一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法与流程

1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法。


背景技术：

2.采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌，灭菌主要方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌。化学试剂灭菌主要指环氧乙烷灭菌，射线灭菌主要指辐照灭菌，干热灭菌主要指用烘箱加热灭菌，湿热灭菌主要之用灭菌锅灭菌，过滤灭菌主要指用微孔滤膜过滤灭菌。通过物理或化学方法改善物质表面性能的方法称为表面改性。
3.常用的表面改性的主要方法包括物理改性和化学改性两类方法。物理改性包括表面涂覆改性、表面真空镀、溅射、表面机械改性和喷射等。化学改性包括放电、射线辐照、离子镀、电镀、火焰改性、溶液处理等。对于动物体和人体内的大部分细胞，比如成纤维细胞，骨骼组织，心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺皮肤神经胶质细胞等，当细胞置于体外进行培养时，大多数均以贴壁方式生长，因此，必须要求体外细胞培养装置与细胞接触的表面具有一定的亲水性，才能满足贴壁型细胞体外培养要求。
4.当前，一次性塑料培养板在生物、医药、化工等许多领域都得到广泛应用。塑料制品因价格低廉，成为生物、医药等行业进行实验分析的首选高分子材料。然而，现有技术中的细胞培养板，如聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、聚碳酸酯(pc)等，其表面都不亲水，用于细胞的贴壁培养非常困难。
5.现有技术中，一般采用放电气体产生的等离子体对细胞培养板进行表面清洗，提高细胞培养板表面的润湿性能。同时等离子体使细胞培养板表面的原有的化学键产生断裂，大大地激活其表面活性。再通过反应气体在等离子表面处理设备中电离出活性基团，在活化的材料表面发生化学反应，引入新的官能团，有效提高细胞培养板的表面亲水能力；而产品灭菌的步骤则一般是在包装完成之后单独进行辐照灭菌。但该方法需要将表面改性和灭菌作为两个步骤独立处理，操作繁琐，处理效率低，成本较高。还有采用uvo(紫外-臭氧)的方式对一些聚酯类高分子材料进行表面改性，其主要利用短波紫外光的照射，臭氧会生成和分解的原理，使原子氧和分子氧积累，原子氧与空气中的羟基自由基形成羟基，在高分子链上留下烯烃单元；分子氧与碳自由基反应，形成一个过氧基团，然后从相邻的碳链中提取一个氢原子，形成过氧化氢单元，羟基与过氧化氢进一步被氧化得到酮或酯基，从而高分子表面生成众多的产物，完成改性。但该方法往往用于处理薄膜，对培养板处理效果不明显，且同样表面改性和灭菌作为两个步骤独立处理，操作繁琐，处理效率低。
6.因此，需要提供一种更简单高效的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法。


