一种鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法与流程

1.本发明病毒培养领域，尤其是涉及一种鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法。


背景技术：

2.鸡新城疫( newcastle disease，nd) 是由新城疫病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性、烈性、病毒性传染病，对养禽业危害极大，该病的主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜 和浆膜出血。易感鸡群一旦被速发性噬内脏型新城疫病毒所传染，可迅速传播并呈毁灭性流行，发病率和死亡率可达90%以上。
3.疫苗免疫是防控鸡新城疫病毒感染的重要措施。目前已上市的鸡新城疫病毒疫苗主要通过鸡胚繁毒，培养时间较长，受鸡胚供应量制约，生产成本高，工艺不稳定，限制了疫苗的生产。因此如何高效快捷地增殖鸡新城疫病毒是疫苗研发工作需要解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法。
5.为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，所述培养方法是在培养基中加入胰岛素生长因子和大豆水解蛋白。
7.所述胰岛素样生长因子（igf）添加量为2～8μg/ml，大豆水解物添加量为5～8mg/ml。
8.所述培养方法包括以下步骤：1）制备悬浮细胞培养基；2）将病毒液接种于细胞培养基，培养1小时；3）然后添加补液，继续培养24-72小时后，破碎病毒液；4）收获病毒液并测定病毒含量。
9.进一步的，步骤1）所述悬浮细胞为bhk-21、mdck、lmh中的任意一种。
10.进一步的，所述胰岛素样生长因子（igf）添加量为2～8μg/ml，大豆水解物添加量为5～8mg/ml。
11.进一步的，步骤3）所述补液为1.0～5.0mg/l的tpck胰酶。
12.进一步的，步骤2）所述破碎病毒液的方法包括：当培养至细胞活率为75%时，加入0.5～1.5mm edta、0.01～0.1%脱氧胆酸盐，转速提高至70～90r/min，并搅拌1～3小时。
13.进一步的，培养方法培养的鸡新城疫病毒含量不低于10
9.0
eid
50
/0.1ml。
14.相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明使用的细胞生长液中添加igf和大豆水解物，与现有技术相比细胞密度提高，病毒维持液中添加igf和大豆水解物，与现有技术相比病毒液滴度提高，培养时间缩短，说明igf和大豆水解物具有促进细胞和病毒增殖特点。本发明病毒液破碎方法为试剂快速破碎法，操作简便，病毒滴度提高。
具体实施方式
15.以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
16.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
17.实施例1：bhk-21悬浮细胞培养
18.将本公司驯化的bhk-21悬浮细胞按1.0
×
10
6.0
～1.5
×
10
6.0
个/ml密度分别接种于不同培养基进行培养，生物反应器容积为10l，转速60～90r/min，溶氧量（do）30%～50%，ph值7.2
±
0.1，培养温度为37
±
0.1℃。分别于培养24、48、72和96小时取样测定细胞密度和活率。不同培养基信息见表1，细胞密度和活率信息见表2。
19.表1不同培养基信息
20.表2 bhk-21悬浮细胞密度和活率信息
21.由上述结果可知，单独加入0.5～10μg/ml igf或者1～10 mg/ml大豆水解物的效果并不能影响细胞密度和活率，而细胞培养48～72小时，培养基6组细胞密度显著上升，为9.0
×
10
6.0
～10.0
×
10
6.0
个/ml，活率不低于99%，均优于其他培养基组，因此优选含2～8μg/ml igf和5～8mg/ml大豆水解物的b271培养基作为bhk-21悬浮细胞用细胞生长液。
22.实施例2：病毒增殖
23.1、10l生物反应器培养工艺优化
24.将bhk-21悬浮细胞按1.0
×
10
6.0
～1.5
×
10
6.0
个/ml密度接种于优选细胞生长液，生物反应器容积为10l，转速60～90r/min，溶氧量（do）30%～50%，ph值7.2
±
0.1，培养温度
为37
±
0.1℃。培养48～72小时，细胞密度为9.0
×
10
6.0
～10.0
×
10
6.0
个/ml时，按照1:1比例补加不同培养基（见表3），同时按moi=0.01～0.2接种鸡新城疫病毒la sota株，37
±
0.1℃培养1小时后，补加终浓度为1.0～5.0mg/l的tpck胰酶，继续培养48～72小时，按照两种方法破碎病毒液，破碎方法（1）：细胞活率为75%左右时收获病毒液，冻融1次；破碎方法（2）：细胞活率为75%时加入0.5～1.5mm edta、0.01～0.1%脱氧胆酸盐，转速提高至70～90r/min，搅拌1～3小时后，收获病毒液。同时将毒种按照现有工艺接种鸡胚培养病毒与悬浮细胞毒进行比较。病毒收获时间和病毒含量测定结果见表4。
