一种复合声敏剂与其细菌靶向的递送系统，及相关制备方法和应用

1.本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种复合声敏剂与其细菌靶向的递送系统，及相关制备方法和应用。


背景技术：

2.细菌感染是严重威胁人类健康的重大疾病。抗生素治疗是目前临床上应对细菌感染的最有效手段。然而，由于抗生素的大量使用，细菌对抗生素的耐受性越来越强，已成为严重的全球公共卫生问题。另一方面，在细菌感染的临床病例中，绝大部分会形成生物被膜(biofilm)。生物被膜一方面能作为物理屏障阻止抗生素的进入；另一方面，独特的生物膜微环境(如缺氧和酸性)，严重限制了抗菌药物的疗效，这使生物被膜中的细菌对抗生素的耐药性比浮游菌增加了10-1000倍，对当前的抗生素疗法提出了严峻的挑战。
3.临床上细菌性肺炎和骨髓炎的临床治疗往往以经验治疗为主，因此抗生素就被大量使用，导致多药耐药性病原体如铜绿假单胞菌变得越来越普遍，而且这些细菌性感染往往伴随着生物被膜的存在，导致抗生素无法对其进行有效的治疗。而且大剂量、长时间的静脉注射、口服抗生素会对机体造成不同程度的损伤，如肝肾功能损害、胃肠道功能紊乱、损害免疫系统等。因此，开发一种无抗生素、高效、安全的治疗策略迫在眉睫。
4.噬菌蛭弧菌(bdellovibrio bacteriovorus，bd)是一种独特的微生物，可捕食多种致病的革兰氏阴性细菌，被称为“活抗生素”。蛭弧菌通常比细菌小，可以通过细菌滤器，端生特殊鞭毛，具有很高的机动性。在捕食阶段，蛭弧菌以高达160m/s的运动速度与识别的猎物碰撞。碰撞之后通常是菌体高速旋转，速率达100rpm/s以上。在此之后，蛭弧菌通过附着点穿透进入细胞质中，并在其中生长、分裂以杀死猎物。这为蛭弧菌杀死革兰氏阴性菌并侵入生物膜提供了生物学基础。过往的研究表明，蛭弧菌无法入侵哺乳动物细胞，无明显致病作用，可以容易地从哺乳动物的胃肠道、粪便中分离出来。尽管蛭弧菌具有以上优点，但单独使用蛭弧菌很难达到令人满意的抗菌效果，其中主要是因为其抗菌速率较慢。因此，为了提高抗菌治疗效果，有必要将活菌与其他策略相结合。
5.超声驱动的抗菌声动力疗法(sdt)是通过超声激发声敏剂产生的大量活性氧(ros)，从而起到杀菌治疗作用。超声具有超高的组织穿透性，可用来破坏生物膜结构和治疗相关感染。然而，目前声敏剂的局限性极大地阻碍了sdt的广泛临床应用，其中一个普遍的局限性因素是活性氧容易被淬灭，其作用距离很短，单独使用时难以在体内发挥很好的抗菌作用。此外传统的有机声敏剂如吲哚菁绿(icg)、阿霉素、姜黄素等常还存在生物利用度低、机体代谢快、生物膜积累差等问题。无机声敏剂如二氧化钛(tio2)由于其电子(e)和空穴(h+)的结合过快(50
±
30ns)，超声(us)触发ros生成的量子产率相对较低。因此，需要有新方法来提高tio2的量子产率。
6.本发明目的是开发一种能够有效治疗铜绿假单胞菌感染且不损伤机体组织的新型靶向抗击细菌生物被膜的复合声敏剂与其细菌靶向的活菌递送系统。本发明提供的复合
声敏剂细菌靶向的递送系统由负载有机声敏剂icg的铂修饰的二氧化钛纳米粒以及实现该纳米粒靶向递送的蛭弧菌组成。其中有机无机复合的复合声敏剂(bpt-icg)具有高效的声动力性质，具有优异的抗菌作用。同时，蛭弧菌则作为复合声敏剂的靶向递送系统，通过破坏生物被膜和对细菌的捕食特性，将复合声敏剂递送到细菌表面或者内部，进而在超声激发下，产生大量活性氧以快速杀死铜绿假单胞菌并根除生物膜。此外，此活菌递送系统不会明显伤害哺乳动物细胞，对机体组织副作用小。因此此本发明提供的复合声敏剂与其细菌靶向的递送系统有望由于靶向治疗临床上难以治疗的生物被膜相关细菌感染。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种复合声敏剂与其细菌靶向的递送系统及相关制备方法。其中，复合声敏剂(bpt-icg)由无机声敏剂(bpt)与有机声敏剂(icg)复合而成，复合声敏剂细菌靶向的递送系统(bpt-icg@bd)则是在蛭弧菌表面(bd)通过表面多巴胺原位聚合修饰复合声敏剂纳米粒。蛭弧菌表面的复合声敏剂不仅能够作为纳米酶催化环境中的h2o2产生氧气，同时具有声动力学活性，能在超声处理下将氧气转化为活性氧，起到一定的杀菌作用。蛭弧菌能够进一步利用其高速捕食能力将其表面的复合声敏剂递送到细菌的表面或者内部，从而实现治疗铜绿假单胞菌感染的目的。此外，蛭弧菌能够有效穿透生物膜结构，同时声动力纳米体系通过催化生物膜中的h2o2产生氧气，缓解感染部位乏氧状况，并在超声作用下，利用产生的氧气产生ros瓦解生物膜和杀灭其中的细菌。蛭弧菌捕食特性和声动力疗法的结合在不伤害哺乳动物细胞的情况下，以协同的方式迅速消除铜绿假单胞菌和生物膜。
8.本发明术语“icg”，是指有机声敏剂吲哚菁绿。
9.本发明术语“tio
2”，是指白色中空介孔二氧化钛。
10.本发明术语“pt-tio
2”，是指铂纳米粒修饰的白色中空介孔二氧化钛。
11.本发明术语“bpt”，是指无机声敏剂铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛。
12.本发明术语“bpt-icg”，是指无机声敏剂铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛与有机声敏剂吲哚菁绿复合而成的复合声敏剂。
13.本发明术语“bpt-icg@bd”，是指将复合声敏剂(bpt-icg)修饰到蛭弧菌(bd)表面形成的具有细菌及其生物被膜靶向作用的复合声敏剂细菌靶向的递送系统。
