一种棒杆菌中基因多拷贝整合方法

1.本发明涉及一种棒杆菌中基因多拷贝整合方法，具体涉及一种在谷氨酸棒杆菌等棒杆菌中进行基因多拷贝整合的方法，属于基因工程领域。


背景技术：

2.谷氨酸棒状杆菌是目前白色生物技术的产业支柱，是公认的安全发酵菌株，它被广泛应用于有机酸、氨基酸及其衍生物的生产。随着基因操作方法的发展，代谢工程和合成生物学领域取得了重大进展，微生物中的同源和异源dna可以被操控。同时，优化限速基因的过表达和防止中间代谢产物积累是引导更多的碳流进入生物合成途径的必要步骤。为了实现这一目标，基于质粒的过表达因其易于操作和可调控的表达而被广泛应用。然而，这种策略受到由分离不稳定性、结构不稳定性和等位基因分离导致的质粒遗传不稳定性的影响。此外，为了维持质粒在宿主细胞中的存在，就会使用抗生素或其他选择性试剂，这增加了总的生物过程成本并产生了环境问题。而将靶基因整合到宿主染色体中是克服基于质粒过表达的缺点的优选策略。
3.在大肠杆菌中，经常使用同源重组、位点特异性重组和转座子介导的基因转座来实现染色体整合。然而，整合到染色体上的基因只有一个拷贝，通常无法达到多拷贝质粒上基因的表达效果。于是人们开始探索在大肠杆菌染色体上进行基因多拷贝整合的方法，例如：化学诱导的染色体进化方法。该方法是基于邻近的非等位基因的同源交换并通过抗生素筛选来获得多拷贝整合的菌株，并通过敲除reca来稳定拷贝数。在谷氨酸棒杆菌中，人们也开始探索在染色体上进行基因多拷贝整合的方法。例如：研究人员通过rece/rect将基因olulcy整合在16s rrna后，通过抗生素和颜色来筛选多拷贝菌株，最后通过cre酶去除抗性基因，最终实现了olulcy基因在染色体上的5个拷贝整合。
4.通常，棒杆菌高产菌都是用多拷贝质粒来表达关键基因，并使用抗生素作为维持质粒的选择标记，但是抗生素的使用无疑会增加生产的成本和后期产物分离的难度。而在染色体上实现目标基因的多拷贝整合不仅能维持目标基因的稳定存在，还无需使用抗生素等筛选试剂。因此，开发棒杆菌染色体上的基因多拷贝整合的新方法对于实现棒杆菌中外源基因的稳定表达及商业化生产有着重要的意义。


技术实现要素：

5.技术问题：谷氨酸棒状杆菌中的质粒表达系统存在稳定性问题以及抗生素的使用问题，因此如何通过在谷氨酸棒杆菌染色体上进行目的/外源基因多拷贝的整合是一个重要的技术问题。
6.整体技术方案：在谷氨酸棒杆菌染色体中，除16s rrna外，还存在其他的多拷贝基因，其中is转座子家族中的iscg1有8个拷贝，且它是可以被敲除的。因此本专利选择iscg1作为在谷氨酸棒杆菌中进行基因多拷贝整合的靶标。先构建携带iscg1的上半部分、目的/外源基因表达框、kan盒、iscg1的下半部分的pbs自杀质粒，通过不断进行整合质粒的转化
及提高的卡那霉素筛选压力将多个目的/外源基因表达框整合在染色体的多个iscg1位点上。
7.本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌多拷贝整合质粒，所述整合质粒由iscg1的上下游同源臂、筛选标记基因、目的基因表达框组成；目的基因表达框和筛选标记表达盒位于iscg1的上游同源臂和iscg1的下游同源臂之间。
8.在一种实施方式中，所述整合质粒按照iscg1的上游同源臂、目的基因表达框、筛选标记表达盒、iscg1的下游同源臂的顺序连接，或者，按照iscg1的上游同源臂、筛选标记表达盒、目的基因表达框、iscg1的下游同源臂的顺序连接。
9.在一种实施方式中，所述目的基因表达框包括启动子和目的基因。
10.在一种实施方式中，所述启动子用于启动目的基因的表达。
11.在一种实施方式中，所述启动子包括p
brnfe
d5。
12.在一种实施方式中，所述p
brnfe
d5公开于公开号为cn 114480466a的中国专利申请文件。
13.在一种实施方式中，所述筛选标记表达盒包括内源性启动子和筛选标记基因。
14.在一种实施方式中，所述内源性启动子选自p
dapa-b27
或p
dapa-c5
。
15.在一种实施方式中，所述内源性启动子为p
dapa-c5
。
16.在一种实施方式中，所述内源性启动子p
dapa-c5
的核苷酸序列如seq id no.1所示。
