一种多肽在诊断肺癌中的应用的制作方法

1.本发明涉及体外诊断及蛋白检测技术领域，具体涉及多肽在诊断肺癌或者制备诊断肺癌的产品中的应用。


背景技术：

2.癌症的预后和癌症发展阶段紧密相关。例如，非小细胞肺癌若在早期发现，通过手术切除可提供良好的预后。小的局部肿瘤(i期)的5年生存率为70-90％。然而，大多数患者(约75％)在诊断时(iii/iv期)已为晚期，尽管近年来晚期肺癌的肿瘤学管理取得了重大进展，但生存率仍然很低。小细胞肺癌比非小细胞肺癌更具侵袭性，预后更差，总体5年生存率约为5％。90％以上的患者存在局部晚期或远处转移(iii/iv期)，根治性治疗的窗口很窄。但在极少数情况下，患者被确定为i期疾病，手术仍然是有益的。一项研究报告，小细胞肺癌单独切除的5年生存率为40％，辅助化疗或放疗为52％。因此，在癌症发生的早期阶段诊断出来可以实现治愈性治疗，是提高生存率最有效的途径。当前，低剂量计算机断层扫描(ldct)是肺癌筛查的首选方式。国外一项研究表明，ldct筛查具有较好的肺癌早筛潜力，可降低肺癌高危人群的死亡率。但是，ldct存在较高的假阳性率，一定程度上会导致过度诊断、侵入性诊断，还存在放射线可能对人体造成潜在健康危害的问题。因此，发现用于早期癌症诊断的非侵入性、无创血清学标记物将大大有利于癌症的预防及提早治疗。采用基于生物标志物的初始筛选后进行常规标准筛查或将生物标志物测试与常规标准筛查方法相结合将成为更好的癌症诊断手段。


