagccaaagccaccagc-3’。
29.第二方面，一种环二鸟苷酸含量检测模型，采用如下的技术方案：
30.一种环二鸟苷酸含量检测模型，由上述环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法制备而得。
31.第三方面，本技术提供一种环二鸟苷酸含量检测模型的应用，采用如下的技术方案：
32.一种环二鸟苷酸含量检测模型的应用，包括以下步骤：
33.将所述环二鸟苷酸含量检测模型转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，通过测定重组细胞中报告基因的表达量变化即可实时得到环二鸟苷酸含量变化。
34.通过采用上述技术方案，将环二鸟苷酸含量检测模型转入待测细胞中，并将重组细胞置于培养液中培养，通过测定重组细胞中报告基因表达量的变化，即可得到环二鸟苷酸含量的变化，使得环二鸟苷酸含量的检测更快捷、直观。
35.优选的，所述报告基因采用β-半乳糖苷酶报告基因。
36.优选的，所述培养液由以下重量份的原料组成：酵母提取液5份、蛋白胨10份、氯化钠10份。
37.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：
38.1.该环二鸟苷酸含量检测模型通过测定重组细胞中报告基因表达量的变化，即可得到细胞中环二鸟苷酸含量的变化，无需将细胞破碎即可对活体内的环二鸟苷酸含量进行实时分析，使得活体内的环二鸟苷酸含量的检测更简单、便捷；
39.2.当培养体系中外源添加环二鸟苷酸时，该环二鸟苷酸含量检测模型可快捷、直观检测培养环境中进入细胞内的环二鸟苷酸含量，为研究环二鸟苷酸生物学功能提供方便。
40.3.可利用此环二鸟苷酸含量检测模型筛选环二鸟苷酸分子类似物，为活性化合物的筛选提供新的途径。环二鸟苷酸分子类似物与核糖开关结合后影响报告基因表达，通过报告基因表达量的变化情况就可判定类似物是否存在及含量多少。
附图说明
41.图1是霍乱弧菌基因组电泳结果。
42.图2是pcr扩增vc核糖开关结果。
43.图3是pcr鉴定vc核糖开关结果。
44.图4是质粒提取结果。
45.图5是酶切鉴定vc结果。
46.图6是琼脂糖凝胶回收vc结果。
47.图7是pet-24a(+)质粒提取结果。
48.图8是琼脂糖凝胶回收pet-24a(+)。
49.图9是pcr鉴定vc结果。
50.图10是大肠杆菌mg1655基因组电泳结果。
51.图11是pcr扩增lacz基因结果。
52.图12是pcr鉴定lacz基因结果。
53.图13是质粒提取结果。
54.图14是酶切鉴定lacz基因结果。
55.图15是琼脂糖凝胶回收lacz结果。
56.图16是琼脂糖凝胶回收pet-24a(+)连核糖开关载体片段。
57.图17是pcr鉴定核糖开关连lacz重组载体。
58.图18是pcr鉴定pacyc177连pa3702重组载体。
59.图19是rna提取电泳结果。
60.图20是荧光定量pcr检测pa3702转录水平结果。
61.图21是16s和pa3702引物溶解曲线。
62.图22是β-半乳糖苷酶报告基因检测结果。
63.图23是vc环二鸟苷酸含量检测模型以及ahy环二鸟苷酸含量检测模型的示意图。
具体实施方式
64.以下结合附图和实施例对本技术作进一步详细说明。
65.原料
66.(1)菌株和载体
67.霍乱弧菌vc16961基因组由耶鲁大学breaker教授惠赠。大肠杆菌、嗜水气单胞菌，保存于本实验室。pmd18-t vector购自大连takara公司。
68.(2)主要试剂
69.琼脂糖青岛生物工程有限公司
70.dntp大连takara公司
71.pmd18-t载体大连tarkara公司
72.taq酶上海生物工程有限公司
73.dna marker大连takara公司
74.taq dna聚合酶大连takara公司
75.t4dna连接酶加拿大fermentas公司
76.氨苄青霉素上海生物工程有限公司
77.dna限制性内切酶大连tarkara公司
78.t4 dna polymerase大连takara公司
79.dna片段快速纯化试剂盒上海迪奥生物科技有限公司
80.所用引物上海生物工程有限公司
81.tris碱和甘氨酸美国amresco公司
82.(3)培养基和溶液
83.lb培养基：
84.酵母提取物5.0g
85.蛋白胨10.0g
86.氯化钠10.0g
87.固体lb培养基中需加入琼脂粉15.0g
88.搅拌至溶质充分溶解无明显颗粒后用1mol/l的naoh溶液(约1ml)调节ph至7.0，milli q水补至总体积为1l，高压蒸汽湿热灭菌20min，冷却备用。