17.在一种实施方式中，所述筛选标记基因包括抗生素抗性基因。
18.在一种实施方式中，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素、氯霉素、链霉素或壮观霉素。
19.本发明的第二个目的是提供含有上述多拷贝整合质粒的谷氨酸棒杆菌。
20.本发明第三个目的是提供一种在谷氨酸棒杆菌染色体上进行多拷贝整合的方法，所述方法为，将上述质粒转化至谷氨酸棒杆菌，培养1～2h，接种至含一定浓度的抗生素的培养基中，培养40-50h，完成一轮转化，再将上一轮转化获得的谷氨酸棒杆菌制备成感受态，依次共进行10轮转化，在每轮转化中不断提高抗生素的浓度，将第10轮转化获得的谷氨酸棒杆菌菌液稀释105后涂布在含5g/l抗生素的培养基中，筛选得到多拷贝整合目的基因的谷氨酸棒杆菌。
21.在一种实施方式中，10轮转化中的抗生素的浓度依次为30mg/l、60mg/l、120mg/l、250mg/l、500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l。
22.在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为含有iscg1的谷氨酸棒杆菌。
23.在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌包括atcc13032和保藏编号为cctcc no:m2014410的谷氨酸棒杆菌sn01。
24.在一种实施方式中，所述抗生素选自卡那霉素、氯霉素、链霉素或壮观霉素。
25.本发明提供了上述谷氨酸棒杆菌多拷贝整合质粒在构建及筛选高拷贝整合目的基因的谷氨酸棒杆菌中的应用。
26.本发明提供了上述谷氨酸棒杆菌多拷贝整合质粒在谷氨酸棒杆菌过表达外源基因中的应用。
27.在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为含有iscg1的谷氨酸棒杆菌。
28.在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌包括atcc13032和保藏编号为cctcc no:
m2014410的谷氨酸棒杆菌sn01。
29.本发明提供了一株产4-hil的谷氨酸棒杆菌工程菌，以谷氨酸棒杆菌sn01为宿主，多拷贝整合外源基因idom。
30.本发明提供了上述谷氨酸棒杆菌工程菌在制备4-hil中的应用。
31.有益效果：
32.本发明提供了一种基于自杀质粒同源重组的基因多拷贝整合系统，基于iscg1基因在谷氨酸棒杆菌有8个拷贝，通过不断进行整合质粒的转化及提高的卡那霉素筛选压力将多个目的/外源基因表达框整合在染色体上，整合质粒以pbluescript ii sk(-)为骨架，携带iscg1的上下游同源臂、筛选标记基因、目的基因表达框。其中，所述筛选标记表达盒包括内源性启动子p
dapa-b27
或p
dapa-c5
和筛选标记基因，通过内源性启动子p
dapa-b27
或p
dapa-c5
表达筛选标记基因，通过弱启动子降低菌株对抗生素的耐受性，从而提高目的菌株的筛选效率；最后经过10轮进化，得到了4-hil产量为43.7mm的scm12菌株，为单拷贝菌株的2.95倍。
附图说明
33.图1为整合质粒pbs-δiscg1::idom的构建图谱。
34.图2为整合质粒pbs-δiscg1::p
dapa-n-kan-idom的构建图谱。
35.图3为基因多拷贝整合系统的操作流程。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
38.下述实施例中通过以谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种c.glutamicum ssp.lactofermentum sn01和目的/外源基因idom为例，通过本发明提供的基因多拷贝整合系统制备高产4-羟基异亮氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员可以在本发明提供的方案的基础之上，根据需求自行选择含有iscg1的谷氨酸棒杆菌和目的/外源基因。