技术实现要素：

7.发明目的：
8.为了解决现有技术中存在的表面改性和灭菌作为两个步骤独立处理，操作繁琐，处理效率低，成本较高的问题，本发明提供一种更简单高效的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法。
9.技术方案：
10.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
11.本发明提供一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：
12.s1：将未经处理的细胞培养板放置在臭氧消毒设备中，进行臭氧灭菌90～110min；
13.s2：步骤s1结束后，对细胞培养板进行表面亲水改性处理，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒设备内，22～26h后再将细胞培养板取出，即得已灭菌且已表面亲水改性处理的细胞培养板。
14.优选的，步骤s1中臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％。
15.优选的，步骤s1中臭氧灭菌为99min或者105min。
16.优选的，步骤s2中，臭氧消毒设备内臭氧含量保持在大于20ppm。
17.优选的，步骤s2中，细胞培养板放置在臭氧消毒柜内的时间为24h或者25h。
18.优选的，所述细胞培养板的材质为聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯或者高密度聚乙烯材质。
19.优选的，所述细胞培养板需是经过包装的且包装材料至少有一个面是强盖板。
20.有益效果：
21.本发明的有益效果是：本发明的一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，由于步骤s1中采用臭氧消毒柜产生臭氧，臭氧是强氧化剂，可以对细胞培养板进行有效的灭菌处理。其次，步骤s2中，步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内22～26h，长时间放置在臭氧环境后，细胞培养板表面在臭氧的作用下会产生游离的活性基团，增加细胞培养板的亲水能力，从而对细胞培养板进行表面亲水改性处理。相对于现有技术而言，本发明对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法将灭菌和表面改性两个步骤合并到一台设备处理，操作简单，处理效率高，成本较低，能够在大大提高细胞培养板的亲水能力，提高细胞贴壁率的同时实现产品灭菌，从而实现大规模生产。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理后，细胞培养板上水滴的接触角示意图；
23.图2为对比例2中未经任何处理的细胞培养板上水滴的接触角示意图；
24.图3为实施例1对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理后的细胞培养板和未经任何处理的细胞培养板中贴壁细胞数量的对比图；
25.附图标记说明：
26.1：水滴；2：细胞培养板。
具体实施方式
27.为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
28.细胞培养需要无菌环境，故需要使用无菌的培养耗材，本发明的相关研究人员经过研究发现臭氧是强氧化剂，可以对细胞培养板进行有效的灭菌处理；细胞的生长需要水分的存在，本发明的相关研究人员经过研究发现，当进一步提升培养板表面的亲水性能后，水分与细胞培养板之间的接触就会更多，细胞的贴壁现象会进一步增加。因此，本发明通过使用臭氧同时实现细胞培养板的灭菌和表面亲水改性处理。具体地，本发明提供一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：
29.s1：将未经处理的细胞培养板放置在臭氧消毒柜中并关紧柜门，开启臭氧发生器设置定时90～110min进行臭氧灭菌。臭氧消毒柜为通过空气源产生的臭氧，臭氧是强氧化剂，可以对细胞培养板进行有效的灭菌处理。
30.s2：步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内，臭氧消毒柜内封闭，此时臭氧消毒柜内保持臭氧浓度为大于20ppm，22～26h后将细胞培养板取出。长时间放置在臭氧环境后，细胞培养板表面在臭氧的作用下会产生游离的活性基团，增加细胞培养板的亲水能力，从而对细胞培养板进行表面亲水改性处理。出于使用成本考虑选择步骤s2不开启臭氧发生器，如不考虑使用成本也可以开启臭氧发生器，使臭氧消毒柜内保持臭氧浓度为大于20ppm。
31.上述步骤s1中臭氧作为强氧化剂，能使细胞培养板表面一切微生物永远丧失其生长繁殖能力，从而达到灭菌的目的。
32.上述步骤s2中臭氧长时间作用于细胞培养板表面，会与细胞培养板表面发生反应，产生游离的带电活性基团，细胞培养板的亲水能力，从而对细胞培养板进行表面亲水改性处理。
33.上述步骤s1中臭氧发生器设置定时时间为90～110min，优选时间为99min和105min。
34.上述步骤s2中，步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内的时间为22～26h，优选时间为24h和25h。
35.上述细胞培养板可以是为聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯或者高密度聚乙烯材质。在结构以及形状方面，细胞培养板可以是6孔、12孔、24孔、48孔、96孔的细胞培养板。
36.优选地，放入臭氧消毒柜的细胞培养板需是经过包装的且包装材料至少有一个面是强盖板，从而保证臭氧能穿透包装，直接作用于细胞培养板表面。
37.相比现有技术，本发明的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法将灭菌和表面改性两个步骤合并到一台设备处理，操作简单，处理效率高，成本较低，能够在大大提高细胞培养板的亲水能力，提高细胞贴壁率的同时实现产品灭菌，从而实现大规模生产。
38.实施例1：
39.一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：
40.s1：将未经处理的24孔细胞培养板放置在臭氧消毒柜中并关紧柜门，开启臭氧发生器设置定时99min，臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％进行臭氧灭菌；
41.s2：步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内，保持臭氧含量为大于20ppm，24h后将24孔细胞培养板取出。
42.实施例2：
43.一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：
44.s1：将未经处理的24孔细胞培养板放置在臭氧消毒柜中并关紧柜门，开启臭氧发生器设置定时99min，臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％进行臭氧灭菌；
45.s2：步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内，保持臭氧含量为大于20ppm，25h后将24孔细胞培养板取出。
46.实施例3：
47.一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：
48.s1：将未经处理的24孔细胞培养板放置在臭氧消毒柜中并关紧柜门，开启臭氧发生器设置定时105min，臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％进行臭氧灭菌；
49.s2：步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内，保持臭氧含量为大于20ppm，24h后将24孔细胞培养板取出。
50.实施例4：
51.一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：
52.s1：将未经处理的24孔细胞培养板放置在臭氧消毒柜中并关紧柜门，开启臭氧发生器设置定时105min，臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％进行臭氧灭菌；
53.s2：步骤s1结束后，不打开柜门，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒柜内，保持臭氧含量为大于20ppm，25h后将24孔细胞培养板取出。
54.对比例1：
55.将未经处理的24孔细胞培养板放置在臭氧消毒柜中并关紧柜门，开启臭氧发生器设置定时99min，臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％进行臭氧灭菌，灭菌结束后立即将细胞培养板取出。
56.对比例2：
57.本对比例提供一种未经任何处理的24孔细胞培养板。
58.在实施例1-4以及对比例1-2中的细胞培养板上滴加水滴，分别检测水滴和细胞培养板之间的接触角。以接触角大小定量表示细胞培养板的亲水性能以及疏水性能，当接触角小于90
°
，接触角越小，表示亲水性越好；当接触角大于90
°
，接触角越大，表示疏水性能越好。
59.对实施例1-4以及对比例1-2进行接触角测试，实施例1细胞培养板上水滴的状态图如图1所示，对比例2细胞培养板上水滴的状态图如图2所示，测试结果参见表1。
60.表1各实施例及对比例中水滴和细胞培养板之间的接触角
[0061] 方案接触角(
°
)实施例1定时99min；放置24h后取出＜10实施例2定时99min；放置25h后取出＜10实施例3定时105min；放置24h后取出＜10实施例4定时105min；放置25h后取出＜10对比例1定时99min后取出80
±
2对比例2未处理88
±2[0062]
通过表1可知，步骤s1结束后，不打开柜门，将细胞培养板继续放置在臭氧消毒柜内，22～26h后再取出，亲水性能明显好于对比例1灭菌完直接取出的细胞培养板和对比例2未经处理的细胞培养板。
[0063]
选用实施例1和对比例2中未经任何处理的细胞培养板，进行细胞培养验证：
[0064]
1、首先从液氮罐中取出一支装有vero细胞的冻存管，快速放入37℃水浴锅中两分钟。
[0065]
2、在两分钟复苏期间，将15ml新鲜培养基(10％fbs，90％dmem)加入cellpro t75细胞培养瓶中。
[0066]
3、两分钟复苏结束后，将vero细胞的冻存管从水浴锅取出，用75％酒精擦拭消毒。
[0067]
4、无菌环境下取细胞，用1000μl吸头吸取冻存细胞液至15ml离心管内，加入5ml培养基，离心去上清。再加入1ml培养基重悬。将1ml细胞培养液加入cellpro t75细胞培养瓶中，轻摇后，放置在37℃，5％co2的孵箱中静置培养。
[0068]
5、培养2d后，消化细胞并收集，将收集到的细胞以1x105cells/ml接种在上述2种细胞培养板上，每种细胞培养板接种13ml。
[0069]
6、24h后，取出两种细胞培养板，取上清液做至15ml离心管中留作内毒素检测使用；使用胰酶消化底部贴壁细胞，然后分别记录实施例1和对比例2细胞培养板中贴壁细胞数量，结果参见表2。
[0070]
表2不同细胞培养板贴壁细胞数量记录表
[0071][0072]
通过表2和图3可知，vero细胞在臭氧灭菌并表面处理的24孔细胞培养板内的贴壁效果相比未经任何处理的24孔细胞培养板培养板，其贴壁效果也扩大了19倍多，说明该表面亲水处理细胞培养板对细胞贴壁有着显著的增强作用。
[0073]
7、取步骤6中的两种上清液，分别作为供试品溶液1(实施例1)和供试品溶液2(对比例2)，按照下表3制备溶液a、b、c和d(λ为所用鲎试剂的灵敏度，λ＝0.03eu/ml)。
[0074]
表3溶液a、b、c和d制备方法
[0075]
组别内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数a无/供试品溶液2
b2λ/供试品溶液2c2λ/检查用水2d无/检查用水2
[0076]
8、取复溶后的鲎试剂0.1ml/管，分别加入等体积上述溶液。将瓶中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37
±
1℃水浴锅保温60
±
2min后观察是否形成凝胶,结果参见表4。
[0077]
表4不同细胞培养板上清液内毒素检测结果记录表
[0078][0079]
通过表4可以看出臭氧灭菌并表面处理的24孔细胞培养板上清液内毒素检测结果为阴性，说明内毒素含量小于0.03eu/ml，可以判断为无菌；而未处理24孔细胞培养板上清液内毒素检测结果为阳性，说明内毒素含量大于0.03eu/ml，所以存在一定量的细菌，会污染细胞。
[0080]
以上实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定，本领域技术人员在权利要求的范围内做出各种变形或修改，均属于本发明的实质内容。