技术实现要素：

3.本发明的第一方面，提供了一种多肽在制备诊断或辅助诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，所述的多肽包括seq id no：1或2。
4.本发明的第二方面，提供了结合多肽的自身抗体作为标志物在制备诊断或辅助诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，所述的多肽包括seq id no：1或2。
5.优选的，所述的多肽长度为15-30aa，优选15-20aa。例如可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa。
6.优选的，所述的多肽可以包含修饰或标记，例如生物素等。
7.优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估肺癌包括利用多肽检测自身抗体。优选为检测自身抗体的存在或含量。优选为检测血清或血浆中的自身抗体。
8.优选的，所述的自身抗体为lgg和/或lga。
9.优选的，所述诊断或辅助诊断或预后评估的对象可以为人或非人动物。
10.优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估肺癌包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
11.具体为将多肽包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人iga花青染料(cy5)标记的二抗或者抗人igg花青染料(cy3)标记)，检测标记物的信号分子
强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与与多肽结合的自身抗体的量呈正相关。
12.优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
13.优选的，所述的产品包括多肽和固相载体；
14.优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合；
15.进一步优选的，所述的产品为试剂盒或芯片。
16.优选的，所述的产品还包含试剂，例如有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
17.优选的，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌中的一种或两种以上的组合。
18.本发明的第三方面，提供了一种多肽，所述的多肽包括seq id no：1或2。
19.优选的，所述的多肽长度为15-30aa，优选15-20aa。例如可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa。
20.优选的，所述的多肽为seq id no：1或2。
21.优选的，所述的多肽可以包含修饰或标记，例如生物素等。
22.优选的，所述的多肽可以与自身抗体结合。进一步优选与肺癌患者(例如血清或血浆)中的自身抗体结合。
23.优选的，所述的多肽可以用于检测自身抗体。
24.优选的，所述的多肽可以用于诊断或辅助诊断或预后评估肺癌。
25.优选的，所述的多肽或结合多肽的自身抗体可以作为肺癌诊断或辅助诊断或预后评估的标志物。例如检测结合多肽的自身抗体的有无或含量可以评价肺癌。所述的评价例如诊断、辅助诊断、预后评估或临床分型。
26.所述的多肽可以采用现有技术常规的方法进行制备。例如化学合成或者原核或真核表达等等。
27.本发明的第四方面，提供了一种编码上述多肽的核酸。
28.本发明的第五方面，提供了一种包含上述核酸的载体。
29.本发明的第六方面，提供了一种包含上述核酸或上述载体的细胞。
30.本发明的第七方面，提供了一种试剂盒或芯片，所述的试剂盒或芯片包含上述的多肽、核酸、载体或细胞。
31.优选的，所述的多肽包含修饰或标记，例如生物素。
32.优选的，所述的试剂盒或芯片还包含固相载体。
33.优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合。
34.优选的，所述的试剂盒或芯片还包括试剂，所述的试剂例如有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
35.本发明的第八方面，提供了一种试剂盒或芯片的制备方法，所述的制备方法包括将上述的多肽包被在固相载体上。
36.优选的，所述的包被可以为直接包被法和间接包被法。所述的直接包被法是将多
肽直接固定于固相载体上，间接包被法是通过先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白(bsa)等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
37.本发明的第九方面，提供了一种肺癌的生物标志物，所述的肺癌的生物标志物为多肽或结合上述多肽的自身抗体。
38.优选的，所述的自身抗体为lgg和/或lga。
39.优选的，所述的自身抗体来源于血清或血浆。
40.本发明的第十方面，提供了一种检测自身抗体的方法，所述的方法包括使用上述的多肽或上述的试剂盒或芯片。
41.优选的，包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
42.具体为将多肽包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人iga花青染料(cy5)标记的二抗或者抗人igg花青染料(cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与与多肽结合的自身抗体的量呈正相关。
43.优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
44.本发明的第十一方面，提供了一种肺癌的诊断方法，所述的诊断方法包括使用上述的多肽或上述的试剂盒或芯片。
45.优选的，包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
46.具体为将多肽包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人iga花青染料(cy5)标记的二抗或者抗人igg花青染料(cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与与多肽结合的自身抗体的量呈正相关。
47.优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
48.本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。所述诊断的对象可以为人或非人动物，其中，所述的非人动物优选为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
49.本发明所述的“辅助诊断”是指包括本技术的方法以及现有技术中常规的方法或步骤。
50.本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
51.本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
附图说明
52.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
53.图1：血浆中结合多肽p003的igg型自身抗体的表达水平，其中，snr为信噪比，n是健康人，lc是肺癌患者，ec是食管癌患者，gc是胃癌患者，dc是其他7种癌症患者。
54.图2：血浆中结合多肽p003的lga型自身抗体的表达水平，其中，snr为信噪比，n是健康人，lc是肺癌患者，ec是食管癌患者，gc是胃癌患者，dc是其他7种癌症患者。
55.图3：血浆中结合多肽p004的lgg型自身抗体的表达水平，其中，snr为信噪比，n是健康人，lc是肺癌患者，ec是食管癌患者，gc是胃癌患者，dc是其他7种癌症患者。
56.图4：血浆中结合多肽p004的lga型自身抗体的表达水平，其中，snr为信噪比，n是健康人，lc是肺癌患者，ec是食管癌患者，gc是胃癌患者，dc是其他7种癌症患者。
57.图5：肺癌患者与健康组的针对多肽p003的iga型自身抗体roc曲线。
具体实施方式
58.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
59.实施例中使用的试剂配方如下：
60.磷酸盐缓冲液(pbs)：137mm nacl、2.7mm kcl、10mm na2hpo4、2mm kh2po4，ph 7.4。
61.洗涤缓冲液(pbst)：ph7.4的1
×
pbst。
62.封闭缓冲液：含5％bsa的1
×
pbst。
63.实施例1
64.1、筛选出的多肽p003以及对照多肽p004序列见表1。
65.表1：多肽序列
66.编号seq id no：xp53多肽序列位置信息p0031e-p-p-l-s-q-e-t-f-s-d-l-w-k-l11-25p0042q-e-t-f-s-d-l-w-k-l-l-p-e-n-n16-30
67.2、临床样本见表2。
68.表2：临床样本
[0069][0070]
表3：肺腺癌样本患者情况
[0071][0072][0073]
表4：肺鳞状细胞癌样本患者情况
[0074][0075][0076]
表5：大细胞肺癌样本患者情况
[0077][0078]
表6：小细胞肺癌样本患者情况
[0079][0080]
[0081]
表7：正常体检样本患者情况
[0082][0083][0084]
3、检测步骤
[0085]
1)p53多肽阵列打印：用pbs将表1中p53多肽稀释，然后使用arrayjet微阵列点样仪将p53多肽重复四次打印到载玻片表面，制备的p53多肽微阵列存放在-20℃直至准备使用；
[0086]
2)复温：将p53多肽载玻片从-20℃冰箱取出平衡至室温；
[0087]
3)封闭：将p53多肽载玻片组装到孵育托盘中，加入400μl封闭缓冲液，室温放置1h，轻轻摇晃；
[0088]
4)血清样本制备：4℃解冻血清样品，14,000
×
g离心10min。以1:100的比例将4μl血清加入到400μl封闭缓冲液中制得血清样本；
[0089]
5)加入血清样本：去除封闭缓冲液，加入400μl稀释的血清，然后室温孵育2.5h，轻轻摇动；孵育完成后，用400μl pbst清洗载玻片3次，每次10分钟；
[0090]
6)加荧光标记抗体：采用封闭缓冲液稀释二抗(工作浓度为4μg/ml)。加入400μl稀释的二抗，室温孵育1h，轻轻摇动。用400μl pbst清洗载玻片3次，每次清洗10分钟，再用400μl蒸馏水清洗载玻片两次，每次清洗2分钟；
[0091]
7)干燥载玻片：除去剩余的液体，用真空泵或移液管排空孵育托盘，然后干燥载玻片；
[0092]
8)上机读数：使用genepix 4300a微阵列扫描仪在532nm或635nm波长下扫描所有阵列。使用genepix pro7软件提取荧光信号强度的中值，并保存数据。
[0093]
4、试验结果
[0094]
结合表1中p003或p004多肽的自身抗体表达水平结果见图1-4及表8。具体的，结合多肽的自身抗体在肺癌患者和健康对照组具有显著统计学差异，代表其可以作为肺癌的特异性标志物。
[0095]
表8：示例性的几种多肽在不同癌症中的表达水平显著性
[0096][0097]
另外，肺癌患者与健康组的结合多肽的自身抗体roc分析结果见图5。具体的：
[0098]
对于lga型自身抗体，多肽p003的auc为0.6752。多肽p003，根据约登指数确定cutoff值为1.234时，特异度为73.68％，灵敏度为61.36％。
[0099]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0100]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