14.本发明的一个目的，在于提供一种复合声敏剂，所述复合声敏剂由无机声敏剂和有机声敏剂复合而成，其中，所述无机声敏剂选自二氧化钛纳米粒、金属-有机骨架纳米颗粒、碳化钛二维纳米片的一种或多种，所述有机声敏剂选自吲哚菁绿、血卟啉单甲醚、二氢卟吩的一种或多种。
15.进一步地，所述铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛与所述吲哚菁绿的质量比为(0.2～5):1。
16.进一步地，所述氧化钛纳米粒为铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛。
17.本发明的另一个目的在于，在于提供上述复合声敏剂的制备方法，所述复合声敏剂的制备方法包括以下步骤：
18.s1、将乙醇、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、盐酸和四氟化钛水溶液共混反应，加热后离心收集，洗涤后得到白色中空介孔二氧化钛；
19.s2、将所述白色中空介孔二氧化钛粉末分散在水中，加入六水合氯铂酸，搅拌反应后加入硼氢化钠，反应后得到铂纳米粒修饰的白色中空介孔二氧化钛；
20.s3、将所述铂纳米粒修饰的白色中空介孔二氧化钛在惰性气体气氛中加热，得到所述铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛；
21.s4、将所述铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛分散在水中，超声，加入所述吲哚菁绿，反应得到所述复合声敏剂。
22.进一步地，步骤s2中，白色中空介孔二氧化钛粉末与六水合氯铂酸的质量比为(1:0.16～0.3)。
23.进一步地，步骤s3中，加热温度为300-700℃，加热时间为0.1-3h。
24.进一步地，步骤s4中，反应时间为8-24h。
25.本发明的另一个目的在于，提供一种表面包载所述复合声敏剂的细菌靶向的递送系统。
26.本发明的另一个目的在于，提供所述细菌靶向的递送系统在抗菌产品和治疗细菌感染中的应用。
27.本发明其有益效果在于：
28.(1)本发明提供的复合声敏剂bpt-icg，包括有机无机复合的纳米声敏剂，具有高效的声动力性质，具有优异的抗菌作用。
29.(2)本发明提供的复合声敏剂细菌靶向递送系统bpt-icg@bd，蛭弧菌递送系统利用可主动高速捕食细菌的特性穿透和破坏生物被膜，将新型声敏剂递送到细菌表面或者内部，进而在超声激发下，产生大量活性氧以快速杀死细菌并根除其生物膜。
30.(3)本发明提供的复合声敏剂细菌靶向递送系统bpt-icg@bd在体外、体内均表现出强大的抗菌抗生物被膜作用和细菌感染优异的治疗效果，且治疗效果优于临床上常用抗生素的疗法，而且利用超声响应产生的ros进行杀菌能够防止细菌产生耐药性。
31.(4)本发明提供的复合声敏剂细菌靶向递送系统bpt-icg@bd，不会明显伤害哺乳动物细胞，对机体组织副作用小，因此此复合声敏剂bpt-icg及其靶向活菌递送系统bpt-icg@bd有望用于靶向治疗临床上难以治疗的生物被膜感染。
附图说明
32.图1(a)示出了实施例1中包载了有机声敏剂吲哚菁绿(icg)的铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛(bpt-icg)修饰到蛭弧菌(bd)表面形成的具有细菌靶向作用的复合声敏剂细菌靶向的活菌递送系统bpt-icg@bd的制备示意图；图1(b)示出了bpt-icg@bd破坏细菌生物被膜的过程示意图，在攻击阶段，由于蛭弧菌与宿主碰撞并进入细菌内，通过施加超声激活声敏体系产生活性氧ros，破坏生物被膜，并杀灭其中的细菌。
33.图2示出了实施例1中制备的复合声敏剂的表征数据，其中，图2(a)-图2(c)分别为白色中空介孔二氧化钛tio2、铂纳米粒修饰的氧化钛pt-tio2和铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛bpt的透射电镜图像；图2(d)为tio2、pt-tio2和bpt的xrd图谱；图2(e)为pt-tio2和bpt的电子自旋共振谱(esr)图谱；图2(f)为bpt的n2吸附-脱附等温线；图2(g)为tio2、pt-tio2、bpt和bpt-icg的粒径分布；图2(h)为tio2、pt-tio2、bpt和bpt-icg的zeta电位；图2(i)为不同条件下bpt-icg的药物释放曲线(mean
±
s.d.，n＝3)。
34.图3示出了实施例2中复合声敏剂bpt-icg的声动力学性质、机理及抗菌作用，其中，图3(a)为bpt-icg在超声(us)辐照下产生ros的机理示意图；图3(b)为tio2、bpt的能带图；图3(c)为在厌氧环境中相同ti浓度的pt-tio2和bpt催化h2o2产生o2的量对比；图3(d)为与ti浓度均为50μg/ml tio2、pt-tio2、bpt、bpt-icg混匀后立即超声的活性氧探针dpbf的浓度变化情况；图3(e)为与ti浓度均为50μg/ml tio2、pt-tio2、bpt、bpt-icg混匀后立即超声的单线态氧荧光探针sosg在超声照射下的相对吸收强度；图3(f)为不同浓度的bpt-icg与铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)共孵育2h并超声处理2min后cfu的数量统计(n＝3；means