89.苯酚/氯仿/异戊醇：25：24：1
90.te缓冲液：10mm tris-hcl，1mm edta(ph 8.0)
91.质粒提取溶液：
92.溶液i(1l)：
93.葡萄糖9.9g
94.10mmol/l edta(ph 8.0)20ml
95.1mol/l tris-hcl(ph8.0)25ml
96.用双蒸水定容至1l，高压灭菌后4℃保存。
97.溶液ii(1l)：
98.10mol/l naoh 20ml
99.10％sds 100ml
100.最后用双蒸水定容至1l，室温保存。
101.溶液iii(1l)：
102.5mol/l乙酸钾600ml
103.冰乙酸115ml
104.用双蒸水定容至1l，4℃冰箱保存。
105.实施例1
106.环二鸟苷酸含量检测模型的构建
107.s1核糖开关构建过程包括以下步骤：
108.(1)基因组的获取及检测
109.霍乱弧菌vc16961基因组由耶鲁大学breaker教授惠赠；琼脂糖电泳检测基因组，霍乱弧菌基因组电泳结果参照图1，基因组大小为10kb以上，较完整，能满足下一步实验要求。
110.(2)pcr扩增目的基因
111.以上述基因组为模板，通过特异引物进行pcr扩增，得到vc核糖开关特异序列，具体步骤如下所示，结果参照图2，大小与预期一致。
112.根据霍乱弧菌vc16961基因组上环二鸟苷酸核糖开关基因序列设计pcr引物，序列如下：
113.上游引物5
’‑
tctagaaagcgtgagagcttgattcca-3’；
114.下游引物5
’‑
ggatccggtcattttaggttgttttttca-3’。
115.反应体系：
116.基因组dna模板0.5μl(约5ng)
117.正向引物0.2μl(50pmol/μl)
118.反向引物0.2μl(50pmol/μl)
119.dntp(2.5mm)1.0μl
120.10
×
pcr反应buffer 1.0μl
121.taq dna聚合酶0.05μl(5u/μl)
122.灭菌ddh2o 7.05μl
123.反应条件：
124.94℃4min
125.94℃30s
126.各引物退火温度根据特定引物gc含量计算30s
127.72℃延伸时间根据特定基因大小设定
128.72℃10min
129.30个循环
130.1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物
131.pcr扩增产物胶回收：
132.用琼脂凝胶电泳检测pcr扩增产物；将目的条带切下并称重，按一定质量比加入试剂盒中所带溶胶液；65℃水浴保温10min，其间轻轻震荡2-3次助溶，使其完全溶化至没有固体颗粒；将化好的琼脂糖凝胶液加到离心柱中间，12000g常温离心1min(如果体积较大，一个纯化柱容纳不下，可分两次离心)；弃废液，加入500μl洗脱液于离心柱中，12000g常温离心1min；弃废液，再次加入500μl洗脱液于离心柱中，12000g常温离心1min；将空离心柱12000g常温离心2min；将离心柱置于新的离心管中，加入30μl无菌水，45℃水浴放置1-2min；12000g常温离心2min，收集管底样品；得到vc核糖开关特异序列取3μl样品电泳检测后，剩余样品于-20℃贮存。
133.(3)目的基因转化并验证
134.将vc在dna聚合酶72℃保温10min加a后连t载体，转化成功后挑取单克隆培养并进行菌液pcr鉴定，结果如图3所示，片段大小与目的片段一致。
135.(4)质粒提取
136.提取vc连t载体质粒，适当稀释后电泳检测，具体步骤如下：从平板上挑取一个单克隆，接入5ml lb液体培养基37℃培养过夜；吸取1ml培养液入尖底离心管中，12000g，4℃离心1min后收集菌体；去上清，12000g，4℃离心30s，吸去残余上清；在沉淀中加入100μl预冷的溶液ⅰ，反复吹打混匀并重悬；加入200μl新配置的溶液ⅱ(先加sds，后加naoh)，缓慢颠倒轻柔混匀，冰上放置3-5min至溶液变清亮(开盖时有粘丝状物出现)；加入150μl用冰预冷的溶液ⅲ，颠倒混匀，置于冰上3-5min；12000g，4℃离心5min，吸取上清到另一尖底离心管中；加入等体积酚/氯仿/异戊醇后，震荡混匀，12000g，4℃离心10min，小心吸取上清到另一离尖底心管中；加入等体积的异丙醇，震荡混匀，室温放置5min；12000g，4℃离心10min；去上清，12000g离心30s，吸去残余上清；加入1ml70％乙醇洗涤dna沉淀，12000g，4℃离心10min后弃上清；12000g离心30s，吸去残余上清，在空气中使核酸沉淀干燥2-3min；用适量te溶解核酸，吹打混匀；加入rnaase，37℃，10min降解提取出来的rna；1％琼脂糖凝胶电泳检测，贮存于-20℃。
