一种快速定量化学品氧化损伤能力的方法

1.本发明涉及化学品安全性评价技术领域，具体涉及一种定量化学品氧化损伤能力的方法，适用于化学品氧化损伤能力的定量分析和比较。


背景技术：

2.随着科学技术的快速发展，种类多达数以千万计的化学品被合成，对环境和人类健康产生巨大的潜在风险。化学品安全性评价已成为化学品设计、合成、生产、运输、使用和处置等过程中的重要内容。当前的化学品安全性评价方法多采用啮齿动物和鱼类等生物模型，这类方法常伴有费用高、时间长、效率低等特点，难以满足对化学品快速、大规模的安全性评价的需求。氧化损伤被认为是化学物产生毒性的主要的作用机制之一。化学品固有性质是产生氧化损伤的重要因素。巯基在稳定蛋白质的构象和保持蛋白质活性方面具有重要作用。巯基也是化学品产生氧化损伤的重要靶点。二硫苏糖醇(dtt)含有巯基，具有较强的还原能力，可与具有氧化性的化学品发生反应。因此，通过检测化学品对巯基的氧化作用，评价其氧化损伤能力。


技术实现要素：

3.鉴于现有技术中存在的问题，本发明提出一种快速定量化学品氧化损伤能力的方法。
4.本发明的技术方案是一种快速定量化学品氧化损伤能力的方法，包括如下步骤：
5.(1)称取一定质量的二硫苏糖醇(dtt)，用磷酸盐溶液(pbs，0.01～0.5m)充分溶解，配制成浓度为0.2～2mm的dtt工作液；
6.(2)称取一定质量的5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，用pbs充分溶解，配制成浓度为0.4～8mm的dtnb显色液(dtnb浓度大于或等于dtt浓度)；
7.(3)在0～500mg/l浓度区间，将待测化学品配制成若干个浓度梯度的化学品待测液，不加待测化学品的pbs作为空白对照组；
8.(4)将化学品待测液与dtt工作液混合；
9.(5)摇匀后，放入摇床中，在35～39℃条件下反应30～90min；
10.(6)反应结束后，收集所述步骤(5)中的反应液；若被测试物为颗粒物，反应液需用0.1～0.45μm的滤膜过滤；
11.(7)取所述步骤(6)中的反应液与dtnb按1:3～1:6的比例混合，混匀后静置5～15min；
12.(8)使用比色法，在412nm处测量各组吸光度，空白对照组吸光度记作od
0,
，化学品待测组依次记作od1、od2、
……
odn；
13.(9)dtt抑制率记作i(％)，
14.(10)以待测化学品浓度(mg/l)为横坐标，dtt抑制率i(％)为纵坐标，绘制化学品浓度—抑制率曲线；
15.(11)根据所述(11)中的曲线方程计算相同抑制率(ie)所对应的化学品浓度，记作ice；
16.(12)根据ice值大小比较不同化学品的氧化损伤能力。
17.本发明操作简单，使用的摇床、酶标仪或紫外-可见分光光度计是实验室常规仪器，且计算方法简便，不会对研究者的后续实验造成负担。特别地，利用酶标仪和微孔板可以快速、高通量检测与评价化学品的氧化损伤能力。适用于重金属、有机物、纳米颗粒和其它化学品氧化能力的体外定量分析。
附图说明
18.图1为实施例1过氧化氢浓度-抑制率logistic拟合(四参数)曲线：
19.a-测量1拟合曲线；b-测量2拟合曲线；c-测量3拟合曲线。
20.图2为实施例2重铬酸钾浓度-抑制率logistic拟合(四参数)曲线：
21.a-测量1拟合曲线；b-测量2拟合曲线；c-测量3拟合曲线。
22.图3为实施例3氧化石墨烯浓度-抑制率logistic拟合(四参数)曲线：
23.a-测量1拟合曲线；b-测量2拟合曲线；c-测量3拟合曲线。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
25.实施例1
26.(1)称取一定质量的dtt，用pbs充分溶解，配制成浓度为0.5mm的dtt工作液；
27.(2)称取一定质量的dtnb，用pbs充分溶解，配制成浓度为1mm的dtnb显色液；
28.(3)用pbs配制分别含0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25和50mg/l的h2o2待测液，分别记作待测液1、2、3、4、5、6和7组；
29.(4)量取3ml不同浓度的h2o2待测液，放入10ml的离心管或试管中，同时取3ml pbs溶液作为空白对照组(0组)；
30.(5)量取2ml dtt工作液放入(4)中的化学品待测液中；
31.(6)摇匀后，放入摇床中，在37℃条件下反应30min；
32.(7)取0.75ml(6)中的反应液加入到3.0ml的dtnb中，混匀后静置5min；
33.(8)使用酶标仪，在412nm处测量各组吸光度，空白对照组吸光度记作od
0,
，样品组分别记作od1、od2、od3、od4、od5、od6、od7；
34.(9)ddt吸光度抑制率记作i(％)，具体结果见表1；