±
s.d.)。
35.图4示出了实施例3中蛭弧菌表面包载复合声敏剂的细菌靶向的递送系统(bpt-icg@bd)的表征、抗菌效果和捕食效率，其中，图4(a)为bpt-icg@bd的激光共聚焦显微镜的(clsm)共定位图片，从左至右依次为纳米粒中icg的绿色荧光信号、红色染料染过的蛭弧菌细胞膜和二者结合之后的荧光信号；图4(b)为纯蛭弧菌(bd)和表面修饰了bpt-icg的蛭弧菌的捕食能力，从左至右依次是，用syto 9将蛭弧菌染成绿色、用hoechst 33342将铜绿假单胞菌染成蓝色和蛭弧菌对铜绿假单胞菌的捕食；图4(c)从左至右依次为磷酸缓冲液(pbs)、bd、bpt-icg、bpt-icg@bd与铜绿假单胞菌p.aeruginosa共孵育2h后，并对其进行超声处理2min后的菌落图片；图4(d)从左至右依次为磷酸缓冲液(pbs)、bd、bpt-icg、bpt-icg@bd与铜绿假单胞菌p.aeruginosa共孵育2h后，并对其进行超声处理2min后细菌菌落(cfu)的数量统计结果。
36.图5示出了实施例4中表面包载复合声敏剂的细菌靶向的递送系统(bpt-icg@bd)的体外抗生物膜活性，其中，图5(a)为通过激光共聚焦显微镜(clsm)观察不同孵育时间bpt-icg@bd侵入铜绿假单胞菌生物膜情况，从上至下，bpt-icg@bd侵入铜绿假单胞菌生物膜的时间依次为30、60和120min，bpt-icg@bd被cy 5-nhs染色为红色，铜绿假单胞菌生物膜被syto 9染色为绿色；图5(b)为不同处理后用syto 9/pi染色的铜绿假单胞菌生物膜的激光共聚焦显微镜(clsm)图像；图5(c)为不同处理后用用结晶紫染色生物膜的相对定量；图5(d)和图5(e)分别为不同组处理后铜绿假单胞菌生物膜内的细菌菌落图片和cfu数量图。
37.图6示出了实施例5中bpt-icg@bd对铜绿假单胞菌诱发的小鼠肺部感染的体内治疗作用，其中图6(a)为铜绿假单胞菌诱发的肺炎感染小鼠的建模和治疗示意图；图6(b)和图6(c)分别为为细菌计数法测定感染小鼠在经不同处理组(con：未进行治疗；us：气管内雾化注入40μl pbs，2h后超声处理5min；bd：气管内雾化注入蛭弧菌40μl 107pfu/ml；bpt-icg：气管内雾化注入40μl bpt-icg 50μg/ml，2h后超声处理5min；bpt-icg@bd：气管内雾化注入bpt-icg@bd(40μl，107pfu/ml bd，50μg/ml bpt-icg)，2h后超声处理5min；caz：尾静脉注射头孢他啶(30mg/kg)处理后其肺部细菌数量的定量分析和14天内的生存率曲线。
38.图7示出了实施例6中bpt-icg@bd对铜绿假单胞菌诱发的大鼠骨髓炎的治疗作用研究，其中，图7(a)为铜绿假单胞菌诱发的大鼠骨髓炎的造模和治疗示意图；图7(b)和图7(c)分别为感染大鼠在经不同样品处理(con：未进行治疗；us：原位注射pbs，2h后超声处理5min；caz：尾静脉注射头孢他啶(caz)30mg/kg；bpt-icg@bd：原位注射bpt-icg@bd(107pfu/ml bd,50μg/ml bpt-icg，100μl)，2h后超声处理5min)后骨髓中菌落图片和cfu数量变化图；图7(d)为治疗周期内各组大鼠体重变化图。
具体实施方式
39.为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料和处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
40.试剂：吲哚菁绿(icg)购于上海源叶生物有限公司；四氟化钛(tif4)购于sigma-aldrich公司；浓盐酸(hcl)、无水乙醇购自广州化学试剂厂；氯铂酸六水合物(h2ptcl6·
6h2o)、硼氢化钠(nabh4，98％)均购自上海阿拉丁试剂公司；聚乙烯吡咯烷酮(pvp-k30，mw＝40,000)购自索莱宝公司；试验用水均为去离子水。
41.菌株：铜绿假单胞菌菌株编号为atcc 27853，来源为american type culture collection(atcc,美国)；噬菌蛭弧菌菌株(bdellovibrio bacteriovorus hd 100)编号为dsm 50701，来源为deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen(dsmz，德国)。
42.实验动物：本研究采用balb/c小鼠(6-8周，雌性，体重18-20克，spf级)作为肺部感染的动物实验对象，购买自珠海百试通生物科技有限公司，动物生产许可证号：scxk(粤)2020-0051，动物合格证编号：no.44822700015055；本研究采用sd大鼠(雄性，体重200-250克，spf级)作为骨髓炎动物实验对象，购买自珠海百试通生物科技有限公司，动物生产许可证号：scxk(粤)2020-0051，动物合格证编号：no.44822700016227。
43.实施例1：一种复合声敏剂(bpt-icg)的制备
44.s1、将55.2ml无水乙醇、8ml聚乙烯吡咯烷酮(pvp)水溶液(9.75mg/ml，mw＝40,000)、500μl hcl(50mm)与5ml tif4(40mm)水溶液混合，室温搅拌1h。然后将其倒入100ml不锈钢反应釜中，180℃加热3h。离心收集，用纯水和无水乙醇各洗3遍，得到白色中空介孔二氧化钛(tio2)。