39.谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种c.glutamicum ssp.lactofermentum sn01已公布于文献4-hydroxyisoleucine production of recombinant corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum under optimal corn steep liquor limitation中，公开于2015年，保藏编号为cctcc no:m 2014410。
40.pdtw202质粒：已公开于文献hu j,tany,liy,hu x,xu d,wangx.construction and application ofan efficient multiple-gene-deletion system in corynebacterium glutamicum.plasmid.2013nov；70(3):303-13.doi:10.1016/j.plasmid.2013.07.001.epub 2013jul 13.中。
41.pbs质粒：即pbluescript ii sk(-)，购自stratagene。
42.pil-d5im
质粒：以质粒pil-d5iu
为模板(公开于公开号为cn 114480466a的中国专利申请文件和论文appl microbiol biotechnol,2022,106(13-16):5105-5121)，用引物对
lrp-f/ido
u-cys-r、ido
u-cys-f/ido
u-r分别扩增lrp-p
brnfe
d5-idou上、下两部分，通过重叠pcr连接上、下两部分，得到lrp-p
brnfe
d5-idom片段；然后将该片段插入pjyw5表达载体中，得到pil-d5im
质粒。
43.表1构建pil-d5im
质粒的引物
[0044][0045]
lbb培养基：酵母提取物2.5g/l，氯化钠5g/l，蛋白胨5g/l，脑心浸液18.5g/l。
[0046]
lbk固体培养基：酵母提取物2.5g/l，氯化钠5g/l，蛋白胨5g/l，卡那霉素30mg/l。
[0047]
实施例1携带外源基因的整合质粒pbs-δiscg1::idom的构建
[0048]
以谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种sn01的基因组dna为模板，用引物对iscg1-f/iscg1-r扩增得到iscg1(3)片段；再以iscg1(3)片段为模板，用引物对iscg1-u-f/iscg1-u-r、iscg1-d-f/iscg1-d-r引物扩增上下游同源臂片段；以pdtw202为模板，用引物对loxp-kan-f/loxp-kan-r扩增kan盒。利用重叠pcr将上游同源臂片段、kan盒、下游同源臂片段连接起来，使用一步克隆试剂盒将重叠的片段连接到用salⅰ处理的pbs质粒上，在含卡那霉素的lbk平板上，得到pbs-δiscg1质粒。
[0049]
再以携带外源基因idom的质粒pil-d5im
为模板，用引物对ido
m-f/ido
m-r扩增p
brnfe
d5-idom片段，使用一步克隆试剂盒将p
brnfe
d5-idom片段连接到经salⅰ酶切的pbs-δiscg1线性化载体上，在含卡那霉素的lbk平板上进行筛选。最终通过质粒pcr和测序验证获得pbs-δiscg1::idom质粒(图1)。
[0050]
iscg1-f(5
’‑3’
)cgtagaaaacgtgctggacaa；
[0051]
iscg1-r(5
’‑3’
)ctcctcagagaagaagtaacag；
[0052]
iscg1-u-f(5
’‑3’
)gtaccgggccccccctcgagtggggtacatcacagaacct；
[0053]
iscg1-u-r(5
’‑3’
)cgccctatagtgagtcgtattgtcgactgggacgacatctaataacc；
[0054]
iscg1-d-f(5