35.(10)以样品浓度(mg/l)为横坐标，抑制率i(％)为纵坐标，采用logistic曲线拟合(四参数)法绘制化学品浓度—抑制率曲线，具体结果见图1；
36.(11)根据(10)中的曲线方程计算抑制率i＝10％时对应的化学品浓度，记作ic
10
；
37.由表2可知h2o2的ic
10
为10.770，重复测量后的标准差为0.482，变异系数为4.476％，重复性好。
38.表1实施例1过氧化氢(h2o2)对dtt的抑制率
[0039][0040]
表2实施例1重复测量三次过氧化氢(h2o2)的ic
10
[0041][0042]
实施例2
[0043]
(1)称取一定质量的dtt，用pbs充分溶解，配制成浓度为0.5mm的dtt工作液；
[0044]
(2)称取一定质量的dtnb，用pbs充分溶解，配制成浓度为1mm的dtnb显色液；
[0045]
(3)用pbs配制分别含4.42、8.84、17.68、35.36、70.72、141.44和282.88mg/l的重铬酸钾待测液，分别记作待测液1、2、3、4、5、6和7组；(4)量取3ml不同浓度的重铬酸钾待测液，放入10ml的离心管或试管中，同时取3ml pbs溶液作为空白对照组(0组)；(5)量取2ml dtt工作液放入(4)中的化学品待测液中；(6)摇匀后，放入摇床中，在35℃条件下反应30min；(7)取0.75ml(6)中的反应液加入到3.0ml的dtnb中，混匀后静置5min；(8)使用酶标仪，在412nm处测量各组吸光度，空白对照组吸光度记作od
0,
，样品组分别记作od1、od2、od3、od4、od5、od6、od7；
[0046]
(9)ddt吸光度抑制率记作i(％)，结果见表3；
[0047]
(10)以样品浓度(mg/l)为横坐标，抑制率i(％)为纵坐标，采用logistic曲线拟合
(四参数)法绘制化学品浓度—抑制率曲线，结果见图2；(11)根据(11)中的曲线方程计算抑制率i＝10％时对应的化学品浓度，记作ic
10
；
[0048]
由表4可知重铬酸钾的ic
10
为24.753，重复测量后的标准差为0.716，变异系数为2.894％，重复性好。
[0049]
表3实施例2重铬酸钾(k2cr2o7)对dtt的抑制率
[0050][0051][0052]
表4实施例2重复测量三次重铬酸钾(k2cr2o7)的ic
10
[0053][0054]
实施例3
[0055]
(1)称取一定质量的dtt，用pbs充分溶解，配制成浓度为0.5mm的dtt工作液；
[0056]
(2)称取一定质量的dtnb，用pbs充分溶解，配制成浓度为1mm的dtnb显色液；
[0057]
(3)用pbs配制分别含0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25和50mg/l的氧化石墨烯待测液，分别记作待测液1、2、3、4、5、6和7组；
[0058]
(4)量取3ml不同浓度的氧化石墨烯待测液，放入10ml的离心管或试管中，同时取3ml pbs溶液作为空白对照组(0组)；
[0059]
(5)量取2ml dtt工作液放入(4)中的化学品待测液中；
[0060]
(6)摇匀后，放入摇床中，在39℃条件下反应30min；
[0061]
(7)反应结束后，将(6)中的反应液经0.22μm过滤头过滤，保留过滤液；
[0062]
(8)取0.75ml(7)中的过滤液加入到3.0ml的dtnb中，混匀后静置5min；
[0063]
(9)使用酶标仪，在412nm处测量各组吸光度，空白对照组吸光度记作od
0,
，样品组分别记作od1、od2、od3、od4、od5、od6、od7；
[0064]
(10)ddt吸光度抑制率记作i(％)，结果见表5；
[0065]
(11)以样品浓度(mg/l)为横坐标，抑制率i(％)为纵坐标，采用logistic曲线拟合(四参数)法绘制化学品浓度—抑制率曲线，结果见图3；
[0066]
(12)根据(11)中的曲线方程计算抑制率i＝10％时对应的化学品浓度，记作ic
10
；
[0067]
由表6可知氧化石墨烯的ic
10
为6.458，重复测量后的标准差为0.170，变异系数为2.629％，重复性好。
[0068]
表5实施例3氧化石墨烯(go)对dtt的抑制率
[0069][0070]
表6实施例3重复测量三次氧化石墨烯(go)的ic
10
[0071]
[0072]
表7实施例4-7的主要工艺条件
[0073][0074][0075]
上述实施例4、5、7中其他条件同参照实施例1，实施例6中其他条件参照实施例2。
[0076]
本发明利用酶标仪和微孔板可以快速、高通量检测与评价化学品的氧化损伤能力，满足重金属、有机物、纳米颗粒和其它化学品氧化能力的体外定量分析。