45.s2、将干燥的tio2粉末(50mg)分散在50ml去离子水中，水浴超声15min使其均匀的分散。在之前的tio2分散液中加入1ml h2ptcl6·
6h2o(10mm)，室温下搅拌1h。在剧烈搅拌下加入2ml 4mg/ml nabh4后继续搅拌3h。离心收集，用纯水洗涤3次，得到铂纳米粒修饰的白色中空介孔二氧化钛(pt-tio2)。
46.s3、将合成的pt-tio2转移到管式炉中，在氢气：氮气＝1：9的气氛中以5℃/min升温到500℃，并保持1h。反应结束恢复至室温时，得到bpt，取出后真空密封保存。
47.s4、将10mg bpt纳米粒子分散在10ml去离子水中，水浴超声15min使其均匀分散。向bpt分散液中加入10mg吲哚菁绿(icg)，室温搅拌12h。离心收集，纯水洗涤至上清无色以除去游离的icg，收集沉淀，即bpt-icg，收集每一次洗涤上清。
48.加载量由icg水溶液在780nm波长处的特征吸光度决定，包载效率(le)可由以下公式得到：le(％)＝(m
总-m
上清
)/(m
bpt
+m
总-m
上清
)
×
100％；采用在日本理学(rigaku)公司生产的型号为smartlab的x射线粉末衍射仪对tio2、pt-tio2、bpt样品进行物相分析；电子自旋共振谱图(esr)数据是用德国bruker公司生产的型号为a300-10/12的电子自旋共振波谱仪测试得到；bpt的n2吸附-脱附等温线数据是采用美国micromeritics公司生产的型号为asap 2460的分析仪测试得到；粒度和zeta电位数据是利用zetasizer pro(malvern)仪器测试得到。
49.图2示出了实施例1中制备的复合声敏剂的表征数据，其中，图2(a)-图2(c)分别为
白色中空介孔二氧化钛tio2、铂纳米粒修饰的氧化钛pt-tio2和铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛bpt的透射电镜图像；图2(d)为tio2、pt-tio2和bpt的xrd图谱；图2(e)为pt-tio2和bpt的电子自旋共振谱(esr)图谱；图2(f)为bpt的n2吸附-脱附等温线；图2(g)为tio2、pt-tio2、bpt和bpt-icg的粒径分布；图2(h)为tio2、pt-tio2、bpt和bpt-icg的zeta电位；图2(i)为不同条件下bpt-icg的药物释放曲线(mean
±
s.d.，n＝3)。
50.通过形貌表征，得到的tio2、pt-tio2、bpt纳米粒呈中空球形，平均直径约为100nm(图2(a)-图2(c))。从图2(a)-图2(c)也可以看出，pt-tio2、bpt纳米粒表面沉积了pt纳米粒子，并且保持了良好的分散性，高温氢化还原使得pt纳米粒子在tio2表面迁移均匀分布。采用xrd表征了pt-tio2纳米粒氢化还原前后的主晶型变化(图2(d))，从图中可以看出在tio2上沉积pt纳米粒子时出现明显的pt峰。二氧化钛还原后任然对应锐钛矿型(jcpds 21-1272)，意味着氢化还原没有发生相变。通过esr图谱(图2(e))证明bpt纳米粒氧空位的成功制备。此外，采用n2吸附/脱附检测其bet表面积变化，典型的ⅳ型等温线证明了bpt的中空结构(图2(f))，且可以看出还原前后对纳米粒结构破坏不大。由于制备的tio2具有中空结构使得其成为一种潜在的药物载体。采用美国食品和药物管理局(fda)批准的吲哚菁绿(icg)评价其载药特性。根据icg水溶液在780nm处的特征吸光度计算，bpt中的icg包载效率为45％。zeta电位的变化证明了逐步合成的成功，其中bpt-icg的zeta电位为-22.3mv(图2(g))，水合粒径为166.1nm左右(图2(h))。在不同ph值的磷酸盐缓冲液(pbs)里研究了吲哚菁绿的释放行为图(图2(i))，ph值的降低和超声均会增加吲哚菁绿的释放，可能原因一方面是较低的ph值降低了吲哚菁绿和bpt纳米粒的静电吸附作用，另一方面，超声空化作用促进吲哚菁绿从纳米粒空腔中释放，两个结果都会导致吲哚菁绿释放加快。
51.实施例2：bpt-icg对铜绿假单胞菌的声动力性质和抗菌作用研究
52.在本实施例中研究了实施例1中制备的bpt-icg对铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)的声动力性质和抗菌作用。
53.用稀释平板法检测bpt-icg对p.aeruginosa的抗菌效果。p.aeruginosa培养12h后分散在pbs中。将细菌(108cfu/ml,400μl)分别与不同ti浓度(终浓度为0、25、50、100μg/ml)的bpt-icg纳米粒(100μl)混合。使用超声仪超声2min，超声参数为：频率1.0mhz，50％占空比，功率1.5w cm-2
。其中，con为未添加bpt-icg纳米粒也未进行超声处理的对照组，us为ti终浓度为0μg/ml的超声组。
54.tio2、bpt的能带数据是利用美国thermo公司生产的型号为escalab 250xi的x射线光电子能谱仪测试得到。
55.采用溶氧仪(jpsj-605f，lei-ci，shanghai，china)检测pt-tio2、bpt对h2o2分解产生o2的含量。室温下，将1ml ti浓度均为50μg/ml的pt-tio2、bpt加入到200μm的h2o2溶液中。每10s记录一次溶氧数据变化。