137.电泳结果如图4所示。
138.(5)酶切鉴定
139.将vc用xbaⅰ、bamhⅰ双酶酶切鉴定，具体步骤如下：
140.xbaⅰ、bamhⅰ双酶酶切鉴定反应体系和条件：
141.质粒dna 500ng
142.10
×
m buffer 2μl
143.xbai 0.5μl
144.bamhi 0.5μl
145.ddh2o补足至20μl
146.37℃温箱中反应4h后1％琼脂糖凝胶电泳检测。
147.电泳结果如图5所示，在目的片段大小处均得到了与理论大小一致的条带。
148.(6)目的片段酶切胶回收
149.将t载体连vc质粒双酶酶切鉴定后，阳性克隆送样上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定，测序结果显示序列正确，无突变。鉴定完成后，将t载体连vc质粒分别用xbaⅰ、bamhⅰ双酶酶切后胶回收，载体pet-24a(+)质粒提取、酶切胶回收，结果如图6所示，回
收得到的目的片段很纯，大小正确，没有其他杂质污染。
150.(7)载体pet-24a(+)质粒提取、酶切胶回收
151.为了将目的片段克隆入载体pet-24a(+)，我们首先提取了pet-24a(+)载体质粒，结果如图4-10所示，所提质粒较干净，能满足后续实验要求。然后将pet-24a(+)载体分别用xbaⅰ、bamhⅰ双酶酶切后胶回收，结果如图7和图8所示，胶回收后的载体片段大小与理论大小一致。
152.(8)重组载体鉴定
153.将vc连入pet-24a(+)载体，转化成功后进行菌液pcr鉴定，鉴定结果如图9所示，片段大小与目的片段一致。
154.s2报告基因获取包括以下步骤：
155.(1)基因组提取
156.为了获得实验所需报告基因lacz，提取大肠杆菌mg1655基因组，具体步骤如下：从平板上挑取大肠杆菌单克隆接种于玻璃管中培养至对数期；按1％的量转接至3ml液体培养基中培养至对数期；取1-1.5ml对数期菌液，12000g离心30s，吸取上清；加200μlga悬浮沉淀，用移液器反复吹打混匀；加2μl rnaase，室温放置5min；加10μl蛋白酶k，轻轻颠倒混匀；加210μlgb，颠倒混匀，静置10min(70℃)；加210μl无水乙醇，用移液器反复吹打混匀；将溶液转移至吸附柱中，12000g室温离心30s，弃废液；吸附柱中加入300μlgd，12000g室温离心30s，弃废液；将吸附柱放回收集管中，加入700μl漂洗液pw，12000g常温离心30s，弃废液；再用500μlpw重复漂洗一次；将吸附柱放回收集管中，12000g常温离心2min，弃废液；将吸附柱室温放置2min，然后放入一个干净的离心管中，加入50μl洗脱液te，室温放置2-5min，12000g室温离心2min；琼脂糖电泳检测。电泳结果如图10所示。
157.(2)pcr扩增目的基因
158.以上述基因组为模板，通过特异引物pcr扩增，得到lacz的特异序列，具体步骤参照s1(2)，大小与预期一致，结果如图11所示。
159.特异引物如下所示：
160.上游引物5
’‑
ggatccaccatgattacggattcac-3’；
161.下游引物5
’‑
gaattctcagttgcaccacagatgaaac-3’。
162.(3)目的基因转化并鉴定
163.将lacz在dna聚合酶72℃保温10min加a后分别连入t载体，转化后挑取单克隆培养并进行pcr鉴定，具体步骤参照s1(3)，结果如图12所示，所挑取单克隆均为阳性。
164.(4)质粒提取
165.提取lacz连t载体质粒，适当稀释后电泳检测，具体步骤参照s1(4)，电泳结果如图13所示。
166.(5)酶切鉴定
167.将t载体连lacz质粒分别用bamhⅰ、ecorⅰ双酶酶切鉴定，具体步骤参照s1(5)，电泳结果如图14所示，在目的片段大小处均得到了与理论大小一致的条带。
168.(6)目的片段酶切胶回收
169.将t载体连lacz质粒双酶酶切鉴定后，送样上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定，测序结果显示序列正确，无突变。鉴定完成后，将lacz用xbaⅰ、bamhⅰ双酶酶切后
胶回收，结果如图15所示，回收得到的目的片段很纯，大小正确，没有其他杂质污染。
170.s3核糖开关与报告基因的组合包括一下步骤：