技术特征：
1.一种快速定量化学品氧化损伤能力的方法，其特征在于如下步骤：(1)称取二硫苏糖醇(dtt)，用磷酸盐溶液(pbs)充分溶解，配制成浓度为0.2～2mm的dtt工作液；(2)称取5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，用pbs充分溶解，配制成浓度为0.4～8mm的dtnb显色液；(3)在0～500mg/l浓度区间，将待测化学品配制成若干个浓度梯度的化学品待测液，不加待测化学品的pbs作为空白对照组；(4)将化学品待测液与dtt工作液混合；(5)摇匀后，放入摇床中，在35～39℃条件下反应，反应结束后，得到反应液；(6)收集所述步骤(5)中的反应液；若被测试物为颗粒物，反应液用滤膜过滤；(7)取所述步骤(6)中的反应液与dtnb按1:3～1:6的比例混合，混匀后静置；(8)使用比色法，在412nm处测量各组吸光度，空白对照组吸光度记作od0，化学品待测组依次记作od1、od2、
……
od
n
；(9)dtt抑制率记作i(％)，(10)以待测化学品浓度(mg/l)为横坐标，dtt抑制率i(％)为纵坐标，绘制化学品浓度-抑制率曲线；(11)根据所述(10)中的化学品浓度-抑制率曲线得到的曲线方程计算相同抑制率(i
e
)所对应的化学品浓度，记作ic
e
；(12)根据ic
e
值大小比较不同化学品的氧化损伤能力；所述dtnb显色液浓度大于或等于dtt工作液浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，dtt溶剂为0.01～1m的pbs。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，dtnb显色液溶剂为0.01～1m的pbs。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待测化学品浓度梯度设为5～7个。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在摇床连续摇晃，反应30～90min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用0.1～0.45μm的滤膜和滤头。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，过滤液和dtnb混合反应时间为5～15min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用比色法，实验仪器是酶标仪或紫外-可见分光光度计，在412nm处测量各组吸光度，空白对照组吸光度记作od
0,
，样品组分别记作od1、od2、
……
od
n
。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据ic
z
值大小比较不同化学品的氧化损伤能力，ic
z
是ic5、ic
10
、ic
15
、ic
25
和ic
50
。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ic
e
使用ic
10
。

技术总结
本发明涉及一种快速定量化学品氧化损伤能力的方法。所述方法包括以下步骤：用磷酸盐溶液配制DTT工作液；用磷酸盐溶液配制DTNB显色液；在0～500mg/L浓度区间，将待测化学品配制成若干个浓度梯度的待测液；将DTT工作液放入化学品待测液中；混匀后，放入摇床中反应，结束后，将反应液加入到DTNB中；混匀后，在412nm处测量吸光度，空白对照组吸光度记作OD0，DDT吸光度抑制率记作I(％)，绘制化学品浓度—抑制率曲线。根据IC


技术研发人员：陈玉明 米星洁 袁鹏 倪天军
受保护的技术使用者：新乡医学院
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/9/12