56.dpbf是ros检测探针。在ti浓度均为50μg/ml的tio2、pt-tio2、bpt、bpt-icg溶液中加入50μl dpbf dmso溶液(1mg/ml)。混合均匀后，将混合液按固定时间间隔施加超声进行照射(超声参数：1.5w cm-2
,1.0mhz,50％占空比)。利用紫外分光光度计(yoke t2602，shanghai，china)记录dpbf的浓度变化。
57.sosg是一种广泛用于检测1o2的荧光分子探针。将1μl sosg甲醇溶液(5mm)与ti浓度均为50μg/ml的tio2、pt-tio2、bpt、bpt-icg溶液混合。以固定的时间间隔对该混合溶液进
行超声照射(超声参数：1.5w cm-2
,1.0mhz,50％占空比)。用荧光分光光度计对sosg的荧光强度进行测定。
58.图3示出了实施例2中复合声敏剂bpt-icg的声动力学性质、机理及抗菌作用，其中，图3(a)为bpt-icg在超声(us)辐照下产生ros的机理示意图；图3(b)为tio2、bpt的能带图；图3(c)为在厌氧环境中相同ti浓度的pt-tio2和bpt催化h2o2产生o2的量对比；图3(d)为与ti浓度均为50μg/ml tio2、pt-tio2、bpt、bpt-icg混匀后立即超声的活性氧探针dpbf的浓度变化情况；图3(e)为与ti浓度均为50μg/ml tio2、pt-tio2、bpt、bpt-icg混匀后立即超声的单线态氧荧光探针sosg在超声照射下的相对吸收强度；图3(f)为不同浓度的bpt-icg与铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)共孵育2h并超声处理2min后cfu的数量统计(n＝3；means
±
s.d.)。
59.bpt纳米粒在超声照射下触发电子(e-)空穴(h
+
)对的分离，生成的e-与o2反应生成
·o2-，并被消耗产生毒性1o2；与此同时生成的h
+
与h2o反应生成
·
oh(图3(a))。tio2的能带隙为3.0～3.2ev(图3(b))，不足以实现e-和h+对的有效分离，导致ros产生有限。与tio2(3.11ev)相比，bpt的带隙更窄，约为2.24ev，更有利于us辐照下e-和h
+
对的分离(图3(b))。综上所述，与tio2相比，bpt具有更强的促进e-和h
+
对分离的能力，从而产生更高水平的1o2和
·
oh。
60.bpt作为声动力治疗的声敏剂显示出很大的前景。由于氧气是产生活性氧的原料，因此氧气对于bpt发挥声动力作用至关重要。bpt具有纳米酶活性，能够催化环境里的h2o2产生氧气，在相同ti浓度条件下，bpt的产氧效率约为pt-tio2的1.5倍，这主要是因为还原后铂纳米粒的比表面积增加，有更多的活性位点参与催化。为了验证bpt是否相较于tio2、pt-tio2具有更强的sdt活性，1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)探针被用于检测sdt效果，因为dpbf可以与产生的ros反应，使得其在420nm左右波长处的紫外特征吸收下降。将tio2、pt-tio2和bpt在相同的条件下进行超声处理。如预期那样，bpt能够产生最多的ros(图3(c))。该结论证实pt纳米粒子的沉积和氧空位的制备更有利于电子和空穴的分离从而产生更多的ros。由于有机声敏剂吲哚菁绿的引入，bpt-icg能够产生会更多的1o2(图3(d))。此外，用单线态氧荧光探针sosg表征bpt-icg体系在不同条件下1o2的产量。随着超声时间的增加，sosg的荧光信号强度也不断增加，表明tio2、pt-tio2、bpt和bpt-icg都能产生1o2，结论与dpbf实验一致，bpt-icg产生1o2效率最高(图3(e))。验证了bpt-icg在超声辐射下产生ros的能力后，我们进一步评估了材料的声动力抗菌性能。选用铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)作为革兰氏阴性菌菌株模型。根据处理后p.aeruginosa的剩余菌落形成单位(cfu)，在超声条件下bpt-icg纳米结构显示出对p.aeruginosa的显著杀伤，并且随着纳米复合材料浓度的增加，声动力杀菌效率逐渐增加(图3(f))。
61.实施例3：一种复合声敏剂细菌靶向的递送系统的制备
62.将蛭弧菌(1
×
108个pfu)加入到10ml含有0.5mg/ml多巴胺的10mm tris-hcl缓冲液(ph＝8.5)中，并在30℃、800rpm条件下搅拌15分钟。然后，加入500μl的1mg/ml bpt-icg tris-hcl缓冲液，继续搅拌30分钟。6500rpm/min离心收集，得到bpt-icg@bd，用pbs洗涤两次。将收集的bpt-icg@bd重悬于pbs中，并保存在4℃以备进一步使用。
63.为了观察bpt-icg是否成功负载在蛭弧菌(bd)表面，将bpt-icg@bd中的蛭弧菌膜用fm 4-64染成红色，bpt-icg因为载有icg可发出绿色荧光。用激光共聚焦显微镜(clsm)观
察bd和bpt-icg的共定位。
64.将bd、bpt-icg@bd用syto 9染色为绿色，p.aeruginosa用hoechst 33342染色为蓝色。随后将bd、bpt-icg@bd和p.aeruginosa共孵育15min，用激光共聚焦显微镜(clsm)观察bd和bpt-icg@bd捕食p.aeruginosa的情况。