技术特征：
1.多肽在制备诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，其特征在于，所述的多肽包括seq id no：1。2.结合多肽的自身抗体作为标志物在制备诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，其特征在于，所述的多肽包括seq id no：1。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的多肽长度为15-30aa。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后评估肺癌包括利用多肽检测自身抗体；优选为检测自身抗体的存在或含量；优选为检测血清或血浆中的自身抗体。5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌中的一种或两种以上的组合。6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述的产品包括多肽和固相载体；优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合；进一步优选的，所述的产品为试剂盒或芯片。7.一种多肽，其特征在于，所述的多肽包括seq id no：1。8.一种试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片包含权利要求7所述的多肽。9.根据权利要求8所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片还包含固相载体；优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合。10.一种检测自身抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括使用权利要求7所述的多肽或权利要求8-9任一所述的试剂盒或芯片。

技术总结
本发明涉及体外诊断及蛋白检测技术领域，具体提供了一种多肽在诊断肺癌中的应用，结合本申请所述多肽的自身抗体可以作为肺癌的诊断标志物，并经实验证实特异度和灵敏度很高。并经实验证实特异度和灵敏度很高。并经实验证实特异度和灵敏度很高。


技术研发人员：王红叶 李永哲 韩晓红 姚林
受保护的技术使用者：医灵（北京）生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/9/14