171.(1)pet-24a(+)连核糖开关载体酶切回收
172.将pet-24a(+)连核糖开关载体分别用bamhⅰ、ecorⅰ双酶酶切回收载体片段，结果如图16所示。scai和ecori双酶酶切鉴定反应体系和条件如下：
173.质粒dna 500ng
174.10
×
m buffer 2μl
175.saci 0.5μl
176.ecori 0.5μl
177.ddh2o补足至20μl
178.37℃温箱中反应4h后1％琼脂糖凝胶电泳检测。
179.(2)重组载体鉴定
180.将lacz连入pet-24a(+)连核糖开关载体，转化成功后挑取单克隆培养并进行菌液pcr鉴定，结果如图17所示，片段大小与目的片段一致，证明连接、转化成功，得到vc环二鸟苷酸含量检测模型，其示意图如图23所示。
181.环二鸟苷酸含量检测模型的应用：
182.将构建所得的vc环二鸟苷酸含量检测模型转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，测定重组细胞中报告基因的表达量变化即可检测细胞中环二鸟苷酸含量的实时变化。
183.其中培养液由以下重量份的原料组成：酵母提取液5份、蛋白胨10份、氯化钠10份。
184.在本实施例中以铜绿假单胞菌为例进行说明。
185.(1)铜绿假单胞菌pa01基因组提取
186.提取铜绿假单胞菌基因组，适当稀释后电泳检测，具体提取步骤参照s1(1)。
187.(2)pcr扩增目的基因
188.以上述提取的基因组为模板，通过特异引物pcr扩增，得到环二鸟苷酸合成酶基因(pa3702)的特异序列，具体步骤参照s1(2)。
189.特异引物序列如下：
190.上游引物5
’‑
ctcgaggcacaaccctcatgagagc-3’；
191.下游引物5
’‑
magctttcagccocccgcggcc-3’。
192.(3)目的基因转化并鉴定
193.将pa3702基因片段在dna聚合酶72℃保温10min加a后连入t载体，转化成功后挑取单克隆培养并进行菌液pcr鉴定。
194.(4)质粒提取
195.提取t载体连pa3702质粒，适当稀释后电泳检测，具体步骤参照s1
196.(4)。
197.(5)酶切鉴定
198.将t载体连pa3702质粒分别用xhoi、hindⅲ双酶酶切鉴定。
199.(6)目的片断酶切胶回收
200.将t载体连pa3702质粒双酶酶切鉴定后，送样上海生工生物工程技术服务有限公
司进行序列测定，测序结果显示序列正确。鉴定完成后，将t载体连pa3702质粒用xhoi、hindⅲ双酶酶切后胶回收目的片段。
201.(7)载体pacyc177质粒提取
202.提取载体pacyc177质粒，适当稀释后电泳检测。
203.(8)重组载体鉴定
204.将载体pacyc177双酶酶切后回收载体片段后与pa3702片段连接，转入含有核糖开关检测模型的dh5α菌株后进行pcr鉴定，结果如图18所示，片段大小与目的片段大小一致，证明连接、转化成功。
205.(9)荧光定量pcr检测pa3702表达
206.通过rt-pcr技术检测pa3702的转录水平，来检测pa3702在宿主菌株中能否得到正常转录。提取总rna，电泳结果显示提取的总rna质量较好，基本没有降解。电泳形成23s rrna、16s rrna和5s rrna三条主要条带。其中23s rrna量约为16s rrna两倍，5s rrna条带较浅(图19)
207.通过荧光定量pcr验证目的基因在宿主菌中能否正常转录，荧光定量pcr结果显示：在转入载体pacyc177-pa3702后，pa3702的转录水平明显上升(图20)，说明目的基因在宿主菌中能正常转录。熔解曲线没有杂峰，暗示引物结合特异性较好(21)。
208.(10)β-半乳糖苷酶报告基因检测
209.β-半乳糖苷酶报告基因检测方法参照β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒说明书。通过β-半乳糖苷酶报告基因检测结果显示，报告基因lacz的表达水平变化，如图22所示。通过β-半乳糖苷酶报告基因检测结果可以直观的显示活细胞内环二鸟苷酸的含量变化。
210.实施例2
211.实施例2在实施例1的方法基础上对核糖开关菌种的选用进行调整，具体如下：菌种采用嗜水气单细胞菌，其pcr引物序列如下：
212.上游引物5
’‑
tctagacagtgagccaacgcacattac-3’；
213.下游引物5
’‑
ggatccggcagccaaagccaccagc-3’。