’‑3’
)ctttagtgagggttaattgcgctcgtagtgctgatgctttac；
[0055]
iscg1-d-r(5
’‑3’
)tatcaagcttatcgataccgtgcattgatcttatggacc；
[0056]
loxp-kan-f(5
’‑3’
)aatacgactcactatagggcg；
[0057]
loxp-kan-r(5
’‑3’
)gcgcaattaaccctcactaaag；
[0058]
idom-f(5
’‑3’
)ggttattagatgtcgtcccacagccagtgcgagatttgag；
[0059]
idom-r(5
’‑3’
)cgccctatagtgagtcgtattcgcacgtcatctagcggaat。
[0060]
实施例2质粒pbs-δiscg1::p
dapa-n-kan-idom(n＝b27，c5)的构建
[0061]
以实施例1构建的pbs-δiscg1::idom质粒为模板，用引物kan-f/kan-r扩增全质粒片段，以c.glutamicum sn01的基因组dna为模板，用引物对p
dapa-f/b27-r、p
dapa-f/c5-r扩增得到内源性启动子p
dapa-b27
、p
dapa-c5
，最后使用一步克隆试剂盒将p
dapa-b27
、p
dapa-c5
连接到全质粒片段上，将连接液转入jm109细胞，在含卡那霉素的lbk平板上进行筛选，最终通过质粒pcr测序和测序验证获得正确的kan的启动子替换为p
dapa-b27
和p
dapa-c5
的质粒pbs-δiscg1::p
dapa-b27-kan-idom和pbs-δiscg1::p
dapa-c5-kan-idom(图2)。
[0062]
kan-f(5
’‑3’
)cgcatgattgaacaagatgg；
[0063]
kan-r(5
’‑3’
)cgttttcccttgtccagata；
[0064]
pdapa-f(5
’‑3’
)ctggacaagggaaaacggtggcttgggcgattgttat；
[0065]
b27-r(5
’‑3’
)ccatcttgttcaatcatagagttcatggtttccttcttccctcatttgggggtt；
[0066]
c5-r(5
’‑3’
)ccatcttgttcaatcatagagttcaaggttacaatcttccctcatttgggggtt。
[0067]
将构建的质粒pbs-δiscg1::idom、pbs-δiscg1::p
dapa-b27-kan-idom和pbs-δiscg1::p
dapa-c5-kan-idom分别转化至大肠杆菌jm109，并分别涂布于含有1000mg/l、500mg/l、250mg/l、125mg/l、62.5mg/l、31.25mg/l卡那霉素的lbk液体培养基中，结果显示，将pbs-δiscg1::idom质粒的中kan的启动子替换为p
dapa-b27
和p
dapa-c5
后，jm109对卡那霉素的耐受性从1000mg/l降低到500mg/l和125mg/l。这说明通过替换弱启动子，jm109对卡那霉素的耐受性的确下降了。
[0068]
实施例3目的基因多拷贝整合菌株的进化和筛选
[0069]
首先，将谷氨酸棒杆菌sn01制备成感受态细胞，将实施例2构建的pbs-δiscg1::p
dapa-c5-kan-idom质粒电转入感受态细胞中，30℃，200rpm培养约2h后，接种于含30mg/l卡那霉素的lbb液体培养基中，在30℃培养48h后，再次制备成感受态细胞，再将pbs-δiscg1::p
dapa-c5-kan-idom质粒电转入感受态细胞中，细胞在30℃，200rpm培养约2h后，接种于含60mg/l的卡那霉素lbb液体培养基中，再次培养并制备成感受态细胞，如此循环往复，通过不断提高卡那霉素的浓度(30mg/l、60mg/l、120mg/l、250mg/l、500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l)，直至3000mg/l，30℃，200rpm培养约2h后，将菌液稀释105后涂布在最高浓度5g/l卡那霉素浓度梯度lbk平板上，筛选高抗性菌株(图3)。