65.p.aeruginosa培养12h后分散在pbs中。将细菌(108cfu/ml,400μl)分别与pbs(100μl)、bd(107pfu/ml,100μl)、bpt-icg(50μg/ml,100μl)、bpt-icg@bd(107pfu/ml bd,50μg/ml bpt-icg,100μl)。使用超声仪超声2min，超声参数为：频率1.0mhz，50％占空比，功率1.5w cm-2
。用稀释平板法检测bpt-icg@bd对p.aeruginosa的抗菌效果。
66.图4示出了实施例3中蛭弧菌表面包载复合声敏剂的细菌靶向的递送系统(bpt-icg@bd)的表征、抗菌效果和捕食效率，其中，图4(a)为bpt-icg@bd的激光共聚焦显微镜的(clsm)共定位图片，从左至右依次为纳米粒中icg的绿色荧光信号、红色染料染过的蛭弧菌细胞膜和二者结合之后的荧光信号；图4(b)为纯蛭弧菌(bd)和表面修饰了bpt-icg的蛭弧菌的捕食能力，从左至右依次是，用syto 9将蛭弧菌染成绿色、用hoechst 33342将铜绿假单胞菌染成蓝色和蛭弧菌对铜绿假单胞菌的捕食；图4(c)从左至右依次为磷酸缓冲液(pbs)、bd、bpt-icg、bpt-icg@bd与铜绿假单胞菌p.aeruginosa共孵育2h后，并对其进行超声处理2min后的菌落图片；图4(d)从左至右依次为磷酸缓冲液(pbs)、bd、bpt-icg、bpt-icg@bd与铜绿假单胞菌p.aeruginosa共孵育2h后，并对其进行超声处理2min后细菌菌落(cfu)的数量统计结果。
67.图4(a)示出了用膜染料fm 4-64标记蛭弧菌，利用bpt-icg自发的荧光，通过激光共聚焦共定位验证bpt-icg@bd的成功制备。为了研究在蛭弧菌表面修饰纳米粒会否影响其对猎物的捕食作用，用syto 9将蛭弧菌染成绿色，用hoechst 33342将铜绿假单胞菌染成蓝色，通过激光共聚焦来观察bd和bpt-icg@bd组对铜绿假单胞菌的捕食差异，结果表明表面修饰的纳米粒并不会显著影响到蛭弧菌对铜绿假单胞菌的捕食能力(图4(b))。
68.由于结合蛭弧菌对铜绿假单胞菌天然的靶向捕食能力，极大地增强了表面修饰的纳米粒与细菌的相互作用，降低其在超声下产生的ros与细菌的作用距离，因此bpt-icg@bd在超声作用下能够产生最强的声动力抗菌作用(图4(c)-图4(d))。
69.实施例4：bpt-icg@bd的抗细菌生物被膜的研究
70.本实施例研究了实施例3中制备的复合声敏剂细菌靶向的递送系统bpt-icg@bd的抗细菌生物被膜的研究。
71.用syto 9将p.aeruginosa生物膜染成绿色，然后去除上清液，pbs洗涤三次。向生物膜中加入cy5标记的bpt-icg@bd(107pfu/ml bd,50μg/ml bpt-icg,1ml)，37℃孵育不同时间。接下来，去除上清液，用pbs冲洗生物膜三次，以去除多余的bpt-icg@bd。用激光共聚焦显微镜(clsm)观察生物膜中bpt-icg@bd的位置。
72.将p.aeruginosa(108cfu/ml)分散于mueller-hinton broth(mhb)培养基中培养24h形成生物膜。在细菌生物膜中加入pbs(1ml)、bd(107pfu/ml bd,1ml)、bpt-icg(50μg/ml,1ml)、bpt-icg@bd(107pfu/ml bd,bpt-icg 50μg/ml bpt-icg,1ml)共孵育2h后，施加超声2min后，用syto 9/pi染色剩余生物膜，并用激光共聚焦显微镜(clsm)观察。对于结晶紫染色，用无菌pbs(ph 7.4)冲洗平板后干燥10min，用0.01％(w/v)的结晶紫染色30min，然后加入无水乙醇溶解结晶紫，用酶标仪测定570nm处吸光度来测定生物膜生物量。对于生物膜
内细菌数量确定，向不同处理组的生物膜中加入pbs(500μl)，吹打生物膜使其分散，通过用稀释平板法检测生物膜细菌数量。
73.图5示出了实施例4中表面包载复合声敏剂的细菌靶向的递送系统(bpt-icg@bd)的体外抗生物膜活性，其中，图5(a)为通过激光共聚焦显微镜(clsm)观察不同孵育时间bpt-icg@bd侵入铜绿假单胞菌生物膜情况，从上至下，bpt-icg@bd侵入铜绿假单胞菌生物膜的时间依次为30、60和120min，bpt-icg@bd被cy 5-nhs染色为红色，铜绿假单胞菌生物膜被syto 9染色为绿色；图5(b)为不同处理后用syto 9/pi染色的铜绿假单胞菌生物膜的激光共聚焦显微镜(clsm)图像；图5(c)为不同处理后用用结晶紫染色生物膜的相对定量；图5(d)和图5(e)分别为不同组处理后铜绿假单胞菌生物膜内的细菌菌落图片和cfu数量图。
74.细菌生物膜是由细菌分泌的生物大分子(如多糖和蛋白质)形成的水合基质包裹各种细菌而形成的膜状物，其显著降低细菌对抗生素和免疫系统的免疫攻击的敏感性，所以根除体内生物膜极其困难。针对bpt-icg@bd的抗生物被膜活性，首先研究了bpt-icg@bd穿透生物膜的能力(图5(a))。通过激光共聚焦显微镜发现bpt-icg@bd处理30min后，红色荧光在生物膜表面分散，2h后在生物膜中扩散，说明bpt-icg@bd仍保留了蛭弧菌的运动能力，能够在生物膜的细菌外基质中游动，bpt-icg@bd可以在2小时内完全穿透约40μm厚的生物膜(图5(a))。