25.表3不同培养基信息
26.表4红细胞凝集价和病毒含量测定结果
27.由上述结果可知，用培养基2培养新城疫病毒，采用试剂快速破碎病毒液，红细胞凝集价为1:2048，病毒含量为10
9.17
eid
50
/0.1ml，病毒含量最高，比鸡胚毒红细胞凝集价提高4倍，病毒滴度提高10倍，培养时间缩短68小时，因此优选培养基2作为病毒维持液，病毒液破碎方法优选试剂快速破碎法。
28.2、50l～5000l生物反应器放大培养
29.将bhk-21悬浮细胞按1.0
×
10
6.0
～1.5
×
10
6.0
个/ml密度接种于优选细胞生长液，生物反应器容积为50l、200l、1000l和5000l，转速60～90r/min，溶氧量（do）30%～50%，ph值7.2
±
0.1，培养温度为37
±
0.1℃。培养48～72小时，细胞密度为9.0
×
10
6.0
～10.0
×
10
6.0
个/ml时，按照1:1比例补充优选病毒维持液，同时按moi=0.01～0.2接种鸡新城疫病毒，37
±
0.1℃培养1小时后，补加终浓度为1.0～5.0mg/l的tpck胰酶，继续培养48～72小时，细胞活率为75%左右时加入0.5～1.5mm edta、0.01～0.1%脱氧胆酸盐，转速提高至70～90r/min，搅拌1～3小时后，收获病毒液，测定病毒含量。同时将毒种按照现有工艺接种鸡胚培养病毒。病毒培养时间和病毒含量测定结果见表5。
30.表5 红细胞凝集价和病毒含量测定结果
31.由上述结果可知，按照优选工艺用50l～5000l生物反应器培养的病毒液红细胞凝集价为1:1024～1:2048，病毒含量为10
9.25
～10
9.38
eid
50
/0.1ml，比鸡胚毒红细胞凝集价提高2～4倍，病毒滴度提高7～10倍，培养时间缩短64～72小时。
32.采用mdck悬浮细胞、lmh悬浮细胞培养鸡新城疫病毒，都能达到以上结果中的病毒滴度。
33.实施例3：疫苗制备与检验
34.将实施例2步骤2增殖的鸡新城疫病毒液浓缩置换后，将病毒含量调整至10
8.0
eid
50
/0.1ml，同时取鸡胚培养病毒液调整至同等病毒含量，将病毒液灭活后与矿物油佐剂乳化制备疫苗，超剂量接种7日龄spf鸡，观察14天，试验鸡均无任何局部和全身不良反应，剖检内脏无病变，疫苗安全性均良好。
35.将疫苗按20μl/只剂量接种21～28日龄spf鸡，同时设对照鸡5只。接种后21日每只鸡采血，分离血清，测定hi抗体效价，结果见表6。
36.表6 hi抗体效价测定结果
37.由上述结果可知，悬浮细胞毒制备的疫苗免疫后hi抗体效价几何平均值为1:74，高于鸡胚培养毒制备疫苗，表明悬浮细胞毒免疫原性良好。
38.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，所述培养方法是在培养基中加入胰岛素生长因子和大豆水解蛋白。2.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，所述胰岛素样生长因子（igf）添加量为2～8μg/ml，大豆水解物添加量为5～8mg/ml。3.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：1）制备悬浮细胞培养基；2）将病毒液接种于细胞培养基，培养1小时；3）然后添加补液，继续培养24-72小时后，破碎病毒液；4）收获病毒液并测定病毒含量。4.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，步骤1）所述悬浮细胞为bhk-21、mdck、lmh中的任意一种。5.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，步骤3）所述补液为1.0～5.0mg/l的tpck胰酶。6.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，步骤2）所述破碎病毒液的方法包括：当培养至细胞活率为75%时，加入0.5～1.5mm edta、0.01～0.1%脱氧胆酸盐，转速提高至70～90r/min，并搅拌1～3小时。7.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，其特征在于，所述培养方法培养的鸡新城疫病毒含量不低于10
9.0
eid
50
/0.1ml。

技术总结
本发明提供了一种鸡新城疫病毒大规模悬浮培养方法，具体方法在悬浮细胞培养基中加入胰岛素生长因子和大豆水解蛋白来培养鸡新城疫病毒，并快速破碎法处理病毒液，可获得高滴度病毒液，比鸡胚法培养病毒液红细胞凝集价提高2～4倍，病毒滴度提高7～10倍，培养时间缩短，大大节约了生产成本，且本发明培养的鸡新城疫悬浮细胞毒安全性和免疫原性均良好。城疫悬浮细胞毒安全性和免疫原性均良好。


技术研发人员：车艳杰 张立霞 李守军 陈红秀 任培森 宋新宇 赵莉 蔡天宁
受保护的技术使用者：天津瑞普生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/9/12