技术特征：
1.一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：将未经处理的细胞培养板放置在臭氧消毒设备中，进行臭氧灭菌90～110min；s2：步骤s1结束后，对细胞培养板进行表面亲水改性处理，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒设备内，22～26h后再将细胞培养板取出，即得已灭菌且已表面亲水改性处理的细胞培养板。2.根据权利要求1所述的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，步骤s1中臭氧灭菌时臭氧产量为20g/h,臭氧浓度为大于20ppm，温度不超过30℃，湿度不超过80％。3.根据权利要求1所述的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，步骤s1中臭氧灭菌时间为99min或者105min。4.根据权利要求1所述的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，步骤s2中，臭氧消毒设备内臭氧含量保持在大于20ppm。5.根据权利要求1所述的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，步骤s2中，细胞培养板放置在臭氧消毒柜内的时间为24h或者25h。6.根据权利要求1所述的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，所述细胞培养板的材质为聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯或者高密度聚乙烯材质。7.根据权利要求1所述的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，其特征在于，所述细胞培养板需是经过包装的且包装材料至少有一个面是强盖板。

技术总结
本发明涉及一种对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法，包括如下步骤：S1：将待处理的细胞培养板放置在臭氧消毒设备中，进行臭氧灭菌90～110min；S2：步骤S1结束后，对细胞培养板进行表面亲水改性处理，仍然将细胞培养板放置在臭氧消毒设备内，22～26h后再将细胞培养板取出，即得已灭菌且已表面亲水改性处理的细胞培养板。有益效果是，本发明的对细胞培养板灭菌并表面亲水改性处理的方法将灭菌和表面改性两个步骤合并到一台设备处理，操作简单，处理效率高，成本较低，能够在大大提高细胞培养板的亲水能力，提高细胞贴壁率的同时实现产品灭菌，从而实现大规模生产。从而实现大规模生产。从而实现大规模生产。


技术研发人员：张胜有 谭伟红
受保护的技术使用者：苏州赛普生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/9/12