75.接下来，探究bpt-icg@bd对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用。经过不同组处理后的生物膜用活/死染色试剂盒进行染色并用激光共聚焦显微镜进行观察其完整性(图5(b))。由于超声的物理破坏作用和蛭弧菌的捕食能力，超声(us)组和蛭弧菌(bd)组可以一定程度上破坏生物膜结构，但红色荧光较弱，表明其难以杀灭生物膜中的细菌，而bpt-icg@bd能够通过联合蛭弧菌、超声的物理破坏以及产生的ros，显著地瓦解细菌生物膜，并呈现较强的红色荧光信号，表明bpt-icg@bd不仅能够破坏生物膜，而且还能够靶向杀伤生物膜内部的细菌(图5(b))。通过结晶紫染色生物膜定量分析(图5(c))，us组、bd组和bpt-icg@bd组能将生物膜去除46.13％、33.24％和30.85％，而在超声作用下，bpt-icg@bd+us组能清除绝大部分的生物膜(约88.71％)。此外，通过分析不同处理组生物膜中的细菌含量(图5(d)-图5(e))，与对照组相比，bpt-icg@bd+us组能够降低生物膜内细菌数量约4.62log，效果是游离纳米粒bpt-icg组的2.56倍，表明bpt-icg@bd联合us刺激具有优异的清除生物膜内细菌效果。
76.实施例5：bpt-icg@bd针对肺部感染的体内抗菌作用研究
77.本实施例中研究了实施例3中制备的复合声敏剂细菌靶向的递送系统bpt-icg@bd针对肺部感染的体内抗菌作用。
78.将小鼠随机分为6个治疗组：pbs、us、bd、bpt-icg、bpt-icg@bd、caz组，每组6只。将小鼠麻醉后，气管内接种5
×
106cfu铜绿假单胞菌，感染24h后，气管内给予pbs(40μl)、bd(40μl,107pfu/ml)、bpt-icg(40μl，75μg/ml)bpt-icg@bd(40μl,107pfu/ml bd，75μg/ml bpt-icg)。caz组尾静脉给予60mg/kg的头孢他啶。us组、bpt-icg组或bpt-icg@bd组给药后2h施加超声5min(超声参数：1.5w cm-2
,1.0mhz,50％占空比)。治疗后，对所有小鼠实施安乐死，收集小鼠肺部进行细菌载量定量。
79.图6示出了实施例5中bpt-icg@bd对铜绿假单胞菌诱发的小鼠肺部感染的体内治疗作用，其中图6(a)为铜绿假单胞菌诱发的肺炎感染小鼠的建模和治疗示意图；图6(b)和
图6(c)分别为为细菌计数法测定感染小鼠在经不同处理组(con:未进行治疗；us：气管内雾化注入pbs(40μl)，2h后超声处理5min；bd：气管内雾化注入蛭弧菌40μl 107pfu/ml；bpt-icg：气管内雾化注入40μl 50μg/ml bpt-icg，2h后超声处理5min；bpt-icg@bd：气管内雾化注入40μl bpt-icg@bd(107pfu/ml bd，50μg/ml bpt-icg)，2h后超声处理5min；caz：尾静脉注射头孢他啶30mg/kg)处理后其肺部细菌数量的定量分析和14天内的生存率曲线。
80.为了研究bpt-icg@bd的体内抗菌作用，我们也评估了其对铜绿假单胞菌诱发的肺部感染的治疗作用。先用balb/c小鼠建立铜绿假单胞菌感染的肺炎模型(图6(a))。每只小鼠气管内接种4
×
106cfu铜绿假单胞菌(40μl,108cfu/ml)，饲养24h，建立肺炎感染模型(图6(a))。随后通过气管内喷雾注入pbs(us组)、bd、bpt-icg或者bpt-icg@bd，us组或bpt-icg@bd+us组在给药后2h使用超声处理(1.5w cm-2
，1.0mhz，50％占空比，5min)。治疗后，立即采集肺组织进行研磨。然后将研磨溶液进行梯度稀释，取50μl匀浆在cn培养基固体平板上。如图6(b)所示，bpt-icg@bd组处理后的细菌数量与阴性对照(con组)相比降低了近三个数量级，与bpt-icg组相比显著降低。此外，我们也对小鼠在感染后的生存率进行了监测(图6(c))，更为重要的是，bpt-icg@bd治疗的小鼠在14天的研究周期内的存活率为100％，与之形成鲜明对比的是，所有未经治疗的小鼠都在三天内死亡，而其他治疗组的小鼠的生存率也都低于80％。我们的结论是，与对照组相比，bpt-icg@bd的长时间肺潴留和靶向特性使生存期显著改善。随后，我们比较bpt-icg@bd与常规静脉(iv)注射临床相关剂量(每只小鼠1.2mg)头孢他啶caz治疗的疗效，虽然两者治疗的小鼠均没有死亡，但是bpt-icg@bd治疗的小鼠肺部的细菌量比caz治疗的小鼠更少(图6(b))，表面具有更好的疗效。而且由于抗菌机制原因，此声敏剂递送系统有望可治疗对抗生素caz耐药的细菌感染，而caz则难以进行治疗。
81.实施例6：bpt-icg@bd针对骨髓炎的体内抗菌作用研究
82.本实施例中研究了实施例3中制备的复合声敏剂靶向活菌递送系统bpt-icg@bd针对骨髓炎的体内抗菌作用。
83.sd大鼠(200-250g)购自珠海百试通生物科技有限公司，按照gibh实验动物福利和伦理委员会批准的指导方针使用。将大鼠麻醉后，脱去后腿上的毛发，用碘伏进行皮肤消毒。用手术刀暴露胫骨平台，然后用颅骨钻形成一个直径1.6毫米的皮质骨缺损。之后，将100μl的铜绿假单胞菌悬液(108cfu/ml)通过骨缺损注入髓内管，建立骨髓炎模型。对于不同组的处理，在髓内管中注射pbs或bpt-icg@bd，或静脉注射头孢他啶(caz)。最后，用骨蜡将骨缺损封闭，消毒然后缝合伤口。con组注射100μl pbs；us组注射100μl pbs，2h后用超声处理5分钟；caz组静脉注射caz(30mg/kg)；bpt-icg@bd组注入100μlbpt-icg@bd(107pfu/ml bd，50μg/ml bpt-icg)，2h后超声处理5分钟。所有超声参数均为1.5w cm-2