[0070]
最终经过10轮的进化，在最高浓度5g/l卡那霉素浓度梯度平板上挑取了28株菌，并在24孔板内进行初步的发酵验证。挑选出产量较高的4株菌在摇瓶上进行发酵验证。
[0071]
经过120h的发酵，28株进化菌株与idom单拷贝整合菌株相比，4-hil产量均有所提升，其中scm07、scm08、scm10、scm12的产量相对较高，达到了13.5mm以上，与idom单拷贝整合菌株的4.5mm相比提高了约2倍。在摇瓶发酵进行进一步验证，scm12的4-hil产量最高，为43.7mm，是idom单拷贝整合菌株的2.95倍。经过检测，scm12上成功整合有3个拷贝的idom。
[0072]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种谷氨酸棒杆菌多拷贝整合质粒，其特征在于，所述整合质粒由iscg1的上下游同源臂、筛选标记基因、目的基因表达框组成；目的基因表达框和筛选标记表达盒位于iscg1的上游同源臂和iscg1的下游同源臂之间；所述目的基因表达框包括启动子和目的基因；所述筛选标记表达盒包括内源性启动子和筛选标记基因。2.根据权利要求1所述的多拷贝整合质粒，其特征在于，所述内源性启动子选自p
dapa-b27
或p
dapa-c5
。3.根据权利要求1所述的多拷贝整合质粒，其特征在于，所述筛选标记基因包括抗生素抗性基因。4.根据权利要求3所述的多拷贝整合质粒，其特征在于，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素、氯霉素、链霉素或壮观霉素抗性基因。5.含有权利要求1～4任一所述多拷贝整合质粒的谷氨酸棒杆菌。6.一种在谷氨酸棒杆菌染色体上进行多拷贝整合的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～4任一所述多拷贝整合质粒转化至谷氨酸棒杆菌，培养1～2h，接种至含一定浓度的抗生素的培养基中，培养40-50h，完成一轮转化，再将上一轮转化获得的谷氨酸棒杆菌制备成感受态细胞，依次共进行10轮转化，在每轮转化中不断提高抗生素的浓度，将第10轮转化获得的谷氨酸棒杆菌菌液稀释105后涂布在含5g/l抗生素的培养基中，筛选得到多拷贝整合目的基因的谷氨酸棒杆菌；10轮转化中的抗生素的浓度依次为30mg/l、60mg/l、120mg/l、250mg/l、500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗生素选自卡那霉素、氯霉素、链霉素或壮观霉素。8.权利要求1～4任一所述多拷贝整合质粒在构建及筛选高拷贝整合目的基因的谷氨酸棒杆菌、或在谷氨酸棒杆菌过表达外源基因中的应用。9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为含有iscg1的谷氨酸棒杆菌。10.一株产4-hil的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌sn01为宿主，多拷贝整合外源基因ido
m
。

技术总结
本发明公开了一种棒杆菌中基因多拷贝整合方法，具体涉及一种在谷氨酸棒杆菌等棒杆菌中进行基因多拷贝整合的方法，属于基因工程领域。本发明提供的多拷贝整合系统是基于IScg1基因在谷氨酸棒杆菌有8个拷贝，通过不断进行整合质粒的转化及逐步提高的筛选压力将多个目的/外源基因表达框整合在染色体上，最后经过10轮进化，成功构建多拷贝整合目的基因的重组菌株。本发明提供的整合质粒以pBlueScript IISK(-)为骨架，携带IScg1的上下游同源臂、筛选标记基因、目的基因表达框。其中，所述筛选标记表达盒包括内源性启动子和筛选标记基因，通过弱启动子降低菌株对抗生素的耐受性，从而提高目的菌株的筛选效率，为谷氨酸棒杆菌基因多拷贝整合提供了新的思路。拷贝整合提供了新的思路。拷贝整合提供了新的思路。


技术研发人员：史锋 陈睿 李永富
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/9/14