214.具体步骤参照实施例1，最终获得ahy环二鸟苷酸含量检测模型，示意图如图23所示。

技术特征：
1.一种环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：s1核糖开关基因的克隆提取核糖开关菌株基因组，并以此基因组为模板，通过特异引物进行pcr扩增得到核糖开关基因；s2报告基因的克隆提取报告基因菌株基因组，并以此基因组为模板，通过特异引物pcr扩增，得到报告基因lacz；s3核糖开关基因与报告基因的组合将报告基因lacz连入pet-24a(+)连核糖开关载体，经鉴定转化成功后挑取单克隆培养。2.根据权利要求1所述的环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，其特征在于：所述报告基因lacz克隆自大肠杆菌基因组。3.根据权利要求2所述的环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，其特征在于：所述lacz报告基因的特异引物序列如下：上游引物5
’‑
ggatccaccatgattacggattcac-3’；下游引物5
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gaattctcagttgcaccacagatgaaac-3’。4.根据权利要求1所述的环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，其特征在于：所述核糖开关基因克隆自霍乱弧菌基因组或嗜水气单细胞菌基因组。5.根据权利要求4所述的环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，其特征在于：克隆自霍乱弧菌的所述核糖开关基因的pcr引物序列如下：上游引物5
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tctagaaagcgtgagagcttgattcca-3’；下游引物5
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ggatccggtcattttaggttgttttttca-3’。6.根据权利要求4所述的环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法，其特征在于：克隆自嗜水气单细胞菌的所述核糖开关基因的pcr引物序列如下：上游引物5
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tctagacagtgagccaacgcacattac-3’；下游引物5
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ggatccggcagccaaagccaccagc-3’。7.一种环二鸟苷酸含量检测模型，其特征在于：所述环二鸟苷酸含量检测模型由权利要求1-6任意一项所述的环二鸟苷酸含量检测模型的构建方法制备而得。8.一种根据权利要求7所述的环二鸟苷酸含量检测模型的应用，其特征在于：包括以下步骤：将所述环二鸟苷酸含量检测模型转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，测定重组细胞中报告基因的表达量。9.一种根据权利要求8所述的环二鸟苷酸含量检测模型的应用，其特征在于：所述报告基因采用β-半乳糖苷酶报告基因。10.一种根据权利要求8所述的环二鸟苷酸含量检测模型的应用，其特征在于：所述培养液由以下重量份的原料组成：酵母提取液5份、蛋白胨10份、氯化钠10份。

技术总结
本申请涉及基因工程技术领域，具体公开了一种环二鸟苷酸含量检测模型及其构建方法和应用；其构建方法包括以下步骤：S1核糖开关的克隆；S2报告基因的克隆；S3核糖开关与报告基因的组合；环二鸟苷酸含量检测模型由上述构建方法制备而得；其应用包括以下步骤：将所述环二鸟苷酸含量检测模型转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，通过测定重组细胞中报告基因的表达量变化即可实时得到细胞中环二鸟苷酸含量变化。本申请的检测模型可用于实时监测活细胞内环二鸟苷酸含量变化，操作方法简便易行。易行。易行。


技术研发人员：刘湛军 刘石泉 胡拥军 曾晔
受保护的技术使用者：湖南城市学院
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/9/13