,1.0mhz,50％占空比。
84.治疗后，采集骨髓组织进行10倍梯度稀释，取100μl匀浆在cn培养基固体平板上，从而评价体内抑菌活性。
85.图7示出了实施例6中bpt-icg@bd对铜绿假单胞菌诱发的大鼠骨髓炎的治疗作用研究，其中，图7(a)为铜绿假单胞菌诱发的大鼠骨髓炎的造模和治疗示意图；图7(b)和图7(c)分别为感染大鼠在经不同样品处理(con：未进行治疗；us：原位注射pbs，2h后超声处理5min；caz：尾静脉注射头孢他啶(caz)30mg/kg；bpt-icg@bd：原位注射bpt-icg@bd(107pfu/
ml bd,50μg/ml bpt-icg)，2h后超声处理5min)后骨髓中菌落图片和cfu数量变化图；图7(d)为治疗周期内各组大鼠体重变化图。
86.为了评估bpt-icg@bd在体内对铜绿假单胞菌生物膜相关感染的治疗作用，我们进一步构建了铜绿假单胞菌诱发的骨髓炎sd大鼠模型(图7(a))。首先，在每只小鼠胫骨平台钻孔接种1
×
107cfu铜绿假单胞菌(100μl，108cfu/ml)，饲养120h，建立骨髓炎感染模型。随后在髓内管中加入pbs或者bpt-icg@bd，同时静脉注射头孢他啶(caz)作为阳性对照。其中us组注射100μl pbs，bpt-icg@bd组注射100μl bpt-icg@bd(107pfu/ml，50μg/ml bpt-icg)，2h后超声处理5min(1.5w cm-2
，50％占空比，1.0mhz)。caz组静脉注射头孢他啶(30mg/kg)。治疗后，收集骨髓组织并进行梯度稀释，取100μl匀浆在cn培养基固体平板上。如图7(b)-图7(c)所示，经过第0、7天两次治疗后，第七天bpt-icg@bd组处理后的细菌数量与对照相比降低了三个数量级，其抗菌作用显著强于阳性对照caz组。图7(d)记录了治疗周期以来大鼠的体重变化，bpt-icg@bd组体重呈健康增长趋势，接近正常组。然而，其他组的生长速度均显著低于正常组，表明细菌感染对其生长产生了明显的抑制作用。
87.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
88.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种复合声敏剂，其特征在于，所述复合声敏剂由无机声敏剂和有机声敏剂复合而成，其中，所述无机声敏剂选自二氧化钛纳米粒、金属-有机骨架纳米颗粒、碳化钛二维纳米片的一种或多种，所述有机声敏剂选自吲哚菁绿、血卟啉单甲醚、二氢卟吩的一种或多种。2.根据权利要求1所述的复合声敏剂，其特征在于，所述无机声敏剂与所述有机声敏剂的质量比为(0.2～5):1。3.根据权利要求1所述的复合声敏剂，其特征在于，所述氧化钛纳米粒为铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛。4.根据权利要求1所述的复合声敏剂的制备方法，其特征在于，所述复合声敏剂的制备方法包括以下步骤：s1、将乙醇、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、盐酸和四氟化钛水溶液共混反应，加热后离心收集，洗涤后得到白色中空介孔二氧化钛；s2、将所述白色中空介孔二氧化钛粉末分散在水中，加入六水合氯铂酸，搅拌反应后加入硼氢化钠，反应后得到铂纳米粒修饰的白色中空介孔二氧化钛；s3、将所述铂纳米粒修饰的白色中空介孔二氧化钛在惰性气体气氛中加热，得到所述铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛；s4、将所述铂纳米粒修饰的黑色中空介孔二氧化钛分散在水中，超声，加入所述吲哚菁绿，反应得到所述复合声敏剂。5.根据权利要求4所述的复合声敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s2中，白色中空介孔二氧化钛粉末与六水合氯铂酸的质量比为1:(0.16～0.3)。6.根据权利要求4所述的复合声敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s3中，加热温度为300-700℃，加热时间为0.1-3h。7.根据权利要求4所述的复合声敏剂的制备方法，其特征在于，步骤s4中，反应时间为8-24h。8.一种表面包载如权利要求1-7任一项所述复合声敏剂的细菌靶向的递送系统。9.如权利要求8所述细菌靶向的递送系统在抗菌产品和治疗细菌感染中的应用。

技术总结
本发明提供了一种能够治疗铜绿假单胞菌生物被膜相关感染的的复合声敏剂与其细菌靶向的递送系统BPT-ICG@Bd，其中，复合声敏剂(BPT-ICG)由无机声敏剂(BPT)与有机声敏剂(ICG)复合而成，Bd是天然革兰氏阴性菌捕食者蛭弧菌，通过聚多巴胺将复合声敏剂(BPT-ICG)修饰到蛭弧菌(Bd)表面形成BPT-ICG@Bd。利用蛭弧菌捕食革兰氏阴性菌的高速运动特性，破坏生物被膜结构，入侵细菌，同时施加超声触发复合声敏剂产生大量活性氧，快速清除生物被膜和细菌，以用于生物被膜相关的肺部感染和骨感染。以用于生物被膜相关的肺部感染和骨感染。以用于生物被膜相关的肺部感染和骨感染。


技术研发人员：丁鑫 卜长鑫 陈姣妤 于家寅 袁佩妍
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/12